DAFTAR PUSTAKA
4.2 Optimasi Ekstraksi Kolagen
Pembuatan kolagen dari kulit ikan pari terbagi dalam dua tahap, yaitu pretreatment (perendaman kulit dalam larutan NaOH yang dilanjutkan perendaman kulit dalam asam asetat) dan ekatraksi dengan air. Optimasi pada tahap perendaman kulit dalam larutan NaOH ditujukan untuk mendapatkan perlakuan kombinasi konsentrasi NaOH dan waktu perendaman terbaik dalam menghilangkan protein non kolagen pada kulit ikan. Optimasi pada tahap perendaman asam asetat ditujukan untuk mendapatkan konsentrasi dan waktu perendaman terbaik terhadap derajat pengembangan kulit (DP) kulit dengan tingkat kehilangan kolagen yang rendah.
4.2.1 Perendaman kulit dalam larutan NaOH
Hasil pengamatan kandungan protein dari larutan NaOH sisa perendaman kulit dapat dilihat pada Gambar 9. Kandungan protein dari larutan NaOH sisa perendaman kulit untuk setiap perlakuan kombinasi konsentrasi NaOH dengan lama waktu perendaman 2 jam menunjukkan kandungan protein yang tinggi dan
nilai kandungan protein semakin menurun seiring penambahan waktu perendaman. Hal ini menunjukkan bahwa protein non kolagen yang terkandung dalam kulit ikan sudah banyak dilepaskan dengan pelarut basa pada 2 jam pertama perendaman sehingga jumlah protein non kolagen dalam kulit semakin berkurang yang ditunjukkan dengan semakin kecilnya nilai konsentrasi protein dalam larutan NaOH sisa perendaman kulit pada pengamatan berikutnya. Zhou dan Regenstein (2005) menunjukkan bahwa penggunaan larutan basa pada proses pretreatment kulit lebih efektif dalam proses pengeluaran protein non kolagen dan hanya menyebabkan tingkat kehilangan kolagen yang rendah dibandingkan dengan penggunaan larutan asam. Hinterwaldner (1977) menyatakan bahwa pelepasan zat selain kolagen terjadi akibat hancurnya sebagian ikatan silang pada struktur kolagen dalam kondisi basa. Jaswir et al. (2011) menambahkan bahwa selama perendaman dalam NaOH terjadi sedikit pembengkakan kulit sehingga memungkinkan masuknya air dan menyebabkan protein non kolagen yang terjebak dalam matrik kolagen menjadi lebih mudah dilepaskan.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 K 1 W 2 K 1 W 4 K 1 W 6 K 1 W 8 K 2 W 2 K 2 W 4 K 2 W 6 K 2 W 8 K 3 W 2 K 3 W 4 K 3 W 6 K 3 W 8 N il ai k ons e nt ras i pr ot e in ( m g/ m l) perlakuan
Gambar 9 Konsentrasi protein larutan NaOH sisa perendaman kulit dengan perlakuan kombinasi konsentrasi NaOH dan waktu perendaman. Perlakuan kombinasi konsentrasi NaOH 0,2 M dengan waktu perendaman 4, 6, dan 8 jam menunjukkan nilai konsentrasi protein yang cenderung lebih tinggi dibandingkan perlakuan lainnya. Hal ini mengindikasikan bahwa sebagian kolagen dalam kulit mulai terlarut dalam larutan NaOH. Hal diduga terjadi karena
kelebihan konsentrasi OH yang mengakibatkan terputusnya sebagian ikatan kovalen dalam struktur kolagen. Hal ini selaras pendapat Jaswir et al. (2011) yang mengatakan bahwa NaOH memiliki peranan dalam pemisahan untaian dari batang-batang serat kolagen. Yoshimura et al. (2000) melaporkan bahwa basa menyerang terutama wilayah teleopeptida dari struktur kolagen selama proses pretreatment sehingga dapat menyebabkan kelarutan kolagen.
