+ + + + - + + + + + Oksidase Indol Metyl red Voges-Preuskeur H2S Urease 7% NaCl Nutrient Agar 370C pH 5.7 + - - - - - + + + + (Chasanah, 2004) E. Pemurnian Enzim 1. Presipitasi Protein
Penambahan senyawa yang hanya menggumpalkan protein dan tidak menggumpalkan bahan lain akan memisahkan dan lebih memurnikan protein yang dihasilkan. Tahap ini diistilahkan dengan presipitasi (Suhartono et al., 1992). Menurut Chaplin dan Bucke (1990), presipitasi protein merupakan metode yang berguna untuk pemekatan protein dan sering dilakukan pada tahap awal dari pemurnian enzim.
Presipitasi protein dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain perubahan pH, penambahan garam, dan penambahan pelarut organik. Protein akan mengendap jika pH larutan berada pada pH isoelektrik protein. Garam yang digunakan dalam presipitasi protein dapat berupa ammonium sulfat, sodium sulfat, dan sebagainya tergantung kepada jenis protein. Konsentrasi garam yang ditambahkan adalah konsentrasi jenuhnya (Suhartono et al., 1992). Pemekatan protein dengan menambahkan ammonium sulfat ke dalam larutan enzim merupakan cara yang banyak dilakukan.
9 Pemekatan protein dengan penambahan ammonium sulfat ke dalam larutan enzim kitosanase dilakukan pada kejenuhan 30-90%. Hasil yang diperoleh adalah tingkat kejenuhan 80% merupakan konsentrasi yang optimum untuk pemekatan protein Bacillus coagulans LH 28.38 (Haliza, 2003). Pemekatan protein Matsuebacter chitosanotabidus 3001 (Park et al., 1999) dan Enterobacter sp. G-1 (Yamasaki et al., 1993) menggunakan ammonium sulfat pada tingkat kejenuhan 70%. Pemekatan protein
Acinetobacter sp. strain CHB101 (Shimosaka et al., 1995), Burkholderia gladioli strain CHB101 (Shimosaka et al., 2000), dan Fusarium solani f. sp. phaseoli (Shimosaka et al., 1993) menggunakan ammonium sulfat pada tingkat kejenuhan 80%. Pemekatan protein Bacillus cereus S1 (Kurakake et al., 2000) dan Psedomonas sp. H-14 (Yoshihara et al., 1992) menggunakan ammonium sulfat pada tingkat kejenuhan 90%. Pemekatan protein Amycolatopsis sp. CsO-2 (Okajima et al., 1994) dan Bacillus sp. strain CK4 (Yoon et al., 2001) menggunakan ammonium sulfat bertingkat dari 30-80%. Menurut Chaplin dan Bucke (1990), beberapa enzim tidak dapat tahan dalam presipitasi dengan ammonium sulfat. Pemekatan protein
Myxobacter sp. AL-1 menggunakan ZnCl2 (Reyes dan Corona, 1997). Pemekatan protein Aspergillus sp. Y2K menggunakan evaporator vakum pada 400C (Cheng dan Li, 2000).
Beberapa keuntungan menggunakan ammonium sulfat antara lain mudah larut, tidak toksik, murah, dan stabilitasnya terhadap enzim karena tidak mempengaruhi struktur protein (Webb dan Dixon, 1979). Selain keuntungan yang diperoleh, penggunaan ammonium sulfat juga menimbulkan kerugian antara lain konsentrasi garam yang tertinggal dalam produk tinggi, kurang efisien dalam menghilangkan impuritis, dan ammonium sulfat tidak bersifat buffer sehingga dapat membebaskan ammonia yang mengakibatkan kemungkinan penambahan nilai pH (Suhartono et al., 1992).
Ion garam yang ditambahkan akan mempengaruhi kelarutan protein. Pada konsentrasi rendah, ion-ion ini akan melingkungi molekul-molekul protein dan mencegah bersatunya molekul-molekul ini sehingga protein
melarut. Peristiwa ini disebut salting in. Pada konsentrasi tinggi, terjadi peningkatan muatan listrik di sekitar protein yang akan menarik mantel air dari koloid protein. Interaksi hidrofobik di antara sesama molekul protein pada suasana ionik tinggi akan menurunkan kelarutan protein. Peristiwa ini disebut salting out (Suhartono et al., 1992).
