Karena gejala infeksi HMPV mirip dengan infeksi Karena gejala infeksi HMPV mirip dengan infeksi RSV maka diagnosisnya sulit dibedakan. Salah satu upaya RSV maka diagnosisnya sulit dibedakan. Salah satu upaya adalah dengan mengembangkan metode pemeriksaan yang adalah dengan mengembangkan metode pemeriksaan yang sensitif, sehingga dapat membantu klarifikasi patogen sensitif, sehingga dapat membantu klarifikasi patogen penyebab infeksi, misalnya dengan teknik RT-PCR (
penyebab infeksi, misalnya dengan teknik RT-PCR ( Reverse Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
Transcriptase Polymerase Chain Reaction). Informasi ini). Informasi ini sangat diperlukan terutama untuk pengembangan obat anti sangat diperlukan terutama untuk pengembangan obat anti virus yang spesifik dan untuk pengembangan vaksin di masa virus yang spesifik dan untuk pengembangan vaksin di masa yang akan datang.
yang akan datang.
Respiratory Syncytial Virus (RSV) Respiratory Syncytial Virus (RSV)
RSV terdiri dari
RSV terdiri dari humanhuman RSV,RSV, bovinebovine RSV dan PVMRSV dan PVM
Deteksi
Deteksi Respiratory Syncytial VirusRespiratory Syncytial Virus
(RSV) dan
(RSV) dan Human MetapneumovirusHuman Metapneumovirus
(HMPV) dengan
(HMPV) dengan Reverse TranscriptaseReverse Transcriptase
Polymerase Chain Reaction
Polymerase Chain Reaction
(RT-PCR)
(RT-PCR)
(pneumonia pada tikus).
(pneumonia pada tikus). Human Human RSV merupakan penyebabRSV merupakan penyebab utama infeksi saluran nafas bagian bawah (bronkiolitis dan utama infeksi saluran nafas bagian bawah (bronkiolitis dan pneumonia) pada bayi dan anak- anak umur kurang 1 tahun. pneumonia) pada bayi dan anak- anak umur kurang 1 tahun.
Gejala dimulai dengan demam, pilek, batuk dan
Gejala dimulai dengan demam, pilek, batuk dan kadang-kadangkadang-kadang disertai
disertai wheezing wheezing (nafas berbunyi). Pada infeksi RSV yang(nafas berbunyi). Pada infeksi RSV yang pertama, 25% - 40% bayi dan anak-anak akan menunjukkan pertama, 25% - 40% bayi dan anak-anak akan menunjukkan gejala bronkiolitis dan pneumonia dan 0.5%-2% di antaranya gejala bronkiolitis dan pneumonia dan 0.5%-2% di antaranya memerlukan perawatan di rumah sakit terutama pada bayi umur memerlukan perawatan di rumah sakit terutama pada bayi umur kurang dari 6 bulan. Kebanyakan penyakit ini sembuh setelah kurang dari 6 bulan. Kebanyakan penyakit ini sembuh setelah 8-15 hari. RSV juga menyebabkan infeksi yang berulang 8-15 hari. RSV juga menyebabkan infeksi yang berulang sepanjang hidup, biasanya berkaitan dengan gejala flu ringan sepanjang hidup, biasanya berkaitan dengan gejala flu ringan sampai berat. Namun demikian, penyakit ini dapat berkembang sampai berat. Namun demikian, penyakit ini dapat berkembang menjadi parah pada semua umur, terutama pada usia
menjadi parah pada semua umur, terutama pada usia lanjut ataulanjut atau yang mempunyai kelainan jantung, paru-paru atau sistem yang mempunyai kelainan jantung, paru-paru atau sistem imunitas
imunitas(2-4)(2-4)
..
RSV merupakan virus
RSV merupakan virus Ribo Nucleic Acid Ribo Nucleic Acid (RNA)(RNA) berselubung anggota dari genus
berselubung anggota dari genus pneumovirus pneumovirus, familia, familia paramyxoviridae
paramyxoviridae. Bentuk dan ukuran virion virus RSV. Bentuk dan ukuran virion virus RSV bervariasi (rata-rata diameter 120-300 nm). RSV bersifat tidak bervariasi (rata-rata diameter 120-300 nm). RSV bersifat tidak stabil di lingkungan dan dapat diinaktivasi dengan sabun, air stabil di lingkungan dan dapat diinaktivasi dengan sabun, air dan desinfektan
dan desinfektan(4)(4)..
