BAB II. KAJIAN PUSTAKA
2.8 Tikus Wistar (Rattus norvegicus)
Tikus liar, tikus norwegia dan tikus coklat adalah hewan semarga dengan tikus laboratorium. Akan tetapi nama ilmiah tikus liar lain itu yaitu tikus hitam adalah Rattus rattus.
Tikus ini mirip dengan tikus norwegia dan sering terdapat di kota-kota di seluruh dunia tetapi jarang dipakai sebagai hewan laboratorium (Smith dan Mangkoewidjojo, 1988).
Gambar 2.8 Tikus Jantan Galur Wistar (Anonim,2013)
Tikus laboratorium jantan jarang berkelahi seperti tikus jantan. Tikus dapat tinggal sendirian dalam kandang, asal dapat melihat atau mendengar tikus lain. Jika dipegang dengan cara yang benar, tikus-tikus ini tenang dan mudah ditangani dilaboratorium.
Pemeliharaan dan makanan tikus lebih mahal daripada mencit tetapi mencit berkembang biak sebaik tikus. Karena hewan ini lebih besar dari mencit, maka untuk beberapa macam percobaan, tikus lebih menguntungkan (Smith dan Mangkoewidjojo, 1988).
Umumnya berat badan tikus laboratorium lebih ringan dibandingkan dengan berat badan tikus liar. Biasanya pada umur empat minggu beratnya 35-40 gram, dan berat dewasa usia 10-12 bulan memiliki berat badan rata-rata 250-300 gram, tetapi bervariasi tergantung pada galur. Tikus jantan tua dapat mencapai 500 gram tetapi tikus betina jarang lebih dari 350 gram (Smith dan Mangkoewidjojo, 1988).
BAB III
KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN
3.1 Kerangka Berpikir
Kerangka berpikir penelitian ini disusun berdasarkan latar belakang dan kajian pustaka, diketahui bahwa penuaan merupakan proses yang dapat dicegah atau diobati. Seperti organ tubuh yang lain, kulit manusia merupakan organ kompleks dan dinamis yang menunjukkan tanda – tanda penuaan secara nyata.
Pada saat ini PRP digunakan sebagai salah satu alternatif penyembuhan luka yang diaplikasikan dengan menggunakan autologus darah atau serum pasien sendiri dalam volume kecil. PRP mengandung 7 protein Growth Factor yang aktif dikeluarkan pada proses penyembuhan luka.
Nano teknologi adalah ilmu dan rekayasa material, struktur fungsional maupun piranti di dalam skala ukuran yang sangat kecil yaitu skala nanometer atau sepuluh pangkat minus sembilan.
Dengan ukuran material yang sangat kecil diharapkan memiliki kekuatan yang sangat besar karena kemampuan penyerapan yang dapat menembus lapisan dalam kulit dan dapat meningkatkan ketelitian pengarahan obat atau zat yang dibawanya ke target organ tubuh yang dikehendaki.
Chitosan mempunyai sifat penting untuk berbagai aplikasi, yaitu kemampuannya mengikat minyak dan air. Berdasarkan sifat biologi dan kimianya maka chitosan mempunyai sifat yang khas yaitu mudah dibentuk menjadi spons,
39 39
karena dapat melindungi dan melepaskan perlahan bahan yang diikatnya.
Diharapkan dalam penggabungan teori dan penelitian yang sudah ada, maka gel Nanochitosan-Platelet Rich Plasma topikal diharapkan dapat memberi alternatif baru dalam proses penyembuhan luka secara bertahap dan berkesinambungan tanpa metode autologus dan tanpa menggunakan teknik suntikan .
Platelet Rich Plasma Topikal
3.3 Hipotesis
Berdasarkan kerangka berpikir dan konsep penelitian maka dapat dibuat hipotesis sebagai berikut :
1. Pemberian gel Nanochitosan-Platelet Rich Plasma secara topikal dapat menurunankan ekspresi Matriks Metalloproteinase-1 pada penyembuhan jaringan luka tikus Wistar.
2. Pemberian gel Nanochitosan-Platelet Rich Plasma secara topikal dapat meningkatan jumlah kolagen dermis melalui proses penyembuhan jaringan luka tikus Wistar.
METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini adalah animal experimental dengan rancangan post test only control group. Pada awal penelitian tikus dibagi untuk 3 kelompok. Kelompok satu (kontrol), dilukai dan hanya diberi Klindamicin gel saja. Kelompok dua dilukai, dioleskan klindamisin gel dan PRP gel. Sedangkan kelompok tiga dilukai dan dioleskan klindamisin gel dan gel Nanochitosan-Platelet Rich Plasma.
Skema Rancangan Penelitian sebagai berikut
Gambar 4.1 Rancangan Penelitian Keterangan :
P = Populasi S= Sampel R= Random P0 = Kontrol, dilukai dan diberi klindamisin gel.
P1 = Perlakuan 1, dilukai dan diberi klindamisin gel sebagai profilaksis dan 10 menit kemudian dioleskan PRP topikal.
P2 = Perlakuan 2, dilukai dan diberi klindamisin gel sebagai profilaksis dan 10 menit kemudian dioleskan Nanochitosan-PRP topikal.
O1 = Observasi jumlah kolagen dermis dan ekspresi MMP-1 kontrol post test.
O2 = Observasi jumlah kolagen dermis dan ekspresi MMP-1 perlakuan 1 post test.
O3 = Observasi jumlah kolagen dermis dan ekspresi MMP-1 perlakuan 2 post test.
4.2 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratory Animal Unit bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana, Denpasar – Bali. Penelitian dilakukan selama dua minggu (pertengahan Desember 2013 sampai awal Januari 2014).
Sedangkan pembuatan bahan aktif Chitosan-PRP dikerjakan di laboratorium pusat Stem Cell & Cancer Institute, Jakarta. Sedangkan untuk proses zat aktif diubah molekul menjadi nano dilaksanakan di LIPI – Jakarta. Proses akhir untuk bentuk gel yang siap diaplikasikan dikerjakan di PT. Fanika Estetika, Kawasan Industri Lippo Cikarang-Bekasi-Jawa Barat. Pemeriksaan histologi dan pengecatan Sirius Red dilakukan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran Udayana. Demikian juga dengan pengecatan Imunohistokimia dan pembacaan ekspresi MMP-1 dilakukan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran Udayana. Penelitian ini berlangsung selama 4 bulan yang berlangsung mulai bulan Oktober 2013 sampai dengan Januari 2014.
4.3 Populasi dan Besar Sample 4.3.1 Populasi
Populasi pada penelitian ini adalah:
a. Populasi target pada penelitian ini adalah seluruh tikus Wistar (Rattus norvegicus) Wistar race yang menerima perlakuan dan dipelihara di kandang hewan Laboratorium Animal Unit Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana serta sesuai dengan kriteria sampel yang telah ditentukan dalam penelitian.
berat badan 270 – 300 g.
4.3.2 Sampel
Sampel dalam penelitian ini adalah tikus Wistar dewasa, yang memenuhi kriteria inklusi, kriteria eksklusi dan kriteria drop out sebagai berikut :
Kriteria inklusi :
a. Tikus Wistar, jantan dan sehat.
b. Umur 12 – 15 bulan c. Berat badan 270 - 300 g.
Kriteria drop Out : Apabila tikus Wistar mati pada saat penelitian.
4.3.3 Besar sampel dan teknik penentuan sampel
Sample menggunakan tikus Wistar jantan sehat dengan berat 270-300 gram dan umur 12-15 bulan.
Besar sampel yang digunakan dihitung dengan rumus Federer (2008) (n-1) x (t-1) ≥ 15
t = jumlah perlakuan / kelompok n = jumlah replikasi
Jadi perhitungannya sebagai berikut : ( n-1 ) x ( t-1 ) ≥ 15 (n-1) x (3-1) ≥ 15 (n-1) x 2 ≥ 15 2n – 2 ≥ 15 2n - ≥ 17 n ≥ 17 / 2 = 8
Tiap kelompok ditambah 10% sebagai cadangan ( 10% x 8 = 1 ).
Jadi total sampel ( 8 x 3 ) + ( 1 x 3 ) = 27 ekor tikus yang dibutuhkan untuk penelitian secara keseluruhan.
4.4 Variabel Penelitian 4.4.1 Klasifikasi Variabel
a. Variabel prakondisi: dalam penelitian ini yang menjadi variabel prakondisi adalah luka.
b. Variabel bebas: dalam penelitian ini yang menjadi variabel bebas adalah gel Nanochitosan- platelet Rich Plasma yang diberikan secara topikal.
c. Variabel tergantung: variabel tergantung dari penelitian ini adalah efek yang ditimbulkan akibat pemberian gel Nanochitosan – Platelet Rich Plasma berupa: ekspresi MMP-1 dan jumlah kolagen pada dermis.
d. Variabel kendali:. Faktor yang dikendalikan tersebut adalah strain tikus, umur, berat badan, jenis kelamin dan pakan tikus Wistar.