Penambahan pelarut organik akan menurunkan konstanta dielektrik dari medium dan akibatnya akan menurunkan kelarutan protein. Beberapa presipitan yang umum digunakan adalah metanol, etanol, isopropanol, dan aseton. Penambahan pelarut organik dapat memperbesar kemungkinan terjadinya denaturasi protein terutama pada suhu yang tinggi. Oleh karena itu, presipitasi protein menggunakan pelarut organik dilakukan pada suhu yang rendah (di bawah 00C). Kerugian lain dalam penggunaan pelarut organik adalah sifatnya yang mudah terbakar dan harganya mahal (Suhartono et al., 1992).
Etanol merupakan pelarut yang ideal karena adanya keseimbangan antara efek melarutkan dan sifat hidrofilik yang cukup untuk mengurangi denaturasi protein. Isopropanol telah digunakan untuk presipitasi berbagai protein ekstraseluler. Isopropanol memiliki sifat mudah terbakar yang lebih rendah, tetapi cenderung bersifat hidrofobik. Penggunaan aseton telah terbukti dapat mempertahankan stabilitas beberapa protein. Penambahan aseton harus dilakukan secara perlahan-lahan biasanya melalui sisi samping wadah (Suhartono et al., 1992).
Beberapa protein diendapkan dengan menggunakan suatu polimer seperti polietilen glikol (PEG). Polimer ini seperti penambahan garam dan pelarut organik akan menarik molekul air sehingga protein tereksklusi dan bersatu membentuk gumpalan endapan. Keuntungan penggunaan PEG antara lain tidak toksik, tidak mudah terbakar, tidak membutuhkan suhu yang rendah karena polimer ini memberikan efek stabilisasi terhadap protein, dan mudah diperoleh dengan harga yang relatif murah. Polimer ini dapat ditambahkan sampai konsentrasi 50% (b/v) dan presipitasi protein mulai terjadi pada kisaran 6-12% (b/v) (Suhartono et al., 1992).
11
2. Kromatografi
Kromatografi menunjukkan proses pemisahan berdasarkan distribusi diferensial dari komponen sampel di antara 2 fase, yaitu fase stasioner dan fase bergerak. Komponen yang memiliki interaksi yang kuat dengan fase stasioner akan bergerak lebih lambat dibandingkan komponen yang memiliki interaksi yang kuat dengan fase bergerak sehingga terjadi resolusi (Harris dan Angal, 1989).
Kromatografi kolom merupakan sistem pengaliran suatu fluida melalui kolom yang mengandung matriks bahan pengisi dan substanta yang ingin dipisahkan menjadi beberapa komponen dengan adanya perbedaan daya ikat terhadap bahan pengisi. Pemurnian enzim dengan kromatografi kolom merupakan cara yang paling efektif dibandingkan cara pemisahan yang lain (Suhartono et al., 1992).
Berdasarkan mekanisme kerjanya, kromatografi kolom dapat dikelompokkan menjadi 4 metode, yaitu kromatografi pertukaran ion, kromatografi affinitas, kromatografi filtrasi gel, dan kromatografi interaksi hidrofobik (Walsh, 2002). Kromatografi pertukaran ion merupakan metode pemisahan protein di mana pemisahan terjadi secara selektif berdasarkan perbedaan muatan dengan ion yang terikat pada matriks. Pada kromatografi pertukaran ion, larutan enzim diberi muatan tergantung pada pH, struktur, dan titik isoelektrik enzim. Jika pH larutan enzim di bawah titik isoelektrik, maka enzim akan bermuatan positif dan kromatografi yang akan dilakukan adalah kromatografi pertukaran kation. Jika pH larutan enzim di atas titik isoelektrik, maka enzim akan bermuatan negatif dan kromatografi yang akan dilakukan adalah kromatografi pertukaran anion. Contoh bahan pertukaran kation adalah CM selulosa, SE selulosa, FE selulosa, Dowex 50, dan Aberlite IRC 50. Contoh bahan pertukaran anion adalah DEAE selulosa, DEAE sephadex, dan TEAE selulosa (Harris dan Angal, 1989). Kromatografi pertukaran ion paling baik dipergunakan pada tahap awal pemurnian. Kromatografi ini dapat menampung volume yang besar karena kapasitas tinggi. Kecepatan dan pemisahannya pun tinggi apabila digunakan jenis matriks yang tepat (Suhartono et al., 1992).