RSV menyebar dari sekret pernafasan melalui kontak RSV menyebar dari sekret pernafasan melalui kontak langsung dengan orang yang terinfeksi atau kontak dengan langsung dengan orang yang terinfeksi atau kontak dengan bahan yang terinfeksi. Infeksi dapat terjadi jika bahan yang bahan yang terinfeksi. Infeksi dapat terjadi jika bahan yang terinfeksi mengenai mata, mulut atau hidung atau melalui terinfeksi mengenai mata, mulut atau hidung atau melalui inhalasi
inhalasi droplet droplet (percikan (percikan ludah/ingus) ludah/ingus) saat saat penderita penderita bersinbersin dan batuk. Di daerah iklim sedang, infeksi RSV biasanya dan batuk. Di daerah iklim sedang, infeksi RSV biasanya menjadi wabah tahunan selama 4-6 bulan pada musim gugur, menjadi wabah tahunan selama 4-6 bulan pada musim gugur, dingin dan permulaan musim semi, puncaknya pada musim dingin dan permulaan musim semi, puncaknya pada musim dingin. RSV akan menyebar secara luas pada anak-anak, dingin. RSV akan menyebar secara luas pada anak-anak, selama wabah tahunan tersebut. Hal ini dibuktikan dengan tes selama wabah tahunan tersebut. Hal ini dibuktikan dengan tes serologi pada anak-anak umur kurang dari 2 tahun yang serologi pada anak-anak umur kurang dari 2 tahun yang menunjukkan ant
menunjukkan antibodi teribodi terhadap hadap RSVRSV(2,4)(2,4)..
Pengembangan
Pengembangan vaksin RSvaksin RSV V mejadi mejadi prioritas prioritas penelitian,penelitian, karena sampai saat ini vaksin tersebut belum tersedia di karena sampai saat ini vaksin tersebut belum tersedia di pasaran. Untuk mencegah infeksi yang lebih parah, perlu pasaran. Untuk mencegah infeksi yang lebih parah, perlu penanganan infeksi yang efektif, seperti pemberian penanganan infeksi yang efektif, seperti pemberian
imuno-globulin dan pemberian antibodi monoklonal anti RSV globulin dan pemberian antibodi monoklonal anti RSV(2)(2)
..
RSV terdiri atas 2 subgrup yaitu RSV A dan RSV B, RSV terdiri atas 2 subgrup yaitu RSV A dan RSV B, dibedakan berdasarkan uji serologi, namun belakangan dapat dibedakan berdasarkan uji serologi, namun belakangan dapat dibedakan berdasarkan sekuen nukleotida. Kedua subgrup RSV dibedakan berdasarkan sekuen nukleotida. Kedua subgrup RSV dibedakan menjadi galur-galur berdasarkan tiga kriteria yaitu: dibedakan menjadi galur-galur berdasarkan tiga kriteria yaitu: pola restriksi gen nukleokapsid (gen N), gen hidrofobik (gen pola restriksi gen nukleokapsid (gen N), gen hidrofobik (gen
SH) dan gen protein pengikat (gen G
SH) dan gen protein pengikat (gen G / attachment gene/ attachment gene).). Galur-galur ini tersebar di seluruh dunia, tetapi perbedaan Galur-galur ini tersebar di seluruh dunia, tetapi perbedaan tingkat virulensi dan imunitas pada individu dan komunitas, tingkat virulensi dan imunitas pada individu dan komunitas, belum
belum diketahui diketahui pastipasti(2)(2)
..