Hasil analisis ragam (ANOVA) kandungan protein larutan NaOH sisa perendaman kulit (Lampiran 3) menunjukkan bahwa kombinasi perlakuan konsentrasi NaOH dan waktu perendaman berpengaruh nyata terhadap kandungan protein pada larutan NaOH sisa perendaman kulit. Hasil uji lanjut dengan DMRT 5% (Lampiran 4) menunjukkan bahwa perlakuan terbaik untuk menghilangkan protein non kolagen pada kulit ikan pari adalah perendaman kulit dalam larutan 0,05 M NaOH selama 6 jam. Hal ini selaras dengan penelitian yang dilakukan Zhou dan Regenstein (2005) yang menunjukkan bahwa protein non kolagen dapat dihilangkan dengan perendaman dalam larutan NaOH dengan konsentrasi 0,01 mol/L OH dan 0,1 mol/L OH. Peningkatan konsentrasi diatas 0,1 mol/L OH tidak memberikan pengaruh terhadap penghilangan protein non kolagen. Penelitian yang dilakukan Shon et al. (2011) menunjukkan bahwa perendaman kulit dengan konsentrasi NaOH 0,15 N selama 48 jam menghasilkan rendemen, viscositas, dan gel strength kolagen dari kulit ikan skate (Raja kenojei) yang terbaik.
4.2.2 Perendaman kulit dalam asam asetat
Kulit hasil perendaman larutan NaOH dengan perlakuan terbaik pada tahap sebelumnya (0,05 M; 6 jam) dilanjutkan pada tahap kedua yaitu perendaman dalam larutan asam asetat. Kulit yang digunakan dicuci dengan air mengalir sampai mendekati pH netral. Pencucian betujuan untuk mengurangi sisa basa yang masih menempel pada kulit sehingga tidak mempengaruhi terhadap pH larutan asam asetat yang akan digunakan pada tahap selanjutnya.
Preteatment asam diperlukan untuk mengubah struktur serat kolagen sehingga akan mempermudah proses ekstraksi pada tahap selanjutnya. Perendaman dalam asam menyebabkan terjadinya penggembungan kulit (swelling) yang diakibatkan masuknya air ke dalam serat kolagen. Jaswir et al.
(2011) mengatakan bahwa masuknya air ke dalam serat kolagen disebabkan terjadinya gaya elektrostatik antara gugus polar pada serat kolagen dengan H+ dari asam atau terbentuknya ikatan hidrogen antara gugus non polar pada serat kolagen dengan H+ dari asam. Pembengkakan ini penting karena dapat mendukung rusaknya struktur serat kolagen melalui terganggunya ikatan non kovalen dan pada akhirnya memudahkan ekstraksi dan kelarutan kolagen.
Hasil pengamatan terhadap derajat pengembangan (DP) kulit hasil perendaman dalam asam asetat pada konsentrasi dan lama waktu perendaman yang berbeda dapat dilihat pada Gambar 10. Derajat pengembangan kulit mengalami peningkatan dengan semakin tinggi konsentrasi asam asetat dan semakin lama waktu perendaman. Hal ini mengindikasikan semakin tinggi konsentrasi dan semakin lama waktu perendaman asam mengakibatkan semakin banyak jumlah air yang dapat diserap oleh kulit sehingga serat kolagen menjadi lebih mudah untuk dipisahkan dan akan memudahkan proses ekstraksi kolagen pada tahap selanjutnya.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 1 2 D e rajat Pe n g e mb an g an ( % )
waktu perendaman (jam)
Gambar 10 Derajat pengembangan (DP) kulit dengan perlakuan konsentrasi dan lama waktu perendaman asam asetat: Konsentrasi asam asetat 0,05 M ( ), konsentrasi asam asetat 0,1 M ( ), konsentrasi asam asetat 0,2 M ( ).
Hasil analisis ragam (ANOVA) derajat pengembangan kulit (Lampiran 6) menunjukkan bahwa konsentrasi asam asetat dan lama waktu perendaman berpengaruh nyata terhadap derajat pengembangan (DP) kulit, sedangkan interaksi antara konsentrasi asam asetat dengan lama waktu perendaman menunjukkan hasil tidak berbeda nyata. Hasil uji lanjut dengan DMRT 5% (Lampiran 7 dan
Lampiran 8) menunjukkan bahwa perlakuan konsentrasi asam asetat terbaik untuk menghasilkan derajat pengembangan kulit yang tinggi adalah 0,2 M; sedangkan waktu perendaman terbaik untuk menghasilkan derajat perendaman kulit yang tinggi adalah 2 jam.
