Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Januari-Mei 2012 di Kawasan Minapolitan, Kabupaten Banjar Provinsi Kalimantan Selatan dan Laboratorium Balai Karantina Ikan Kelas II Syamsudin Noor Banjarmasin. Pengambilan sampel dilakukan di Kawasan Minapolitan meliputi 6 lokasi/desa yakni Desa Sungai Sipai, Desa Tungkaran dan Desa Cindai Alus di Kecamatan Martapura; dan Desa Sungai Batang, Desa Sungai Rangas, Desa Penjambuan dan Desa Penggalaman di Kecamatan Martapura Barat. Sedangkan identifikasi bakteri dilaksanakan di Laboratorium Balai Karantina Ikan Kelas II Syamsudin Noor Banjarmasin.
Alat dan Bahan
Alat pengambilan sampel meliputi box untuk membawa peralatan dan bahan, alat bedah (dissecting set), alat pengukur kualitas air, kantong plastik sampel, karet gelang, tabung oksigen, box sterofoam. Alat pemeriksaan laboratorium meliputi peralatan laboratorium bakteri meliputi glassware, laminary air flow, mikroskop, timbangan, pengukur pH, autoclave, bunsen, ose.
Bahan yang digunakan dalam penelitian meliputi sampel ikan Patin, Alkohol 70 %, Alkohol 95%, KOH 3% , H202 3%, reagen oksidase, Aquadest, Media TSA, kristal violet, lugol, aseton, safranin, bahan uji biokimia meliputi media O/F, LIA, TSIA, MIO, Sitrat, Urea.
Cara Kerja
Pengumpulan Data
a. Data primer adalah data penyakit bakterial dari hasil penelitian dengan melakukan pemeriksaan terhadap ikan-ikan sampel yang dilengkapi dengan data dukung berupa data deskripsi lingkungan.
b. Data sekunder adalah data penyakit bakterial yang diperoleh dari instansi pemerintah maupun swasta.
Pengambilan Sampel
Metode yang digunakan dalam pengambilan sampel ikan dari usaha budidaya kolam adalah dengan metode purposive sampling, yaitu metode pemilihan sampel berdasarkan atas ciri-ciri atau sifat-sifat populasi yang sudah diketahui sebelumnya, metode ini digunakan untuk mencapai tujuan tertentu sesuai dengan penelitian yang dilakukan. Sampel ikan Patin diambil dari kelompok pembudidaya ikan (Pokdakan) Patin di Kawasan Minapolitan (Lampiran 1. Data Pokdakan Patin Kawasan Minapolitan Kab. Banjar).
Penentuan jumlah pengambilan sampel kelompok pembudidaya ditentukan dengan menggunakan rumus Taro Yamane :
n =
N Nd2 + 1
Keterangan :
n = Jumlah sampel yang diambil N = Jumlah populasi
d = Presisi yang ditetapkan (persen kelonggaran ketidaktelitian karena kesalahan pengambilan sampel yang masih dapat ditolerir atau diinginkan) yaitu 10 persen.
Dari perhitungan dengan menggunakan Rumus Taro Yamane diperoleh jumlah sampel yang diambil sebesar 16 sampel POKDAKAN dari populasi 19 POKDAKAN. Selanjutnya penentuan sampel per desa ditentukan dengan metode proportional random sampling (Tabel 4).
Tabel 4. Penentuan jumlah sampel usaha POKDAKAN Patin
Lokasi Populasi (N) Sampel (n)
Desa Tungkaran 1 1
Desa Cindai Alus 2 2
Desa Sei Batang 12 9
Desa Sei Sipai 1 1
Desa Sei Rangas Hambuku 1 1
Desa Penggalaman 2 2
Sedangkan penentuan jumlah sampel ikan yang diambil di tiap sampel kolam budidaya patin ditentukan dengan menggunakan metode Amos 1985. Pada penelitian ini sampel ikan yang diambil sebanyak 10 ekor/lokasi, dengan asumsi prevalensi sebesar 20 % (Tabel 5).
Tabel 5. Penentuan jumlah sampel ikan dengan metode Amos (1985) dalam Lightner (1996)
Ukuran populasi
Jumlah sampel ikan yang diperlukan pada asumsi prevalensi 2% 5% 10% 20% 30% 40% 50% 50 50 35 20 10 7 5 2 100 75 45 23 11 9 7 6 250 110 50 25 10 9 8 7 500 130 55 26 10 9 8 7 1,000 140 55 27 10 9 9 8 1,500 140 55 27 10 9 9 8 2,000 145 60 27 10 9 9 8 4,000 145 60 27 10 9 9 8 10,000 145 60 27 10 9 9 8 >/=100,000 150 60 30 10 9 9 8
Sampel ikan yang diambil untuk penelitian diambil secara selektif (ikan- ikan yang menunjukkan gejala/tanda-tanda klinis terserang penyakit), dan jika tidak menunjukkan tanda-tanda terserang penyakit dapat diambil secara acak Terkait dengan pemeriksaan laboratoris penyakit ikan, jika ikan berukuran kecil diambil keseluruhan organ, sedangkan ikan yang sedang/besar dapat dinekropsi dan hanya diambil organ-organ yang makroskopis menujukkan lesi sebagai specimen. Untuk ikan-ikan sakit yang tidak menunjukan adanya perubahan patologis, untuk sampel digunakan organ yang diduga mengandung lesi yang diambil sebagai spesimen pemeriksaan.