Human Metapneumovirus (HMPV) Human Metapneumovirus (HMPV)
Adanya
Adanya humanhuman RSV tipe baru telah dilaporkan di Belanda,RSV tipe baru telah dilaporkan di Belanda, pada tahun 2001. Virus tersebut lebih dekat hubungannya pada tahun 2001. Virus tersebut lebih dekat hubungannya
dengan
dengan Avian Pneumovirus Avian Pneumovirus (APV) serotipe C, yang sebelum-(APV) serotipe C, yang sebelum-nya
nya dikenal dikenal sebagai sebagai virus virus rhinotrakheitis rhinotrakheitis pada aypada ayam am kalkun.kalkun. Virus baru tersebut tidak menginfeksi ayam atau kalkun, tetapi Virus baru tersebut tidak menginfeksi ayam atau kalkun, tetapi menginfeksi manusia sehingga disebut
menginfeksi manusia sehingga disebut Human Meta- Human Meta- pneumovirus
pneumovirus (HMPV)(HMPV)(2)(2). APV merupakan . APV merupakan satu-satunya anggotasatu-satunya anggota genus
genus metapneumovirusmetapneumovirus. Klasifikasi genus. Klasifikasi genus pneumovirus pneumovirus dandan
metapneumovirus
metapneumovirus dibedakan berdasarkan susunan gennya.dibedakan berdasarkan susunan gennya. Genus
Genus metapneumovirusmetapneumovirus tidak mempunyai protein nontidak mempunyai protein non struktural (NS), dan susunan gen juga berbeda dengan genus struktural (NS), dan susunan gen juga berbeda dengan genus pneumovirus
pneumovirus. Susunan gen RSV (. Susunan gen RSV ( pneumovirus pneumovirus) ) adalah adalah 3’- 3’- NS1-NS2-N
NS1-NS2-N-P-M-SH-G-P-M-SH-G-F-M2-L-5’ -F-M2-L-5’ sedangkan sedangkan gen gen APVAPV ((metapneumovirusmetapneumovirus) adalah ) adalah 3’-N-P-M-F3’-N-P-M-F-M2-SH-G-L-M2-SH-G-L-5’-5’(2)(2)..
Gejala klinis yang dijumpai pada infeksi sebagian besar Gejala klinis yang dijumpai pada infeksi sebagian besar sama dengan infeksi saluran pernafasan yang disebabkan oleh sama dengan infeksi saluran pernafasan yang disebabkan oleh human RSV seperti gangguan pernafasan ringan sampai batuk human RSV seperti gangguan pernafasan ringan sampai batuk yang parah, bronkiolitis dan pneumonia, dan seringkali disertai yang parah, bronkiolitis dan pneumonia, dan seringkali disertai demam, mialgia dan muntah. HMPV dapat menyebabkan demam, mialgia dan muntah. HMPV dapat menyebabkan penyakit yang serius pada anak-anak atau lanjut usia atau penyakit yang serius pada anak-anak atau lanjut usia atau imunokompromais. Studi serologi di Belanda menunjukkan imunokompromais. Studi serologi di Belanda menunjukkan bahwa 25% anak umur 6-12 bulan yang diperiksa ternyata bahwa 25% anak umur 6-12 bulan yang diperiksa ternyata
mempunyai antibodi terhadap HMPV. Pada pasien umur mempunyai antibodi terhadap HMPV. Pada pasien umur ≤≤ 55 tahun
tahun menunjukkan bahwa menunjukkan bahwa hampir semuanyhampir semuanya pernah tera pernah terpapar papar human metapneumovirus
human metapneumovirus. Virus HMPV diperkirakan telah. Virus HMPV diperkirakan telah beredar paling sedikit selama 50 tahun
beredar paling sedikit selama 50 tahun(3,6)(3,6).. Di Indonesia belumDi Indonesia belum ada data mengenai besarnya kasus infeksi saluran pernafasan ada data mengenai besarnya kasus infeksi saluran pernafasan yang disebabkan oleh RSV
yang disebabkan oleh RSV maupun HMPV.maupun HMPV. RT-PCR untuk deteksi RSV dan HMPV RT-PCR untuk deteksi RSV dan HMPV
Diagnosis RSV dan HMPV dapat dilakukan dengan cara Diagnosis RSV dan HMPV dapat dilakukan dengan cara melakukan isolasi virus, deteksi antigen virus, deteksi RNA melakukan isolasi virus, deteksi antigen virus, deteksi RNA virus (dengan RT-PCR), adanya antibodi dalam serum atau virus (dengan RT-PCR), adanya antibodi dalam serum atau kombinasi dari tes di atas
kombinasi dari tes di atas(4)(4)..
