Sampel bahan tanaman diambil dari daerah Kota Medan,Kabupaten Langkat, Deli Serdang dan Karo, Provinsi Sumatera Utara. Sampel varietas toleran kekeringan diambil dari kebun koleksi PT. Perkebunan Nusantara IIyaitu kebun koleksi Risbang Tebu Sunggal dan Tanjung Jati. Selanjutnya isolasi DNAdilaksanakan di Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara. Kegiatan penelitian dilaksanakan bulan April- Oktober 2014.
Bahan dan Alat Bahan tanaman
Bahan tanamanmerupakan aksesi tebu yang diambil dari beberapa lokasi di Sumatera Utara. Profil 30 aksesi tebu terdapat pada Lampiran 6.
Tabel 2. Bahan tanamandan lokasi pengambilan sampel
Kode Aksesi Lokasi
(Desa,Kec) Kabupaten Lintang Bujur Ketinggian
1 PS 864 Tanjung Jati Binjai Langkat 03°37’35.0” 98°27’05.5” 39 2 PSJT 941 Tanjung Jati Binjai Langkat 03°37’35.8” 98°27’05.6” 34 3 PS 851 Tanjung Jati Binjai Langkat 03°37’35.0” 98°27’05.4” 37 4 PS 862 Tanjung Jati Binjai Langkat 03°37’43.7” 98°27’07.8” 35 5 PS 882 Tanjung Jati Binjai Langkat 03°37’35.6” 98°27’05.5” 33 6 PS 891 Sei Mencirim Sunggal Deli Serdang 03°35’26.9” 98°33’54.1” 38 7 TLH 2 Tanjung Jati Binjai Langkat 03°37’35.0” 98°27’05.6” 39 8 GMP2 Tanjung Jati Binjai Langkat 03°37’35.0” 98°27’05.7” 39
9 KidangKencana Tanjung Jati
Binjai
Langkat 03°37’34.8” 98°27’05.2” 42
10 PSBM 901 Tanjung Jati
Binjai
Langkat 03°37’34.8” 98°27’05.3” 40
11 PSCO 902 Sei Mencirim
Sunggal Deli Serdang 03°35’26.7” 98°33’54.1” 40 12 VMC 76-16 Sei Mencirim Sunggal Deli Serdang 03°35’26.9” 98°33’56.0” 42
13 BZ 134 Hamparan Klumpang Deli 03°41’50.5” 98°35’59.9” 18
Perak Hamparan Perak Serdang 14 BZ 134 Sunggal Sei Mencirim
Sunggal
Deli Serdang
03°35’27.5” 98°33’55.4” 42 15 BZ 134 TanjungJati Tanjung Jati
Binjai Langkat 03°37’29.5” 98°27’06.5 43 16 GambasHamparan Perak Klumpang Kebun Hamparan Perak Deli Serdang 03°40’16.8” 98°35’49.9” 20
Tabel 2. Lanjutan……
17 GambasSunggal Paya Geli
Sunggal
Deli Serdang
03°34’46.2” 98°35’33.9” 26
18 GambasStabat Karang Rejo
Stabat Langkat 03°42’30.7” 98°30’20.3” 43 19 KuningHamparan Perak Hamparan Perak Hamparan Perak Deli Serdang 03°43’23.6” 98°36’48.3” 17
20 KuningSunggal Medan Krio
Sunggal
Deli Serdang
03°34’17.5” 98°35’00.6” 29 21 KuningTanjungJati Tanjung Jati
Binjai Langkat 03°37’02.5” 98°27’42.1” 47 22 GelagahMedan Helvetia Sei Sekambing Medan Helvetia Medan 03°35’58.7” 98°37’41.3” 56
23 GelagahSunggal Sei Sengko
Sunggal
Deli Serdang
03°33’39.8” 98°34’02.6” 41 24 GelagahTanjungJati Tanjung Jati
Binjai
Langkat 03°37’43.2” 98°27’42.8” 39 25 MerahKabanjahe Simpang Korpri
Berastagi Karo 03°09’57.2” 98°30’36.6” 1368 26 MerahHamparan Perak Hamparan Perak Hamparan Perak Deli Serdang 03°43’04.3” 98°36’27.0” 19
27 MerahStabat Karang Rejo
Stabat Langkat 03°42’49.8” 98°30’14.6” 26 28 BerastagiSibolangit Sibolangit Sibolangit Deli Serdang 03°16’57.6” 98°33’21.2” 812 29 BerastagiBerastagi Peceran Berastagi Karo 03°12’10.0” 98°31’23.7” 1435 30 BerastagiKabanjahe Ketaren Kabanjahe Karo 03°07’02.5” 98°30’22.6” 1206 Bahan kimia
Bahan yang digunakan adalah nitrogen cair,polyvinylpolypyrrolidone (PVPP), β-mercaptoethanol, cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) (Amresco), NaCl, Tris, HCl (p.a), Asetat Glacial, kloroform, isoamilalkohol, Isopropanol,
NaOH, Na-EDTA, ethanol 70 dan 100%,alkohol70%, agarose(Promega), ethidium
bromida, loading dye (Promega), aquades, ddH2O (Aqua bidestilata), buffer CTAB,
buffer TE, buffer TAE 1X dan 50X, primeroligonukloetida(Oligo Macrogen),Go Tag GreenMaster Mix(Promega) dan DNA ladder1 kbp(Amresco).