Pemeriksaan bakteri Preparasi Sampel
Untuk pemeriksaaan sampel dilakukan anamnesa terlebih dahulu. Selanjutnya ikan dinekropsi dan dilakukan pengamatan patologi anatomi yang terdiri dari pemeriksaan eksternal (sirip, sisik, lendir, kulit, insang) dan pemeriksaan internal (ginjal, limpa, hati). Selanjutnya bagian tubuh eksternal maupun internal yang mengalami perubahan patologi dijadikan sampel untuk isolasi bakteri.
Isolasi bakteri
Isolat bakteri dari sampel ditumbuhkan pada media agar cawan TSA, diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Koloni bakteri yang tumbuh terpisah dan tampak berbeda selanjutnya dibuat menjadi kultur isolat murni.
Identifikasi isolat bakteri
Uji gram (KOH 3%). Bakteri diambil menggunakan ose kemudian diletakkan pada gelas objek. Selanjutnya larutan KOH 3% diteteskan pada bakteri kemudian diamati perubahan yang terjadi.
Pewarnaan gram. Gelas objek dibersihkan dengan alkohol 70% dan diberi aquades, kemudian dipanaskan di atas nyala api. Selanjutnya 1 ose biakan bakteri diratakan pada gelas objek dan difiksasi di atas nyala api. Gelas objek ditetesi dengan larutan kristal violet dan didiamkan selama 1 menit, setelah itu dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Selanjutnya gelas objek ditetesi dengan larutan lugol dan dibiarkan selama 1 menit, kemudian dicuci kembali dengan air mengalir dan dikeringkan. Kemudian gelas objek dicuci dengan larutan pemucat/aseton alkohol selama 10 detik, dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Selanjutnya larutan safranin atau zat penutup diteteskan pada gelas objek dan didiamkan selama 1 menit, kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan.
Uji O/F. Isolat murni bakteri diinokulasikan ke Media O/F dengan cara ditusukkan. Satu tabung diisi dengan parafin cair steril setinggi 1 cm diatas permukaan Media OF, sedang tabung lainnya tanpa parafin cair. Diamati perubahan warna yang terjadi pada tabung yang diisi parafin cair.
Uji Oksidase. Kertas saring dibasahi dengan pereaksi oksidasi, kemudian satu loop isolat bakteri digoreskan pada kertas saring selanjutnya ditetesi 1-2 tetes reagen oksidase. Diamati reaksi oksidasi pada goresan di kertas saring setelah 10-15 detik.
Uji Katalase. Gelas objek ditetesi larutan H202 3% sebanyak 1-2 tetes. Kemudian satu loop isolat bakteri dimasukkan pada genangan H202 3%. Diamati reaksi katalase setelah 10-15 detik.
Uji MIO. Isolat bakteri diinokulasi ke dalam medium MIO pada tabung reaksi secara aseptik, diinkubasi pada suhu 37oC selama 24-48 jam. Amati rekasi yang terjadi. Untuk pengujian indol, media MIO ditetesi dengan 10 tetes reagen Kovac’s.
Uji TSIA. Isolat bakteri diinokulasi ke dalam medium TSIA dalam tabung reaksi secara vertikal pada bagian buut dan secara streak pada bagian slant. Diinkubasi pada suhu 37oC selama 24-48 jam dan diamati perubahan yang terjadi pada medium.
Uji LIA. Isolat murni bakteri diinokulasikan ke media LIA dengan cara ditusuk dan kemudian di strep. Diinkubasi pada suhu 37oC selama 24-48 jam, kemudian diamati dan diamati perubahan yang terjadi pada medium.
Uji Sitrat. Isolat diinokulasi pada medium Simmon’s Citrate agar dalam tabung reaksi secara vertikal, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24- 48 jam dan diamati perubahan yang terjadi.
Uji Urease. Isolat diinokulasikan pada media urease dengan cara jikzak ke atas. Kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24-48 jam dan diamati perubahan yang terjadi.
Identifikasi Bakteri
Karakter bakteri berdasarkan pengamatan morfologi koloni, pengujian sifat fisiologis maupun sifat biokimia disusun dalam bentuk tabel, kemudian dicocokkan dengan karakter bakteri sesuai dengan panduan: Bacteria From Fish and Other Aquatic Animals: A Practical Identification Manual (Buller 2004) dan Bacterial Fish Pathogens: Disease in Farmed and Wild Fish (Austin and Austin 2007).
Pengukuran Parameter Kualitas Air
Pengukuran parameter kualitas air dilakukan langsung di masing-masing kolam/lokasi pengambilan sampel. Parameter yang diukur adalah parameter fisika meliputi temperatur, salinitas dan Oksigen terlarut (DO) dan kecerahan; dan parameter kimia meliputi Amoniak (NH3), Nitrit (NO2), Nitrat (NO3) dan Besi (Fe). Temperatur diukur dengan pH-meter, salinitas diukur dengan Refraktometer, Oksigen terlarut (DO) diukur dengan DO meter dan kecerahan diukur dengan ‘Secchi disc’, sedangkan Amoniak (NH3), Nitrit (NO2), Nitrat (NO3) dan Besi (Fe) diukur dengan test kit.
Pengolahan Data
Data hasil penelitian dianalisa dengan menggunakan rumus prevalensi/frekuensi kejadian. Menurut (Fernando et al. dalam Jahja 2009) Tingkat prevalensi dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
Prev = n x 100 % N Keterangan : Prev = Prevalensi (%)
N = Jumlah ikan yang terinfeksi (ekor)
n = Jumlah ikan sampel yang diperiksa (ekor)
Data yang diperoleh selanjutnya dianalisis menggunakan analisis regresi linier sederhana dan korelasi linier sederhana.