PCR merupakan salah satu cara untuk memperbanyak PCR merupakan salah satu cara untuk memperbanyak fragmen DNA (
fragmen DNA ( Deoxyribo Nucleic Acid Deoxyribo Nucleic Acid ) spesifik secara) spesifik secara enzimatik
enzimatik in vitroin vitro. Proses PCR menggunakan 1 pasang. Proses PCR menggunakan 1 pasang oligonukleotida
oligonukleotida primer primer yang akan menghibridisasi rantaiyang akan menghibridisasi rantai tunggal dari arah yang berlawanan dengan
tunggal dari arah yang berlawanan dengan DNA target. KarenaDNA target. Karena kebanyakan virus mengandung fragmen RNA, maka sebelum kebanyakan virus mengandung fragmen RNA, maka sebelum penggandaan DNA (amplifikasi), RNA harus diubah terlebih penggandaan DNA (amplifikasi), RNA harus diubah terlebih
dahulu menjadi kopi DNA dengan ensim
dahulu menjadi kopi DNA dengan ensim reverse-transcriptase.reverse-transcriptase. Teknik tersebut disebut RT-PCR yang meliputi beberapa tahap Teknik tersebut disebut RT-PCR yang meliputi beberapa tahap yaitu :
yaitu :
1. Ekstraksi RNA 1. Ekstraksi RNA
Ekstraksi RNA dari sampel aspirat nasofaring dapat Ekstraksi RNA dari sampel aspirat nasofaring dapat dilakukan dengan metode phenol-kloroform, gradien sukrosa dilakukan dengan metode phenol-kloroform, gradien sukrosa atau menggunakan
atau menggunakan kit kit ekstraksi yang tersedia secaraekstraksi yang tersedia secara komersial
komersial(3,4)(3,4). Kopi DNA yang berasal dari RNA akan diper-. Kopi DNA yang berasal dari RNA akan diper- banyak sebagai
banyak sebagai templatetemplate (cetakan) pa(cetakan) pada da proses amplproses amplifikasi.ifikasi. 2.
2. Sintesis Sintesis kopi DNAkopi DNA
Untuk memulai sintesis kopi DNA diperlukan
Untuk memulai sintesis kopi DNA diperlukan primer primer yaituyaitu yaitu sepasang rangkaian pendek DNA yang susunan asam yaitu sepasang rangkaian pendek DNA yang susunan asam nukleatnya komplementer dengan asam nukleat DNA target nukleatnya komplementer dengan asam nukleat DNA target (pada
(pada templatetemplate). Untuk mendeteksi RSV dapat digunakan). Untuk mendeteksi RSV dapat digunakan beberapa macam
beberapa macam primer primer tergantung pada macam gen yang akantergantung pada macam gen yang akan digandakan.
digandakan. Primer Primer RSV NS1 dan RSV NS2 akanRSV NS1 dan RSV NS2 akan menggandakan gen nukleotida (gen N) antara nukleotida menggandakan gen nukleotida (gen N) antara nukleotida 858-1135 dan memberikan hasil pita DNA dengan panjang 278 pb 1135 dan memberikan hasil pita DNA dengan panjang 278 pb (pasang basa).
