2 TINJAUAN PUSTAKA
3.2 Prosedur Penelitian
3.2.1 Pemutahiran Data Keberagaman dan Sebaran Indigofera Indonesia 1 Pemutahiran Data Keberagaman Indigofera Indonesia
3.2.2.2 Analisis Keberagaman dan Keserupaan Morfologi Indigofera Penghasil Pewarna Indonesia
3.2.2.3.2 Pengujian Kuantitas Indikan dan Indigo pada Indigofera dari Lapangan dan Kebun Koleksi pada Lahan Percobaan di Magelang
3.2.2.3.2.1 Bahan Tanaman Koleksi Lapangan dan Kebun Koleksi
Sampel bahan untuk uji indikan diambil dari daun segar Indigofera hasil koleksi lapangan dan hasil koleksi hidup. Sampel daun untuk uji indikan diperlukan sebanyak 1kg bobot basah per nomor koleksi, dan masing-masing dibuat 3 kali ulangan. Selanjutnya sampel dikeringanginkan pada suhu kamar (30±2oC) selama 3 sampai 5 hari. Sampel daun yang telah dikeringanginkan dihaluskan dengan blender untuk dibawa ke laboratorium. Sambil menunggu proses preparasi, sampel dikemas dalam amplop dan disimpan dalam almari bersuhu 4 oC. Pengujian indikan dilakukan di Laboratorium Bioteknologi di Balai Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT) Serpong.
Sampel biji untuk keperluan koleksi hidup dikoleksi dari (30–) 50 (–100) individu untuk setiap populasi, dan sebanyak 50 biji untuk setiap sampel, tetapi jika tidak mencukupi maka dikoleksi biji sesuai yang tersedia di lapangan. Koleksi dilakukan di banyak tempat dan dipilih yang memiliki kisaran lingkungan berbeda. Sampel yang dikoleksi dari populasi dengan variasi morfologi berbeda, dipisahkan dan diberi nomor berbeda (Rugayah et al. 2004).
Koleksi biji dari lapangan, selanjutnya ditanam pada lahan percobaan di Magelang. Dari 24 nomor koleksi yang disemai, 22 nomor koleksi yang berhasil tumbuh di lahan tanam. Koleksi hidup ini digunakan untuk pengamatan pertumbuhan vegetatif, generatif, produksi berat basah serta mengukur kandungan indikan pada usia 83 hari. Selain itu semua hasil koleksi yang ditanam dibuat pasta indigo, serta untuk konservasi biji sebanyak 22 nomor koleksi mewakili 5 jenis untuk disimpan sebagai pelestarian plasma nutfah (Lampiran 13).
3.2.2.3.2.2 Penanaman pada Lahan Koleksi di Magelang
Lahan percobaan berukuran 17 x 53 m2 yang memiliki penyinaran dan kemiringan yang sama. Rancangan percobaan dengan acak lengkap. Penempatan
nomor koleksi ditentukan dengan undian. Penanaman koleksi hidup dilakukan dengan tahapan sebagai berikut:
Persiapan Lahan Lahan percobaan dikeringkan dari genangan air selama 30 hari. Tanah digemburkan dengan cara dibajak, kemudian di buat bedeng berukuran ukuran 2 x 15 m2, jarak antar bedeng 1m. Setelah media tanam gembur, ditebarkan furadan untuk membunuh hama tanah dengan mendiamkan tanah sampai bebas hama dan benar-benar kering. Seluruh bedeng dipasang mulsa dan dibuat lubang tanam berjarak 60 cm. Jumlah bedeng 17 dengan arah bedeng utara ke selatan. Setiap nomor koleksi ditanam pada 2 bedeng, masing-masing bedeng ditanam 25 individu (Gambar 3.5).
Persemaian Biji Biji hasil koleksi dari lapangan diseleksi dengan cara di rendam dalam air selama 3 jam. Biji yang tenggelam sebagai indikasi biji viable
dipilih untuk ditanam. Biji dikeringanginkan selama 30 menit selanjutnya disemai dalam plastik polibag berdiameter 2.5 cm. Setiap plastik polibag disemai 1 biji, kemudian plastik polibag disusun dalam nampan bambu dan diletakkan dalam bedeng pembibitan yang dinaungi atap untuk menghindari panas dan hujan. Untuk menjaga kestabilan suhu udara, di bagian atas atap plastik ditutup dengan daun pisang. Selama proses pembibitan dilakukan penyiraman setiap 2 hari sekali dengan sprayer. Semai dibiarkan sampai mampu beradaptasi dengan kondisi lingkungan dan siap untuk dipindahkan ke lapangan (Gambar 3.5).
