3. BAHAN DAN METODE
3.3. Metode Penelitian
3.3.5. Pengujian Pengaruh Hidrolisat, Konsentrat, dan Isolat
3.3.5.1. Pembuatan sediaan histologi (HE dan
Analisis histologi diawali dengan pembuatan sediaan histologi yang terdiri atas sembilan tahapan (Kiernan 1990), yaitu pengambilan sampel (sampling), fiksasi (pengawetan), dehidrasi, penjernihan (clearing), infiltrasi parafin, pencetakan (embedding), pemotongan (sectioning) dan pewarnaan (staining) Hematoksilin-Eosin dan imunohistokimia terhadap jaringan pankreas (sel beta). a. Sampling
Tikus yang akan dibedah, dipingsankan terlebih dahulu dengan cara dislocatio cervicalis. Setelah tikus pingsan, dilakukan pembedahan dan pengambilan organ pankreas. Kemudian organ pankreas dicuci dalam larutan fisiologi (NaCl 0.9%) dan dimasukkan ke dalam larutan pengawet.
b. Fiksasi dan stopping point
Fiksasi dilakukan dalam larutan Bouin yang dipersiapkan pada hari pembedahan. Larutan fiksatif (Bouin) dibuat dengan cara mencampurkan asam pikrat jenuh: formalin p.a.: asam asetat glasial, dengan perbandingan 15:5:1. Proses pengawetan (perendaman di dalam larutan fiksatif) dilakukan selama 24 jam. Kemudian pankreas dipindahkan ke dalam larutan alkohol 70%. Perendaman di dalam larutan ini berfungsi sebagai stopping point, berarti proses fiksasi dihentikan, dan organ pankreas dapat disimpan di dalam larutan ini sampai tahapan berikutnya dilakukan.
c. Dehidrasi
Tahapan ini dilakukan dengan tujuan untuk menarik air dari jaringan secara perlahan-lahan. Dehidrasi dilakukan dengan menggunakan larutan alkohol bertingkat. Sebelum dilakukan dehidrasi, pankreas dipotong menggunakan silet secara melintang menjadi bagian kecil-kecil dengan ukuran 0.5-1.0 cm3. Potongan-potongan tersebut lalu dimasukkan ke dalam tissue cassete. Proses penarikan air dilakukan dengan cara merendam tissue cassete berisi sampel ke dalam alkohol bertingkat, yaitu 24 jam di dalam alkohol 80%, 24 jam di dalam alkohol 90%, dan 24 jam di dalam alkohol 95%, dilanjutkan dengan perendaman selama 1 jam di dalam alkohol absolut I, 1 jam di dalam alkohol absolut II, dan 1 jam di dalam alkohol absolut III.
d. Penjernihan
Tahapan ini bertujuan untuk menjenihkan dan menghilangkan sisa larutan alkohol yang tersisa dalam jaringan. Penjernihan dilakukan dengan cara memindahkan tissue cassete berisi sampel dari alkohol absolut III ke dalam xylol I selama 1 jam (pada suhu kamar), lalu perendaman dilanjutkan ke dalam xylol II (pada suhu kamar) selama 1 jam dan xylol III selama 30 menit pada suhu kamar dan 30 menit pada oven bersuhu lebih kurang 60 oC.
e. Infiltrasi parafin
Tahapan ini dilakukan untuk memudahkan pemotongan jaringan. Parafin dapat larut di dalam xylol, sehingga dalam proses ini diharapkan xylol yang telah
masuk ke seluruh bagian organ, dapat digantikan oleh parafin, dengan demikian jaringan mudah dipotong. Setelah tahapan perjernihan selesai (jaringan berada dalam xylol III, oven suhu 60 oC), potongan jaringan dikeluarkan dari tissues cassete, lalu dimasukkan ke dalam parafin cair I, II, dan III berturut-turut selama 1 jam. Infiltrasi parafin dilakukan di dalam oven suhu 60 oC. Selanjutnya sampel dicetak dalam parafin.
f. Pencetakan
Pencetakan potongan jaringan pankreas dalam parafin, dilakukan dengan bantuan Tissue Embedding Console. Parafin cair dituangkan pada cetakan yang telah diberi gliserin dan potongan-potongan pankreas diletakkan di dalam parafin. Posisi potongan pankreas diletakkan sedemikian rupa sehingga bagian potongan yang rata dan lebar berada di dasar. Parafin didinginkan sampai membeku, lalu dilepaskan dari cetakan. Bagian parafin yang memuat potongan pankreas dipotong menjadi bentuk segi empat, kemudian ditempelkan pada balok kayu. Sampel di atas balok kayu ini disimpan di dalam refrigerator minimal 1 jam sebelum dipotong menggunakan mikrotom. Hal ini dilakukan agar dihasilkan pita jaringan yang baik.
g. Pemotongan
Pemotongan dilakukan menggunakan mikrotom, agar dihasilkan pita jaringan dengan ketebalan sekitar 5 m. Sebelum pemotongan jaringan dengan ketebalan 5 m, terlebih dahulu dilakukan trimming parafin dengan ketebalan sekitar 10 m hingga diperoleh pita jaringan yang baik. Jika telah diperoleh pita yang baik, hasil sayatan diapungkan di atas aquades dingin. Sayatan yang bagus diambil dan dibentangkan di atas aquades hangat (45 oC), lalu ditempelkan pada gelas obyek dan diinkubasi selama satu malam pada suhu 37 oC. Sampel siap untuk diwarnai.
h. Pewarnaan (Hematoksilin-Eosin dan Imunohistokimia)
Dua macam pewarnaan dilakukan dalam tahapan ini yaitu pewarnaan HE dan pewarnaan dengan metode imunohistokimia. Pewarnaan HE dilakukan untuk pengamatan terhadap struktur umum jaringan. Pewarnaan imunohistokimia dalam
penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi sel beta pankreas, yaitu sel penghasil insulin.