(pasang basa). Primer Primer RSVG1 dan RSVG2 akan mengganda-RSVG1 dan RSVG2 akan mengganda-kan fragmen gen G
kan fragmen gen G antara 1-21 antara 1-21 dan 584-565.dan 584-565. Susunan
Susunan primer primer untuk gen N untuk gen N dan gen dan gen G RSV G RSV adalah sebagaiadalah sebagai berikut
berikut(2)(2)
::
Cermin Dunia Kedokteran No. 148, 2005 Cermin Dunia Kedokteran No. 148, 2005 52
RSVNS1 : 5’
RSVNS1 : 5’ GGA ACA AGT TGT TGGGA ACA AGT TGT TGA GGT A GGT TTA TGA ATA TGC 3’TTA TGA ATA TGC 3’ RSVNS2 : 5’
RSVNS2 : 5’ CTT CTT CTG CTG TCA AGT CCTG CTG TCA AGT CTA GTA CAC TGT AGT 3TA GTA CAC TGT AGT 3’ dan’ dan RSVG1
RSVG1 : 5’ (GGA TCC : 5’ (GGA TCC C) GGG GCA AAT C) GGG GCA AAT GCA AAC ATG TCC GCA AAC ATG TCC 3’3’ RSVG2
RSVG2 : 5’ GGT : 5’ GGT ATT CTT TTG ATT CTT TTG CAG ATA GC CAG ATA GC 3’3’
Untuk mendeteksi HMPV digunakan
Untuk mendeteksi HMPV digunakan primer primer HMPV MF1HMPV MF1 dan HMPV MR1 yang akan menggandakan gen matrix (gen dan HMPV MR1 yang akan menggandakan gen matrix (gen M) antara nukleotida 212-313 dan memberikan hasil pita DNA M) antara nukleotida 212-313 dan memberikan hasil pita DNA dengan panjang 121 pb. Susunan
dengan panjang 121 pb. Susunan primer primer untuk gen matriksuntuk gen matriks HMPV adalah sebagai berikut
HMPV adalah sebagai berikut(5)(5)::
HMPV MF1 : 5’AAG TGA ATG CAT CAG CCC AAG 3’ HMPV MF1 : 5’AAG TGA ATG CAT CAG CCC AAG 3’ HMPV MR1 : 5’ CAC AGA CTG TGA A
HMPV MR1 : 5’ CAC AGA CTG TGA AGT TTG GT TTG TCA AA 3’TCA AA 3’
Selanjutnya sampel yang positip HMPV dapat Selanjutnya sampel yang positip HMPV dapat dikonfirmasi lebi
dikonfirmasi lebih lanjut dengan produk h lanjut dengan produk gen F dan gen N hasigen F dan gen N hasill penggandaan PCR. Untuk produk gen M yang lebih panjang penggandaan PCR. Untuk produk gen M yang lebih panjang
dapat digunakan
dapat digunakan primer primer HMPV MR1 dan HMPV MF2 ( ATGHMPV MR1 dan HMPV MF2 ( ATG GAG TCC TAT CTA GTA GAC A) yang akan menggadakan GAG TCC TAT CTA GTA GAC A) yang akan menggadakan nukleotida antara 1-331 dan menghasilkan produk DNA nukleotida antara 1-331 dan menghasilkan produk DNA dengan panjang 331 pb. Untuk gen F,
dengan panjang 331 pb. Untuk gen F, primer primer yang digunakanyang digunakan HMPV FF1 (GTG AGC TGT TCC ATT GGC AG) dan HMPV HMPV FF1 (GTG AGC TGT TCC ATT GGC AG) dan HMPV FR1 (CCC TCA ACT TTG CCT AGC TGA TA) yang akan FR1 (CCC TCA ACT TTG CCT AGC TGA TA) yang akan menggandakan nukleotida antara 1162 – 1295 dan menggandakan nukleotida antara 1162 – 1295 dan menghasilkan produk dengan panjang 134 pb. Sedangkan menghasilkan produk dengan panjang 134 pb. Sedangkan untuk gen N,
untuk gen N, primer primer yang digunakan adalah HMPV NF1 (GTAyang digunakan adalah HMPV NF1 (GTA TTA CAG AAG TTT GTT CAT TGA G) dan HMPV NR1 TTA CAG AAG TTT GTT CAT TGA G) dan HMPV NR1 (GAG AAC AAC ACT TGC AAA GTT GG) yang akan (GAG AAC AAC ACT TGC AAA GTT GG) yang akan menggandakan nukloeotida antara 710 – 1034 dan menggandakan nukloeotida antara 710 – 1034 dan meng-hasilkan produk dengan panjang 325 bp
hasilkan produk dengan panjang 325 bp(5)(5).. Untuk reaksi PCR, selain