Gambar 3.5 Koleksi hidup sembilan jenis Indigofera hasil eksplorasi lapangan. A. Bedeng semaian biji; B. Biji viabel; C. Semaian biji dalam plastik polibag semai; D. Bedeng penanaman; E. Tanaman usia 2 bulan; F. Tanaman koleksi usia 1 bulan di lahan tanam; G. Tanaman koleksi usia 83 hari
B
A C D E
Pemindahan Bibit Tanaman ke Lapangan Bibit yang siap dipindahkan ke lapangan, merupakan tanaman yang sehat, ditandai warna daun hijau segar, tidak layu dan ujung daun muda masih utuh. Bibit yang telah berumur 1 bulan dan mencapai tinggi 20–25 cm, siap dipindah ke lahan tanam.
Setiap nomor koleksi ditanam sebanyak 50 individu untuk tiga tujuan pengamatan. Tujuan pertama untuk mengamati pertumbuhan dan perkembangan vegetatif maupun generatif. Pemantauan pertumbuhan dan perkembangan dilakukan sampai tanaman menghasilkan buah matang. Jumlah tanaman yang diamati sebanyak 15 individu. Pengukuran pertumbuhan dilakukan setiap minggu. Tujuan kedua, untuk mengetahui berat basah pada usia 4 bulan, kandungan indikan, dan kandungan indigo dari 15 individu. Setelah dicatat berat basah setiap individunya, sampel diambil sebanyak 500 g untuk dianalisis kandungan indikan dengan 3 kali ulangan. Daun sisa hasil panen difermentasi untuk pembuatan pasta indigo. Tujuan ketiga, untuk mendapatkan biji sebagai koleksi plasma nutfah, tumbuhan dibiarkan sampai menghasilkan buah matang untuk dipanen dan dikoleksi bijinya. Pemanenan biji dilakukan pada waktu biji matang sampai usia tanaman tidak produktif pada usia 2 tahun.
Parameter pertumbuhan yang diukur meliputi tinggi tanaman per minggu, jumlah cabang, lebar kanopi, jumlah tandan bunga setiap ranting, jumlah bunga dalam setiap tandan, jumlah tandan buah setiap ranting, jumlah buah dalam tandan, umur tanaman saat berbunga pertama, umur tanaman berbuah pertama, umur bunga mekar, umur tanaman saat buah matang, dan berat basah saat tanaman berumur 4 bulan.
3.2.2.3.2.3 Pengujian Kadar Indikan
Pengujian kadar indikan dilakukan untuk mengidentifikasi kandungan indikan pada semua jenis Indigofera hasil koleksi dan untuk mengetahui perbedaan tingkat kandungan indikan pada masing-masing jenis Indigofera. Prosedur uji kandungan indikan meliputi pembuatan larutan standar dan preparasi.
Pembuatan Larutan Standar Indikan Standar indikan dilarutkan dalam pelarut air dan asetonitril dengan perbandingan (75:25) (Gilbert et al. 2004). Larutan standar dibuat dengan konsentrasi bertingkat kemudian dibuat kurva).
Pengujian Kandungan Indikan Pengujian kandungan indikan didahului dengan preparasi. Beberapa metode preparasi yang telah dilakukan sesuai hasil penelitian dari: Kokubun et al. (1997), Maugar et al. (2001); Oberthur et al. (2004); Minami et al. (2000); Chanayat et al. (2002), Campeol et al.( 2006); Laitonjam dan Wangkheirakpam (2011), namun indikan tidak terekstraksi dengan baik. Metode preparasi yang paling sesuai untuk Indigofera seperti yang dilakukan oleh Gilbert
et al. (2004).
Sebanyak 500 mg daun keringangin dimasukkan kedalam tabung gelas, dan ditambahkan 2 ml campuran antara H2O dan CH3CN dengan perbandingan 75% : 25%, kemudian tabung gelas ditutup dan dipanaskan dalam water bath pada suhu 90 oC selama 2 menit. Selanjutnya material daun dipisahkan, sisa campuran didinginkan pada suhu 25 oC, kemudian, disentrifus selama 10 menit pada kecepatan 13.000 rpm. Larutan diambil sebanyak 200 µ L untuk dianalisis dengan HPLC. Sebanyak 10 µ L larutan sampel dimasukkan kedalam tabung untuk
diinjeksikan kedalam HPLC-DAD untuk identifikasi dan analisis secara kuantitatif. Preparasi dilakukan sebanyak tiga ulangan dengan mengadopsi metode yang dilakukan oleh Gilbert et al. (2004).