Alat
Alat yang digunakan adalah Geographic Positioning System (GPS) (Garmin GPS map 76CSx), gunting, plastik polyethylene, kertas cokelat, neraca analitik (Sartorius BP 160 P), mortar, pestle, pinset, sarung tangan, hot plate(Biosan MSH- 300), magnetic stirer, centrifuge (Biofuge Heraeus Pico), water bath/heating block (Biosan Ultraherm BWT-U), tabung eppendorf(Biologix) (2,0 ml, 1,5 ml, 0,2 ml),
erlenmeyer (Pyrex), beaker glass(Pyrex), gelas ukur (Pyrex), pipet (Pyrex),
vortex(Biosan V-1 Plus), shaker, mikropipet(Rainin)(1-10 μl, 2-200 μl, 100-1000 μl), tips pipet (Biologix) (1 ml, 200 µ l,10 µ l),autoklaf(Tomy High-Pressure Steam Sterilizer ES-315), oven, pH meter (Hanna Instruments 8417),elektroforesis apparatus (SCIE-PLUS), PCR (Applied Biosystem Verity 96 Well Thermal Cycler), gel dokumentasi (Uvitec Cambridge), lemari es (Sharp), UPS (ICA), kamera dan alat-alat tulis.
Pelaksanaan Penelitian Pengambilan sample daun
Penelitian ini menggunakan metode surveyuntuk mengoleksi sampel dari lokasi pertanaman. Tanaman tebu yang akan digunakan sebagai sampel ditentukan lokasi titik koordinat dengan GPS. Sampel bahan tanam adalah segmen daun muda yang masih segar dari tanaman yang berumur 3-8 bulan (Hossain et al, 2006; Khan et al, 2009), yang diambildari beberapa lokasi pertanaman tebu petani/masyarakatdan PT. P.Nusantara II yang berada di Kabupaten Deli Serdang dan Langkat (varietas komersil). Sampel klon BZ134 diambil dari tiga lokasi (Kec. Hamparan Perak dan Sunggal Kab. Deli Serdang, Kec. Binjai Kab. Langkat) sebab klon ini yang paling lama dan paling banyak dibudidayakan petani/perkebunan besar. Sampel kultivar tebu lokal, diambil dari Kota Medan, Kab. Deli Serdang, Langkat dan Karo. Sedangkan sampel bahan tanam varietastoleran kekeringan diperolehdari Kebun Koleksi PT. P. Nusantara II. Peta sebaran titik lokasi pengambilan sampel seperti pada Lampiran 5.
Daun tebu yang diambil dari lapangan, dibungkus dengan kertas dan dimasukkan ke dalam kemasan plastik polyethylene (polyethylene bag), selanjutnya dimasukkan ke dalam lemari es untuk menjaga agar daun tetap segar sampai dilakukan proses isolasi DNA.