Untuk lebih memudahkan dalam memahami hubungan antar variabel penelitian, dibuat skema hubungan antar variabel seperti disajikan pada Gambar 4.2.
Gambar 4.2 Hubungan Antar Variabel
4.4.3 Teknik Pengambilan Sample
Tikus putih diambil dengan cara diacak sederhana dibagi menjadi tiga kelompok. Kelompok 1 tikus dilukai di punggung dengan pump biopsi ukuran 0,6 lalu hanya diberi klindamisin gel sebagai kelompok kontrol. Kelompok 2 dilukai dipunggung pump biopsi ukuran 0,6 yang sama lalu diberi klindamisin gel 10 menit kemudian dioles gel Platelet Rich Plasma. Kelompok 3 dilukai dipunggung pump biopsi ukuran 0,6 yang sama lalu diberi klindamisin gel lalu 10 menit setelah antibiotik menyerap dioles gel Nanochitosan-Platelet Rich Plasma.
Variabel
Penelitian dilakukan selama 14 hari dengan pengolesan sehari 2x yaitu pada sore hari dan pagi hari.
Selanjutnya dari ketiga kelompok tersebut (Kontrol, perlakuan 1 dan perlakuan 2) pada hari ke 14 setelah pengolesan pada pagi hari 2 jam kemudian tikus dieuthanasia, untuk dilakukan biopsi pada kulit punggung tikus Wistar jantan. Kulit tikus dipotong dengan scapel dengan ukuran 1 x 1 cm2 dimana posisi luka persis berada ditengah-tengahnya, hal ini untuk mempermudah pembuatan blok parafin untuk pemeriksaan histologi. Selanjutnya dilakukan pembuatan preparat dan pengecatan dengan reagen Sirius Red. Jumlah ekspresi kolagen dinilai dengan analisa digital menggunakan piranti lunak adobe-photoshop.
Sedangkan untuk penilaian ekspresi Matriks Metalloproteinase-1 di gunakan Kit MMP-1 (DAKO LSAB plus, Universal Detection Kit, DAB 15 ml) adalah suatu bahan yang digunakan untuk proses pengukuran MMP-1 pada manusia dalam bentuk pro dan aktif yang ada dalam serum, plasma, supernatan kultur sel dan urin. Kit ini terdiri dari lempengan mikro dengan 96 sumuran yang sudah dilapisi dengan anti-human MMP-1, larutan buffer untuk pencuci, larutan standar yang mengandung recombinant human MMP-1, assay dilluent, pendeteksi antibody MMP-1 (Rabbit Anti-MMP-1 Polyclonal Antibody), HRP-conjugated streptavidine, tetramethylbenzidine (TMB) dan Stop Solution.
4.4.4 Definisi Operasional Variabel
1. Platelet Rich Plasma adalah bagian dari plasma darah manusia yang mengandung 1.000.000 trombosit/microliter yang diambil dari Human whole blood yang diolah dan dijadikan gel.
growth factor yaitu: PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, β1, TGF-β2, VEGF, EGF. Dan kadar growth factor in-vivo tetap terjaga setelah dilakukan pembuatan plasma kaya trombosit. Konsentrasi trombosit dalam plasma kaya trombosit dapat meningkat delapan kali dari kadar trombosit di dalam darah sehingga kadar growth factor di dalam plasma kaya trombosit juga meningkat delapan kali kecuali IGF-1 (Greene dkk, 2009).
2. Gel Nanochitosan-Platelet Rich Plasma topikal adalah fraksi plasma yang berisi platelet dan faktor pembekuan darah dalam jumlah besar yang mengandung 7 macam growth factor yang diolah menjadi bahan aktif yang dienkapsulisasi dengan chitosan dan diolah dengan teknologi Nano.
3. Klindamisin gel adalah suatu antibiotik dari golongan lincosamides dan bersifat bakteriostatik yaitu bekerja dengan mencegah atau menghambat pertumbuhan kuman bukan membunuh kuman.
Digunakan untuk mengobati infeksi bakteri gram positif, anaerob.