Kondisi HPLC untuk Analisis Kuantitatif dan Kualitatif Indikan Analisis indikan dilakukan dengan menggunakan perangkat tipe HPLC 2695 (Waters) yang dilengkapi dengan alat detector fotodiode 2996 (Waters). Pemisahan larutan dilakukan pada tipe UPLC BEH tipe kolom C18 ukuran partikel 5 µm, diameter 150 panjang 4.6 mm (Waters).
Metode pemisahan pada HPLC mengacu pada Gilbert et al. (2004) yang telah dimodifikasi. Pemisahan dalam HPLC dilakukan dengan fase gerak pada gadien yang mengandung eluen A dan B, di mana A adalah 0.2% asam trifluoro asetat (TFA) dalam air (v/v) dan B adalah 0.2% TFA dalam metanol (v/v) diikuti oleh gadien berikut: 15‒100% B dalam 23 menit dan 100% dalam 23‒27 menit pada laju alir 1 ml/menit. Temperatur pada kolom adalah 25 °C, volume sampel yang diinjeksikan adalah 10 ml, dan detektor ditetapkan pada 200‒600 nm.
Kondisi LC-MS/MS untuk Identifikasi Indikan secara Kualitatif Identifikasi indikan dilakukan dengan menggunakan sistem UPLC- QTOF-MS/MS (Waters) yang tersusun dari sebuah Kromatogafi Cair Kinerja Ultra (UPLC)
Acquity SDS dan spektrometer massa XEVO - G2QTOF. Pemisahan dilakukan pada tipe kolom acquity UPLC BEH C18, ukuran partikel 1.7 μm, dan dimensi: diameter 2.1 panjang 50 mm (Waters). Pemisahan dengan UPLC dilakukan dengan fase gerak yang mengandung eluen A dan B pada gradien, di mana A adalah 0.1% asam format (FA) dalam air (v/v) dan B 0.1% FA dalam asetonitril (v/v) yang diikuti gradien berikut: 5% B dalam 1 menit, 5–100% B dalam 1–6 menit dan 100% B dalam 6–7.5 menit pada laju alir 0.3 ml/menit. Temperatur kolom adalah 40 °C, Volume injeksi adalah 5 ml. UPLC telah digabungkan ke MS dan MS/MS dengan ionisasi electrospray (ESI) dalam mode ion positif dan scan dari m/z 100 menjadi 400, dengan menggunakan tegangan kapiler 3 kV, tegangan dari 38 V, gas desolvation nitrogen pada suhu 300 °C dan laju aliran 600 L/jam, suhu sumber 120 °C, laju energi pada 10–30 V (argon).
3.2.2.3.2.4 Pengujian Kandungan Indigo pada Indigofera Koleksi Tanam Pengujian kandungan indigo dilakukan untuk mengetahui kandungan indigo pada jenis Indigofera pewarna hasil tanam. Pengujian indigo (pasta indigo) melalui 3 tahapan yaitu pembuatan pasta indigo, uji kandungan indigo, dan pembuatan larutan standar indigo. Pembuatan pasta indigo dilakukan dengan prosedur sama seperti pada percobaan sebelumnya (Gambar 3.4). Uji kandungan indigo, dilakukan dengan menimbang masing-masing sampel pasta indigo sebanyak 5.0 mg kemudian dilarutkan dalam 1.0 ml dimetilsulfoksida dan dihomogenkan dengan vortek sampai bercampur. Larutan selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 oC. Setelah dingin supernatan diambil sebanyak 200 mikro liter untuk diinjeksikan kedalam tabung reaksi dan selanjutnya dianalisis dalam HPLC. Pembuatan larutan standar indigo, dengan melarutan standar indigo dibuat dengan konsentrasi 1, 5, 30, 40, 50 ppm dalam pelarut dimetilsulfoksida (DMSO).
3.2.2.3.3 Pengujian Kuantitas Indikan dan Indigo pada Umur Tanam dan