Isolasi dan pemurnian DNA
DNA diekstraksi menggunakan protokol ekstraksi yang dimodifikasi(Doyle dan Doyle, 1990; Orozco-Castillo et al.,1995). Sampel daun segar dicuci dengan air
mengalir dan dikeringanginkan, kemudian disterilisasi dengan alkohol 70% . Tulang daun dibuang lalu daun dipotong-potong menggunakan guntingsteril. Kemudian potongan daun ditimbang kira-kira 0,2-0,3g (Hossain et al, 2006), dimasukkan kedalam mortar dan ditambah nitrogen cair. Selanjutnyasampel digerus halus sampai berbentuk bubuk dengan menambahkan 0,1 gr PVPPsebagai antioksidan. Bubuk halus kemudian dimasukkan ke dalam tabung eppendorf2 ml laluditambahkan 1 ml buffer ekstraksi CTAB dan 10µ l β-mercaptoethanol(Toruan-Mathius et al, 1996).Campuran tersebut dikocok dengan vorteks lalu diberi tanda sesuai aksesi,kemudian diinkubasi dalam water bath selama30 menit pada suhu 65oC (setiap 10 menit tabung dikocok perlahan secara reguler). Setelah dibiarkandingin hingga suhu kamar, kemudianke dalam campuran ditambah 1 mlkloroformisoamilalkohol(KIAA) (24:1), lalu divorteks kembali sampai homogen. Campuran tersebutselanjutnya disentrifugasi selama 10 menit dengankecepatan 13.000 rpm.Lapisanatas dipipet ke dalamtabung effendorf 2,0 ml lain lalu ditambah 1 ml KIAA kemudian divorteks kembali sampai larutan membentuk kristal. Selanjutnya disentrifugasi 5 menitdengan kecepatan 13.000 rpm. Supernatan yang terbentuk dipindah ke tabung effendorf 1,5 ml dan ditambah isopropanol dingin. Tabung dikocok perlahan dan diperhatikan ada benang-benang halus. Bila benang- benang halus sudah tampak jelas, lalu diinkubasi pada suhu 40C selama 30 menit. Setelah masa inkubasi berakhir larutan disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Selanjutnya cairan isopropanol dibuang dan benang-benang halus (endapan DNA) dalam tabung dikeringanginkan, kemudian ditambahkan 100 µ l buffer TE dan dispin manual agar terbentuk suspensi homogen antara pelet dengan buffer. Selanjutnya ditambah 1 ml ethanol 100% di bolak balik secara reguler kemudian diinkubasi pada suhu 40C selama 30 menit. Setelah masa inkubasi selesai, selanjutnya tabung disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm.
Selanjutnya lapisan atas dibuang, hingga tinggal pelet lalu tabung dikeringanginkan. Setelah kering angin pelet dibilas dengan menambahkan ethanol 70% sebanyak 500 µ l dibolak balik secara perlahan, kemudian ethanol dibuang lalu dikeringanginkan. Jika pelet telah kering angin kemudian ditambah 100 µ l buffer TE lalu dispin manual hingga homogen sehingga terbentuk stok DNA. Stok DNA yang diperoleh dapat digunakan untuk analisis PCR atau disimpan pada suhu -200C bila tidak digunakan. Deskripsi pembuatan bahan yang digunakan untuk isolasi dan pemurnian DNA seperti pada Lampiran 1.
Uji kualitas DNA
Sebelum dilakukan elektroforesis disiapkan gel agarose konsentrasi 0,8% (b/v). Agarose ditimbang, beratnya dikonversi sesuai dengan volume elekroforesis apparatus, kemudian dilarutkan ke dalambuffer TAE 1x (sesuai volume elekroforesis apparatus). Larutan tersebut dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan diberi tanda, kemudian dipanaskan dan diaduk dengan magnetic stirer hingga larutan menjadi bening dan dibiarkan mendidih selama 35 menit. Jika setelah pemanasan volume dalam tabung berkurang ditambahkan aquades sampai batas tanda dan kemudian dipanaskan kembali sampai mendidih lalu didinginkan dan ditambah larutan etidium bromidesebanyak 0,5 µ l. Selanjutnya dipanaskan kembali lalu didinginkan dengan cara mengalirkan air mengalir pada tabung.Setelah larutan agak dingin (suhu ±600C), larutan dimasukkan dalam cetakan agar yang telah dipasang sisir pembuat lubang dan dibiarkan memadat selama ±40 menit. Jika gel telah memadat sisir pembuat lubang dilepas kemudian gel dimasukkan ke dalam elektroforesis apparatusdan diberi larutan TAE 1x ±670 ml hingga batas tanda (terendam). DNA sample yang telah diisolasi dan dimurnikan dimasukkan ke dalam sumur gel. Sebelum stok DNA dimasukkan ke dalam sumur gel, terlebih dahulu diberi loading buffer (pewarnaan) sebanyak 1 µ l ditambah 5 µ l stok DNA, kemudian dicampur rata dengan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam sumur gel. Runningelektroforesis dilakukan pada kondisi
70 volt selama 60 menit. Selanjutnya gel tersebut dimasukkan kedalam gel dokumentasi. Visualisasi DNA yang telah dielektroforesis dilakukan dengan UV transluminator.Deskripsi pembuatan bahan yang digunakan untuk uji kualitas DNA seperti pada Lampiran 1.