Pada penelitian ini klindamisin gel yang dipakai adalah calinda gel produksi PT. First Medipharma, Sidoarjo-Indonesia sebagai propilaksis untuk pencegahan infeksi sekunder. Tiap gram gel mengandung klindamisin gel phosphate 12 mg yang setara dengan klindamisin base 10 mg.
4. Jenis tikus yang digunakan: tikus jantan galur Wistar.
a. Umur tikus Wistar: 12-15 bulan.
b. Berat badan tikus Wistar: 270- 300 gr c. Jenis kelamin tikus Wistar jantan tua
Tikus Wistar yang sehat dilukai dengan punch biopsi ukuran 0,6 mm di daerah punggung dan kedalaman kurang lebih 0,2 cm agar mencapai lapisan dermis kulit kemudian dioleskan dengan Nanochitosan-Platelet rich plasma.
5. Pemeriksaan histologi dilakukan pada hari ke 14 dengan mengambil jaringan untuk melihat ekspresi MMP-1 dan jumlah kolagen dermis jaringan dengan melakukan biopsi pada kulit punggung tikus Wistar jantan tua untuk dibuat dalam bentuk blok parafin.
6. Matriks metalloproteinase merupakan sekelompok enzim yang bertanggung jawab terhadap degradasi kolagen. Sampai saat ini sudah ditemukan 18 jenis matriks metalloproteinase, akan tetapi yang berperan pada kulit dapat diklasifikasikan menjadi 4 sub family yaitu:
kolagenase, gelatinase, stromelisin dan MMPs membrane.
Penghancuran kolagen tergantung pada aktivitas kolagenase (MMP-1).
Perhitungan ekspresi MMP-1 dengan menggunakan teknik immunohistokimia LSAB (Dako, Denmark) dengan antibodi primer anti-mouse MMP-1 (BIOS, USA). Ekspresi MMP-1 berwarna coklat dan dihitung berdasarkan sel fibroblast yang mengekpresikan MMP-1 dibagi total fibroblast dalam lapangan pandang dan dihitung
masing-mikroskop Olympus CX41 (Japan) dan mikrofotografi menggunakan kamera Optilab Pro (Miconos, Indonesia). Hasil mikrofotografi dianalisis menggunakan perangkat lunak Image Raster 2.1 (Miconos, Indonesia).
7. Kolagen adalah salah satu komponen serat yang dominan pada lapisan dermis kulit. Serat kolagen banyak berperan pada kekenyalan dan kekompakan kulit. Kolagen merupakan protein yang sangat labil dan banyak faktor yang mempengaruhinya dalam proses pembentukkan maupun dalam proses degradasinya (Uiito dkk., 2008 ; Walker dkk., 2008). Pengamatan jumlah ekspresi kolagen dilakukan dengan metode analisis digital dengan kamera Optilab Pro (Miconos, Indonesia) dan dengan pewarnaan khusus picro sirius red. Ekspresi kolagen dihitung sebagai persentase pixel area kolagen yang berwarna merah dibandingkan dengan pixel area seluruhnya.
4.5 Prosedur Penelitian 1. Perlakuan terhadap tikus
a) Dari populasi tikus, dipilih sebanyak 27 ekor tikus sesuai kriteria inklusi untuk dijadikan sampel.
b) Sebanyak 27 ekor tikus sampel diadaptasi terlebih dahulu selama satu minggu.
c) Kandang yang digunakan untuk memelihara tikus percobaan berupa bak plastik berukuran 50x40x20 cm dan pada bagian atas diberi penutup kawat, di dalam kandang terdapat tempat makanan dan botol minuman, serta pada dasar bak diberikan sekam padi untuk menyerap kotoran tikus.
Ada delapan kandang, tiap kandangnya berisi 2-3 ekor tikus.
d) Dari 27 ekor tikus percobaan tersebut dibagi menjadi tiga kelompok secara random. Sebelum dilukai tikus menggunakan anastesi Ketamin dengan dosis 44 sampai 100mg / kg berat badan secara IM. Kelompok 1 tikus dilukai dengan punch biopsi 0,6 mm di punggung lalu hanya diberi antibiotik topikal (klindamisin gel) disebut sebagai kelompok kontrol.