Untuk reaksi PCR, selain primer primer dibutuhkan beberapadibutuhkan beberapa komponen lain seperti empat basa nukleotida yaitu A(
komponen lain seperti empat basa nukleotida yaitu A(adeninadenin),), T
T ((thyminethymine), G (), G ( guanin guanin) dan C () dan C (cytosinecytosine); enzim polimerase); enzim polimerase ((Taq polymeraseTaq polymerase); enzim); enzim Reverse transcriptase Reverse transcriptase dandan buffer.buffer. 3. Proses RT-PCR
3. Proses RT-PCR
Pada prinsipnya reaksi RT-PCR sama dengan PCR yang Pada prinsipnya reaksi RT-PCR sama dengan PCR yang berlangsung dalam 3 tahap yang berbeda suhu dan waktunya, berlangsung dalam 3 tahap yang berbeda suhu dan waktunya,
yaitu tahap
yaitu tahap denaturationdenaturation (pemisahan untai DNA),(pemisahan untai DNA), annealing annealing (penempelan primer dengan untai DNA), dan
(penempelan primer dengan untai DNA), dan extensionextension (sintesis untai DNA baru). Reaksi tersebut berlangsung di (sintesis untai DNA baru). Reaksi tersebut berlangsung di dalam mesin P
dalam mesin PCR yang telCR yang telah ah diatur suhu dan wadiatur suhu dan waktunya. Olehktunya. Oleh karena
karena primer primer dan ensim polimerase tersedia berlebihan, makadan ensim polimerase tersedia berlebihan, maka produk dari siklus pertama dapat berfungsi sebagai cetakan produk dari siklus pertama dapat berfungsi sebagai cetakan
untuk siklus berikutnya, begitu seterusnya. untuk siklus berikutnya, begitu seterusnya. Ketiga proses
Ketiga proses denaturation, annealing denaturation, annealing dandan extensionextension merupakan 1 siklus PCR yang akan menghasilkan 2 kopi merupakan 1 siklus PCR yang akan menghasilkan 2 kopi (salinan) DNA. Apabila siklus tersebut digandakan n kali maka (salinan) DNA. Apabila siklus tersebut digandakan n kali maka pada akhir proses PCR akan diperoleh salinan DNA sebanyak pada akhir proses PCR akan diperoleh salinan DNA sebanyak
2
2nn. Dalam satu proses PCR dapat mendeteksi beberapa macam. Dalam satu proses PCR dapat mendeteksi beberapa macam agen penyakit, tergantung pada macam
agen penyakit, tergantung pada macam primer primer yang digunakan.yang digunakan. Teknik semacam ini disebut multiplek PCR
Teknik semacam ini disebut multiplek PCR
Proses RT-PCR untuk mendeteksi RSV dengan
Proses RT-PCR untuk mendeteksi RSV dengan Hybrid Hybrid TR2 thermal reactor
TR2 thermal reactor memerlukan 30 siklus dengan programmemerlukan 30 siklus dengan program sbb: 94
sbb: 94ooC - 45 detik, 54C - 45 detik, 54ooC - 45 detik dan 74ºC - 45 detik C - 45 detik dan 74ºC - 45 detik (2)(2).. Sedangkan deteksi HMPV dengan
Sedangkan deteksi HMPV dengan Perkin-Elmer model 2400 Perkin-Elmer model 2400 thermo cycle
thermo cycle memerlukan 45 siklus dengan program 95memerlukan 45 siklus dengan program 95ooC - 10C - 10 menit diikuti 45 siklus pada 95
menit diikuti 45 siklus pada 95ooC-1 menitC-1 menit (denaturation)(denaturation),58,58ooCC - 1 menit
- 1 menit (annealing)(annealing), , 7272ooC – 1 menit (extension)C – 1 menit (extension) dan per-dan
per- panjangan 72
panjangan 72ooC selama 10 menit. Untuk gen F C selama 10 menit. Untuk gen F suhusuhu annealing annealing diganti dengan 62
diganti dengan 62ooCC(5)(5)
..