Seleksi primer
Primeryang digunakan adalahurutan acak yang digunakan untuk
menghasilkan produk amplifikasi dan mempunyai tingkat polimorfisme yang tinggi untuk mendapatkan penanda pita, baik dari jelasnya pita yang dihasilkan maupun jumlah lokus yang diperoleh. Terlebih dahulu dilakukan seleksi pada10 primer (OPA 17, OPA 19, OPB 10, OPB 18, OPC 04, OPC 17, OPC 18, OPC 19, OPD 08, dan OPH 05) yang telah terbukti menunjukkan polimorphisme pada tebu. (Pan et al., 2004; Zhanget al, 2008;Kawar et al, 2009; Ullah et al., 2013; Chaiyabut et al., 2014)dengan cara membuat beberapa reaksi PCR terhadap beberapa primer yang berbeda pada kondisi yang sama dan menggunakan sampel DNA yang sama, sehingga dapat diketahui kondisi optimum serta tingkat variasi pita yang dihasilkan setiap primer. Dari 10primeryang diseleksi ada 3 primeryang tidak reproduktif dalam mengamplifikasi dan menghasilkan tingkat polimorphisme pita DNA sehingga diseleksi 4primer lain (OPA 04, OPD 03, OPD 14 dan OPN 03). Dari 4 primer ini hanya 3 primer (OPA 04, OPD 03 dan OPN 03) yang mampu mengamplifikasi DNA dan terbukti menunjukkan polimorphisme pada penanda pita DNA.
Tabel 3. Daftar primer RAPD yang digunakan untuk genotyping 30 aksesi Saccharum spp. Sumatera Utara
Primer Sekuen (5’-3’) %
GC Primer Sekuen (5’-3’)
% GC OPA 04 AATCGGGCTG 60 OPC 19 GTTGCCAGCC 70 OPB 10 CTGCTGGGAC 70 OPD 03 GTCGCCGTCA 70 OPB 18 CCACAG CAGT 60 OPD 08 GTGTGCCCCA 70 OPC 04 CCGCATCTAC 60 OPH 05 AGTCGTCCCC 70 OPC 18 TGAGTGGGTG 60 OPN 03 GGTACTCCCC 70
Amplifikasi PCR
Amplifikasi PCR mengikuti prosedur William et al., (1990), dilakukan dengan menggunakan 10primeryang mampu menunjukkan polimorphisme pada tebu.Reaksi amplifikasi dibuat dalam larutan dengan volume 25 µ l yang terdiri dari ddH2O 9,5 µl, Go Green Tag 12,5 µl, primer 1 µl dan stok DNA sebanyak 2
µ l.Persiapan amplifikasi dengan melakukan preparasi master mix untuk running PCR. Larutan master mix(sampel yang digunakan 30) terdiri dari ddH2O 9,5 µl x 31=
294,5 µl, Go Green Tag 12,5 µl x 31 = 387,5 µ l, primer 1 µ l x 31 = 31 µ l. Dari tube diambil 23 µ l ke dalam tube lain sehingga diperoleh 30tube untuk PCR lalu ditambah DNA sebanyak 2 µ l. Selanjutnya tabung dispin manual, kemudian tabung berisi stok DNA dan campuran master mix dimasukkan ke dalam blok sampel pada mesin PCR. Untuk reaksi amplifikasi PCR didesain waktu, suhu dan siklus termal. Reaksi diaturpadathermal cycler yang diikuti programdenaturasi awal pada 940C selama 2 menit, 45 siklus dijalankan untuk denaturasi pada 940C selama 1 menit, annealingprimer pada 360C, 1 menit dan elongasi atau extension pada 720C, 2 menit.Setelahsiklus terakhir, tahapan akhir pada 72ºC, 10menitditambahkanuntuk memungkinkanperpanjanganlengkap semua amplifikasi fragmen. Setelah programsiklus lengkap, reaksidisimpan pada 4ºC(Setiyo, 2001).