Kelompok 2 dilukai ditempat yang sama lalu diberi antibiotik dan gel Platelet Rich Plasma. Kelompok 3 dilukai ditempat yang sama lalu diberi antibiotik dan gel Nanochitosan-Platelet Rich Plasma.
e) Selanjutnya dari ketiga kelompok tersebut (Kontrol, Perlakuan 1 dan Perlakuan 2) selanjutnya pada hari ke 14 tikus didietil-ether dengan menggunakan metode inhalasi kemudian dilakukan pemotongan kulit dengan scapel ukuran 1 x 1 cm2 dan pada kulit punggung tikus Wistar jantan untuk dibuat dalam bentuk blok parafin. Semua tikus percobaan diaklimatisasi di unit Animal Laboratorium Farmakologi Universitas Udayana. Tikus dikandangkan dan setiap kandang berisi tikus sebanyak 2-3 ekor dan diberikan makanan standar berupa pakan tikus jenis pakan ayam petelur (pakan ayam 594) dengan campuran KLK super 35%.
Ditambah dedak 15% dan jagung 50% diberikan 2 x sehari selama lima
kisaran suhu kamar (25-30ᵒ C) dan kelembaban 70%, kebersihan dan kenyamanan kandang harus selalu dijaga dan tikus diperlakukan dengan kasih sayang.
f) Pada akhir penelitian tikus dieuthanasia melalui cara diinhalasi dengan diethyl-ether dengan dosis 50mg/250g berat badan tikus atau 200mg/kg berat badan tikus, bila belum mati ditambahkan letal barbiturat (pentotal) IM. Bila sudah mati, tikus ditempatkan dalam ruang kaca yang tertutup dan transparan. Setelah itu kadaver tikus dikubur.
2. Pembuatan sediaan histologis
Pembuatan sediaan histologis dibagi menjadi empat tahapan yaitu tahap fiksasi, dehidrasi, clearing dan embeding. Tahap fiksasi artinya kulit hasil biopsi direndam dalam formalin buffer fhosfat 10% selama 24 jam kemudian dilakukan triming bagian jaringan yang akan diambil. Selanjutnya jaringan tersebut direndam dengan alkohol bertingkat (tahap dehidrasi) direndam berturut turut 50%, 70%, 90%, 96% dan 100% masing masing 2 kali selama 2 jam.
Selanjutnya masuk ke tahap clearing dengan memasukkan jaringan ke clearing agent (xylene) selama 24 jam sampai transparan. Tahap embeding diawali dengan proses infiltrasi sebanyak 2 kali selama masing-masing 1 jam dengan parafin murni (Histoplast) cair (suhu 60o C) kemudian jaringan ditanam ke dalam parafin cair dan dibiarkan membentuk blok yang memakan waktu selama satu hari agar mudah diiris dengan mikrotom.
Pemotongan menggunakan mikrotom rotari (Jung Histocut Leica 820), tebal 5 mikro meter secara seri dan diambil irisan ke 5, 10, 15 untuk selanjutnya dilakukan penempelan pada gelas obyek, lalu diinkubasi pada suhu 60oC selama 2 jam. Khusus untuk slide yang dicat dengan immunohistokimia, menggunakan object glass yang sudah dilapisi daya rekat seperti Poly-Lysine atau yang sejenis.
3. Pemeriksaan Kolagen dengan Sirius Red
Sebelum dilakukan pengecatan, slide melalui proses deparafinisasi dan rehidrasi meliputi perendaman dalam larutan xylene 2 x 5 menit, etanol 100% selama 2 menit, etanol 96% 2 x 2 menit, etanol 70% selama 2 menit dan aquadest selama 2 menit. Selanjutnya dilakukan pewarnaan inti sel dengan Hematoxilin Gill selama 10 menit dan dicuci selama 10 menit dengan air mengalir. Dilakukan pewarnaan dengan picro Sirius Red selama 1 jam yang bertujuan memberikan pewarnaan mendekati seimbang. Tahap selanjutnya dilakukan pencucian dengan air asam sebanyak 2 kali. Air yang berlebihan selanjutnya dihilangkan secara fisik dengan menggoyang secara perlahan.
Dehidrasi dalam etanol 70% selama 10 detik, etanol 96% 2x 10 detik, etanol 100% selama 10 detik dan xylene 2 x 2 menit, keringkan selama 2 jam dalam suhu ruang, lalu mounting pada medium berbasis xylene (DPX).