Pewarnaan HE
Tahapan pewarnaan dimulai dengan deparafinisasi, yaitu sediaan dimasukkan ke dalam serial larutan xylol III, II, dan I, dengan maksud untuk melarutkan parafin dari jaringan. Tahap berikutnya ialah rehidrasi, yaitu sediaan dimasukkan ke dalam serial larutan alkohol (alkohol absolut III, II, dan I, alkohol 95, 90, 80 dan 70%). Kemudian sediaan dimasukkan ke dalam milique sebagai stopping point. Sediaan kemudian diwarnai dengan pewarna hematoksilin dan kembali disiram dengan milique untuk menguatkan warna hematoksilin, dilanjutkan dengan memasukkannya ke dalam aquades. Sediaan kemudian diberi pewarna eosin, selanjutnya dilakukan proses dehidrasi dengan mencelupkan sediaan ke dalam serial larutan alkohol 70, 80, 90, dan 95%, alkohol absolut I, II, III. Penjernihan dengan xylol I, xylol II dan xylol III. Tahap akhir dari pewarnaan ini ialah mounting, yaitu penempelan gelas penutup pada sediaan dengan perekat entelan. Sediaan yang telah diwarnai lalu diamati dengan mikroskop cahaya dengan pembesaran 200 dan 400 kali. Pengamatan yang dilakukan adalah terhadap struktur umum jaringan normal maupun yang telah mengalami perubahan dengan melihat jumlah dan luas pulau Langerhans.
Pewarnaan Imunohistokimia terhadap Sel Beta Pankreas (Wresdiyati 2008)
Pewarnaan imunohistokimia dilakukan untuk mendeteksi hormon insulin yang dihasilkan oleh sel beta pankreas. Tahapan pewarnaan imunohistokimia dimulai dari pembuatan sediaan histologi seperti yang telah diuraikan dalam pembuatan sediaan histologi, hanya saja gelas obyek yang digunakan untuk menaruh sediaan adalah gelas obyek yang sudah diberi perekat (neofren). Tahapan selanjutnya, preparat histologi yang telah dibuat dilakukan pewarnaan imunohistokimia terhadap insulin menggunakan metode tidak langsung dua tahap (metode antibodi berlabel enzim). Setelah deparafinasi dan rehidrasi, sediaan direndam dalam air milique sebagai stopping point. Selanjutnya sediaan direndam dengan H2O2 dalam metanol (1:20) selama 15 menit untuk menghilangkan
aktivitas peroksidase endogen. Sediaan direndam dalam milique, lalu PBS masing-masing 2 kali selama 5 menit. Kemudian, sediaan ditetesi dengan serum normal (BSA) 10% (60-70 l/sediaan) dan diinkubasi pada suhu 37 oC, selama 35 menit lalu dicuci dengan PBS 3 kali @ 5 menit. Selanjutnya sediaan dilingkari dengan dako pen dan ditetesi biocare’s background sniper sebagai blocking protein dan disimpan pada suhu 37 oC selama 30 menit, lalu dicuci dengan PBS 3 kali @ 5 menit. Berikutnya, sediaan ditetesi dengan antibodi primer monoklonal anti-insulin (I-2018) dalam PBS (1:1000) sebanyak 60-70 l per sediaan lalu diinkubasi pada suhu 4 oC (refrigerator) selama 24 jam, kemudian dicuci dengan PBS 3 kali @ 5 menit. Selanjutnya, sediaan ditetesi dengan trekkie universal link sebanyak 60-70 l/sediaan lalu diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit, lalu dicuci dengan PBS 3 kali @ 5 menit. Kemudian, sediaan ditetesi
trek avidin-HRP sebanyak 60-70 l per sediaan lalu diinkubasi pada suhu 37 oC selama 15 menit, lalu dicuci dengan PBS 3 kali @ 5 menit. Kemudian, sediaan ditetesi dengan diaminobenzidine (DAB) sebanyak 60-70 l/sediaan dan dibiarkan bereaksi dalam ruang gelap selama 3-5 menit. Sediaan dicuci dengan milique, selanjutnya diwarnai (counterstain) dengan hematoksilin. Setelah dilakukan dehidrasi dengan alkohol bertingkat (70,80,90 dan 95%), lalu alkohol absolut I, II dan III dan penjenihan dengan xylol I,II dan III. Tahap akhir sediaan kemudian dimounting dengan penutup gelas dengan perekat entelan dan siap diamati di bawah mikroskop cahaya pembesaran 200 dan 400 kali. Pengamatan secara kualitatif dilakukan pada jaringan pankreas (sel beta/insulin) yang jika positif ditunjukkan dengan warna cokelat.
i. Mikrofotografi (Pengamatan dan Pemotretan)
Preparat-preparat yang dihasilkan pada pewarnaan HE dan imunohistokimia diamati di bawah mikroskop cahaya dan didokumentasikan dengan mikroskop foto (Nikon E 6 000). Pengamatan yang dilakukan terhadap sediaan dengan pewarnaan HE adalah penghitungan jumlah pulau Langerhans. Pengamatan terhadap sediaan dengan pewarnaan imunohistokimia adalah menghitung rata-rata jumlah sel beta pankreas (buah) yang dihitung dari 10 pulau
Langerhans per sediaan dengan mikroskop elektron transmisi. Semua gambaran histologi sel beta pankreas dilakukan pemotretan dengan pembesaran 20x.
3.3.5.2. Pengukuran aktivitas enzim katalase (Rice-Evans et al. 1991)