Berdasarkan hasil uji kualitatif kelarutan kolagen menggunakan larutan NaCl 5 M menunjukkan bahwa perlakuan konsentrasi asam asetat 0,2 M dengan lama waktu perendaman 2 jam mengalami tingkat kelarutan kolagen yang lebih tinggi dibandingkan perlakuan konsentrasi asam asetat 0,05 M dan 0,1 M (Tabel 8). Hal ini mengindikasikan sebagian kolagen pada kulit dengan perlakuan konsentrasi asam asetat 0,2 M sudah banyak terekstrak dalam asam sehingga dikhawatirkan akan menurunkan rendemen kolagen yang dihasilkan.
Tabel 8 Kelarutan kolagen dalam larutan asam asetat Konsentrasi asam asetat Waktu (jam) 1 2 0,05 M + ++ 0,1 M + ++ 0,2 M ++ +++
Berdasarkan hal tersebut maka untuk tahap ini dipilih perlakuan terbaik perendaman kulit dalam asam asetat pada konsentrasi 0,1 M dan lama waktu perendaman 2 jam dengan derajat pengembangan kulit mencapai 120,811%. Nilai derajat pengembangan kulit ikan pari jauh lebih rendah dibandingkan nilai derajat pengembangan kulit ikan pari (Himantura gerrardi) hasil perendaman asam asetat 4% selama 12 jam yang mencapai 500% (Martianingsih dan Atmaja 2009). Hal ini diduga disebabkan perbedaan konsentrasi dan lama waktu perendaman sehingga menyebabkan perbedaan jumlah air yang terabsopsi. Menurut Jaswir et al. (2011) penggunaan asam membantu peningkatan H+ yang menyebabkan air lebih mudah masuk ke dalam serat kolagen melalui terjadinya gaya elektrostatik antar gugus polar (pembengkakan elektrostatik) atau ikatan hidrogen antara gugus non polar dan atom (hidrasi lyotropic). Asghar dan Henrickson (1982) di dalam Gomez-Guillen dan Montero (2001) menyatakan
bahwa efek lyotropic dari asam karboksilat pada kolagen lebih dominan dalam peningkatan swelling.
4.2.3 Ekstraksi dengan air
Kulit hasil perendaman asam asetat dengan perlakuan terbaik (0,1 M selama 2 jam) dilanjutkan pada tahap ketiga, yaitu ekstraksi dengan air. Kulit dicuci dengan air mengalir sampai pH mendekati netral. Hal ini ditujukan agar kolagen yang dihasilkan memiliki pH mendekati netral. Hinterwaldner (1977) menyatakan bahwa proses penetralan akan mengurangi sisa asam maupun basa sehingga dihasilkan pH akhir yang mendekati netral.
Ekstraksi kulit dilakukan dengan air bersuhu 40 C selama 2 jam. Proses pemanasan kulit dalam air hangat menyebabkan berlanjutnya kerusakan ikatan hidrogen dan kovalen yang sebelumnya sudah berlangsung selama proses perendaman asam asetat. Gómez-Guillén et al. (2011) menyatakan bahwa proses kerusakan ikatan hidrogen dan kovalen akibat pemanasan kolagen menyebabkan terganggunya kesetabilan struktur triple heliks kolagen sehingga terjadi perubahan bentuk menjadi gulungan dan akhirnya kolagen terdegradasi menjadi gelatin yang larut air. Pemilihan suhu 40 C dilakukan dengan tujuan untuk menghindari terjadinya degradasi kolagen menjadi gelatin selama ekstraksi berlangsung. Hal ini didasarkan pada pendapat Karim dan Bhat (2009) yang menyatakan bahwa suhu 40 C merupakan suhu transisi perubahan heliks menjadi bentuk gulungan yang mengarah pada pembentukan gelatin yang larut. Hal ini juga diperkuat oleh hasil penelitian Kołodziejska et al. (2008) yang menunjukkan bahwa degradasi kolagen menjadi gelatin terjadi diatas suhu 45 oC.
Hasil esktrak kulit dengan air berupa kolagen larut air, kemudian dikeringkan dengan Freeze dryer sehingga diperoleh kolagen dalam bentuk serbuk. Rendemen kolagen yang dihasilkan sebesar 14,475% (bb).