Pengamatan hasil jumlah kolagen dilakukan dengan metode analisis digital. Sediaan dengan pembesaran 10 dan 40 kali, difoto dengan kamera Optilab Pro (Miconas, Indonesia). Masing masing preparat difoto sebanyak 3 kali dengan menggunakan format JPEG. Penghitungan jumlah ekspresi
Image J.
Jaringan kolagen yang tampak berwarna merah terang dipilih menggunakan fungsi “Magic Wand” oleh Adobe Photoshop CS3. Kemudian dengan menggunakan fungsi “inverse” maka terpilihlah pixel selain warna merah, lalu dihapus menggunakan fungsi “delete” sehingga pada gambar hanya tersisa pixel dengan warna merah. Ekspresi kolagen dihitung sebagai persentase pixel area kolagen yang berwarna merah dibandingkan dengan pixel area seluruh jaringan. Pertama-tama gambar yang sudah dihilangkan pixel selain warna merah, dipisah channel warna merahnya melalui fungsi
“RGB stack” pada Image J. Setelah didapatkan channel warna merah kemudian dibuat nilai “threshold” untuk warna merah, lalu dijalankan fungsi
“measure” sehingga didapatkan presentase pixel warna merah dari total pixel secara otomatis.
4. Pemeriksaan Ekspresi Matriks Mettalloproteinase - 1
Sebelum dilakukan pengecatan, slide melalui proses deparafinisasi dan rehidrasi meliputi perendaman dalam larutan xylene 2 x 5 menit, etanol 100%
selama 2 menit, etanol 96% 2 x 2 menit, etanol 70% selama 2 menit dan PBS selama 2 menit.
Selanjutnya dilakukan antigen retrieval, yaitu slide direndam dalam buffer Tri Sodium Citrat lalu dipanaskan dalam microwave selama 5 menit
dengan menggunakan daya 800 Watt, dinginkan lalu cuci dengan PBS 2 x 5 menit.
Selanjutnya dilakukan bloking peroksidase endogen dalam boks plastik dengan H2O2 3% selama 30 menit. Kemudian dicuci dengan PBS 1X selama 5 menit masing-masing dua kali. Diteteskan 5% FBS 100 µL selama dua jam dalam suhu ruang dan boks dalam keadaan tertutup. Dilanjutkan dengan dicuci PBS 1X selama 5 menit masing-masing dua kali, kemudian diteteskan antibodi primer 100 µL selama satu malam dalam boks tertutup. Setelah satu malam dicuci dengan PBS 1X selama 5 menit dalam glass jar masing-masing sebanyak dua kali sambil digoyangkan.
Dilanjutkan dengan biotinylated link yang diteteskan pada seluruh permukaan jaringan kemudian diinkubasi selama 30 menit dalam boks tertutup, kemudian dicuci dalam PBS 1X selama 5 menit dalam glass jar masing-masing dua kali sambil digoyangkan. Selanjutnya diteteskan streptavidin peroxidase kemudian didiamkan selama 30 menit dalam boks tertutup, dicuci kembali dalam glass jar menggunakan PBS 1X sebanyak empat kali masing-masing selama 3 menit sambil digoyangkan.
Diteteskan DAB hingga berwarna coklat kemudian dicuci dengan PBS 1X hingga bersih dan dikeringkan. Diteteskan Hematoxylin Gill didiamkan selama lima menit kemudian dicuci dengan air mengalir. Direndam dalam etanol absolut sebanyak dua kali masing-masing selama lima menit, dilanjutkan perendaman pada xylene sebanyak dua kali masing-masing selama
(DPX) dan ditutup cover glass.
Ekspresi MMP-1 berwarna coklat dan dihitung berdasarkan sel fibroblast yang mengekpresikan MMP-1 dibagi total fibroblast dalam lapangan pandang dan dihitung masing-masing 3 lapangan pandang dengan pembesaran 400x menggunakan mikroskop Olympus CX41 (Japan) dan mikrofotografi menggunakan kamera Optilab Pro (Miconos, Indonesia). Hasil mikrofotografi dianalisis menggunakan perangkat lunak Image Raster 2.1 (Miconos, Indonesia).