Kromatografi affinitas merupakan metode pemisahan protein karena adanya interaksi spesifik antara komponen sampel dengan ligan yang terikat pada matriks. Pada prinsipnya, suatu ligan yang terikat kovalen pada matriks yang tidak larut air akan menyerap salah satu atau beberapa komponen dari campuran. Komponen yang diserap harus memiliki affinitas yang spesifik terhadap ligan tersebut. Komponen yang tidak memiliki affinitas akan melaju terus. Beberapa bahan baik organik maupun anorganik dapat digunakan sebagai matriks. Bahan organik yang sering dipakai antara lain karbohidrat (selulosa, agarose, pati) dan poliakrilamida. Bahan anorganik yang dapat dipakai antara lain gelas (poros dan solid) dan koloid silika. Kromatografi affinitas biasanya dipergunakan pada tahap menjelang akhir pemurnian (Suhartono et al., 1992).
Kromatografi filtrasi gel merupakan metode pemisahan protein berdasarkan perbedaan ukuran molekul. Proses pemisahan menggunakan matriks gel berpori yang dipak di dalam kolom dan dikelilingi oleh solven. Sampel yang mengandung campuran molekul besar dan kecil dilewatkan ke dalam kolom. Molekul protein yang lebih kecil dapat menembus ke dalam pori-pori butiran dan karenanya tertahan selama aliran ke bawah kolom. Molekul protein yang besar tidak dapat menembus ke dalam pori-pori butiran dan melewati kolom lebih cepat. Molekul protein yang berukuran menengah akan mengalir ke bawah pada kecepatan antara tergantung pada tingkat kemampuan menembus butiran. Pemisahan protein menggunakan kromatografi filtrasi gel dapat dilihat pada gambar 3. Kromatografi filtrasi gel disebut juga dengan saringan molekul (Lehninger, 1982).
Salah satu bahan yang penting sebagai gel adalah dekstran (polimer gula yang biasanya larut dalam air) yang telah mengalami reaksi cross linkage dengan bantuan epiklorohidrin. Hasil yang didapat adalah dekstran yang menjadi tidak larut dalam air, tetapi masih dapat menyerap molekul-molekul di dalam molekul-molekulnya sendiri. Gel dekstran disebut juga dengan Sephadex. Sephadex stabil dalam air, garam, pelarut organik, alkali, dan
13 asam lemah. Selain itu, Sephadex juga stabil pada kisaran pH 1-10 sehingga hal yang paling utama dalam memilih buffer adalah kestabilan molekul yang dikehendaki dalam buffer yang dipilih. Kromatografi filtrasi gel baik dipergunakan pada tahap akhir pemurnian. Kromatografi ini memiliki kapasitas terbatas dan kecepatan fraksinasi rendah (Suhartono et al., 1992). Sebagian besar pemurnian enzim kitosanase menggunakan kromatografi filtrasi gel dan kromatografi pertukaran ion (Haliza, 2003).
Gambar 3. Prinsip pemisahan protein menggunakan filtrasi gel
Kromatografi interaksi hidrofobik merupakan metode pemisahan protein karena perbedaan polaritas antar molekul protein pada kekuatan ion tertentu. Peningkatan kekuatan ionik larutan karena penambahan garam netral seperti ammonium sulfat atau sodium klorida akan meningkatkan interaksi hidrofobik protein. Protein diikat oleh matriks yang bersifat non polar. Protein dibebaskan dari ikatan ini dengan menggunakan eluen yang polaritasnya diturunkan (Walsh, 2002).