Elektroforesis
Produk hasil PCRdikonfirmasi dengan elektroforesis pada gel agarosedalam
buffer TAE 1x dengan marka DNA (DNA ladder) 1 kbp. Sebelum dilakukan
elektroforesis disiapkan gelagarose konsentrasi 1,2% (b/v). Agarose ditimbang 1,56 g kemudian dilarutkan dengan menambahkan 130 ml buffer TAE 1x. Larutan tersebut dimasukkan ke dalam erlenmeyer, lalu dipanaskan dan diaduk dengan magnetic stirer hingga larutan menjadi bening. Selanjutnya larutan didinginkan lalu ditambah larutan pewarna etidium bromide1,5 µ l, dipanaskan kembali dan kemudian
didinginkan lagi. Setelah larutan agak dingin (600C) lalu dimasukkan ke dalam cetakan agar yang telah dipasang sisir pembuat lubang (well-forming comb) dan dibiarkan memadat selama ± 40 menit atau sampai gel mengeras. Kemudian well- forming comb dilepas secara perlahan. Selanjutnya elektroforesis tray yang berisi gel agarose diletakkan ke dalam tankelektroforesis dan larutan buffer TAE 1x dituang ke dalam tank tersebut ±670 ml (terendam) hingga 1 mm diatas permukaan gel atau batas yang telah ditentukan. Selanjutnya sebanyak 5 µ l DNA ladder (marker) dicampur dengan loading dye 2 µ l pada sumur gelpertama, lalu masing-masing 8 µ l sampelproduk hasilPCR dimasukkan ke dalam sumur gel ke dua dan seterusnya.Setelah semua sample dimasukkan ke dalam well gel, tank elektroforesis ditutup dan dihubungkan dengan arus listrik. Proses runningelektroforesis dilakukan pada kondisi 80 volt selama 100 menit. Setelah runningelektroforesis selesai, DNA yang telah dielektroforesis divisualisasi dengan cara meletakkan gel pada UV transaluminatorlalu di dokumentasikan.Deskripsi pembuatan bahan yang digunakan untuk proses elektroforesis seperti pada Lampiran 1.
Analisis DataRAPD Penentuan skoring
Setelahelektroforesis, semua pitaatau fragmenyang berbedaditentukan ukuran pita DNAnya dengan menggunakan program Uvitec. Dari hasil rekapitulasi ukuran pita DNA kemudian diberinomor identifikasiatas dasarada(1) atau tidak ada (0), secara terpisahuntuk setiap individudan setiapprimer. Skoryang diperoleh dengan menggunakansemuaprimerdalam analisisRAPDkemudiandikombinasikan untuk menciptakanmatriks datatunggal.Skoring produk PCR-RAPD ini berdasarkan
muncul tidaknya pita DNA digunakan untuk menentukan keragaman genetik.
Penentuan tingkat keinformatifan primer
Tingkat keinformatifan primer (Plolymorphic Information Content=PIC)merupakan parameter untuk menghitung efisiensi marka dan karakteristik genetik. PIC dihitung menggunakan rumus Ramirez et al, (2014):
PIC=2fi (1-fi)(1)
dimana fi: frekwensi alel teramplifikasi (1)dan 1-fi: frekwensi alel nol. Penentuan ukuran pasangan basa
Matriks ketidaksamaan (dissimilarity) tiap kombinasi pasangan dihitung berdasarkan Dissimilarity Index Simple Matching Dice Coefficient denganbootstrap 1000 sesuai rumus:
dij = 1- 1∑��=1��/π(2)
L
dimanadij: ketidaksamaan antara i dan j, L: jumlah lokus, π: tingkat ploidi dan ml:
jumlah alel yang umum diantara i dan j untuk lokus 1.
Matriks jarak atau ketidaksamaan genetik untuk semua kombinasi pasangan individu dapat dilakukan dengan 2 tipe analisis deskriptif dari keragaman:1) Principal Coordinates Analysis (PCoA), suatu jenis analisis faktorial pada tabel ketidaksamaan untuk mendapatkan group origin utama dan 2) Neigbour-Joining Tree (NJ Tree) untuk memperoleh gambaran dari kekerabatan diantara individu-individu. Data dan analisis deskriptif menggunakan software Darwin5.05 (Perrier dan Jacquemoud-Collet, 2009). Analisis data dilakukan secara deskriptif dan dendogram. Skema hubungan kekerabatan secara genetik diperhitungkan berdasarkan pada indeks similaritas (jarak genetik terdekat).