Jumlah MMP-1 =
4.6 Alur Penelitian
Gambar 4.3 Gambar Alur Penelitian 27 tikus Wistar jantan
Dilakukan biopsi serta pemeriksaan kolagen dan MMP-1
ANALISIS DATA
4.7 Analisis Data
Semua data yang diperoleh kemudian dideskripsikan. Selanjutnya untuk melakukan analisis perbedaan jumlah kolagen dan ekspresi MMP-1 pada tikus coba antara kelompok kontrol dan kelompok perlakuan 1 dan 2 dilakukan langkah-langkah analisis statistik sebagai berikut:
1. Seleksi data termasuk editing, koding dan tabulasi digunakan file software program SPSS 17.0 for windows.
2. Analisis normalitas data ekspresi MMP-1 dan jumlah kolagen pada masing-masing kelompok dianalisis dengan uji Shapiro-Wilk, dengan tingkat kemaknaan = 0,05.
3. Homogenitas varian dianalisis menggunakan Levene’s test.
4. Analisis komparasi dilakukan dengan one way ANOVA, karena data berdistribusi normal dan variannya homogen yaitu untuk mengetahui pengaruh Klindamisin gel, PRP gel dan gel Nanochitosan – Platelet Rich Plasma, terhadap ekspresi MMP-1 dan jumlah kolagen. Untuk melihat perbedaan antar kelompok diuji dengan post hoc test dan menggunakan batas nyata terkecil pada tingkat kemaknaan = 0,05.
BAB V
HASIL PENELITIAN
Dalam penelitian ini digunakan sebanyak 27 tikus Wistar jantan sehat dengan berat 250-300 gram dan umur 12-15 bulan sebagai sampel, yang terbagi menjadi 3 (tiga) kelompok masing-masing berjumlah 9 ekor tikus, yaitu kelompok kontrol (dilukai dan diberi antibiotik topikal), perlakuan 1 (dilukai, diberi antibiotik topikal dan PRP topikal), dan perlakuan 2 (dilukai, diberi antibiotik topikal dan Nanochitosan-PRP topikal). Dalam pembahasan ini akan diuraikan uji normalitas, uji homogenitas, uji komparabilitas, dan efek perlakuan.
5.1 Uji Normalitas Data
Data jumlah kolagen dermis dan ekspresi MMP-1 pada masing-masing kelompok diuji normalitasnya dengan menggunakan uji Shapiro-Wilk. Hasilnya menunjukkan bahwa data jumlah kolagen dermis dan ekspresi MMP-1 berdistribusi normal (p>0,05), disajikan pada Tabel 5.1.
Tabel 5.1
Hasil Uji Normalitas Data Jumlah Kolagen Dermis dan Ekspresi MMP-1 Masing-masing Kelompok
Kelompok Perlakuan n P Keterangan
Jumlah kolagen kontrol Jumlah kolagen perlakuan 1 Jumlah kolagen perlakuan 2 Ekspresi MMP-1 kontrol Ekspresi MMP-1 perlakuan 1 Ekspresi MMP-1 perlakuan 2
10
5.2 Uji Homogenitas Data antar Kelompok
Data jumlah kolagen dan ekspresi MMP-1 diuji homogenitasnya dengan menggunakan uji Levene’s test. Hasilnya menunjukkan data homogen (p>0,05), disajikan pada Tabel 5.2.
Tabel 5.2
Hasil Uji Homogenitas antar Kelompok Data Jumlah kolagen dan Ekspresi MMP-1 Sesudah Perlakuan
Analisis efek perlakuan diuji berdasarkan rerata jumlah kolagen antar kelompok sesudah diberikan perlakuan. Hasil analisis kemaknaan dengan uji One Way ANOVA disajikan pada Tabel 5.3 berikut.
Tabel 5.3
Rerata Jumlah kolagen antar Kelompok Sesudah Diberikan Perlakuan Kelompok Subjek n
Tabel 5.3 di atas, menunjukkan bahwa rerata jumlah kolagen kelompok Kontrol adalah 53,768,94, rerata kelompok Perlakuan 1 adalah 70,276,53, dan kelompok Perlakuan 2 adalah 80,914,67. Analisis kemaknaan dengan uji One Way Anova menunjukkan bahwa nilai F = 38,88 dan nilai p = 0,001. Hal ini
Tabel 5.3 di atas, menunjukkan bahwa rerata jumlah kolagen kelompok Kontrol adalah 53,768,94, rerata kelompok Perlakuan 1 adalah 70,276,53, dan kelompok Perlakuan 2 adalah 80,914,67. Analisis kemaknaan dengan uji One Way Anova menunjukkan bahwa nilai F = 38,88 dan nilai p = 0,001. Hal ini