4.
4. Analisis Analisis produk produk PCRPCR
Hasil amplifikasi DNA (amplikon) yang berupa jutaan Hasil amplifikasi DNA (amplikon) yang berupa jutaan DNA dapat divisualisasikan pada gel elektroforesis dengan DNA dapat divisualisasikan pada gel elektroforesis dengan pewarnaan
pewarnaan ethidium bromideethidium bromide dan dilihat dengan sinar ultradan dilihat dengan sinar ultra violet serta dapat didokumentasikan.
violet serta dapat didokumentasikan. HASIL RT-PCR
HASIL RT-PCR
Hasil RT-PCR akan tampak sebagai pita DNA dengan Hasil RT-PCR akan tampak sebagai pita DNA dengan panjang basa tertentu. Penggandaan gen nukleotida (gen N) panjang basa tertentu. Penggandaan gen nukleotida (gen N) pada RSV akan menghasilkan pita DNA dengan panjang 278 pada RSV akan menghasilkan pita DNA dengan panjang 278 pb.
pb. Contoh Contoh berikut berikut adalah hasil adalah hasil RT-PCR RT-PCR terhadap Rterhadap RSV padaSV pada sampel bersihan hidung (
sampel bersihan hidung (nasal washnasal wash) penderita pneumonia,) penderita pneumonia, dengan
dengan primer primer untuk gen N (RSV NS1 dan RSV NS2) danuntuk gen N (RSV NS1 dan RSV NS2) dan program PCR; 94
program PCR; 94ooC -1 menit, 55C -1 menit, 55 oo C –1 menit dan 72C –1 menit dan 72 oo C C - - 11 menit sebanyak 40 siklus
menit sebanyak 40 siklus (Gambar 1)(Gambar 1)..
..
Gambar
Gambar 1. 1. Hasil pemeriksaan RT-PCR terhadap RSV pada sampelHasil pemeriksaan RT-PCR terhadap RSV pada sampel bersihan hidung (
bersihan hidung (nasal washnasal wash) penderita pneumonia) penderita pneumonia Keterangan:
Keterangan:
Baris 1; kontrol negatip, baris 2; kontrol positip RSV (278 pb) dan hMPV (121 Baris 1; kontrol negatip, baris 2; kontrol positip RSV (278 pb) dan hMPV (121 pb), baris
pb), baris 12,13,15; sampel 12,13,15; sampel positip RSV positip RSV dengan pita dengan pita DNA DNA panjang 278 panjang 278 pb,pb, baris
baris 17 ; 17 ; marker (dok. pribadi)marker (dok. pribadi)
Hasil RT-PCR terhadap HMPV pada sampel bersihan Hasil RT-PCR terhadap HMPV pada sampel bersihan hidung penderita pneumonia, dengan
hidung penderita pneumonia, dengan primer primer untuk gen Muntuk gen M (HMPV MF1 dan HMPV MR1) dengan program PCR yang (HMPV MF1 dan HMPV MR1) dengan program PCR yang sama dengan RSV tampak pada
sama dengan RSV tampak pada Gambar 2Gambar 2 ..
..
Gambar
Gambar 2. 2. Hasil pemeriksaan RHasil pemeriksaan RT-PCR terhadap HMPT-PCR terhadap HMPV pada sampelV pada sampel bersihan hidung penderita pneumonia
bersihan hidung penderita pneumonia Keterangan:
Keterangan: Baris
Baris 6 6 dan dan 14 14 menunjukkan menunjukkan sampel sampel positip positip HMPV HMPV dengan dengan pita pita DNADNA panjang
panjang 121 bp, baris 20 dan 121 bp, baris 20 dan 26; marker, baris 21; 26; marker, baris 21; kontrol negatip, baris 22 ;kontrol negatip, baris 22 ; kontrol positip HMPV (121 pb) (dok. pribadi)
kontrol positip HMPV (121 pb) (dok. pribadi)
Subgrup RSV ditentukan dengan teknik RFLP (
Fragment Length Polymorphisme
Fragment Length Polymorphisme), yaitu teknik membedakan), yaitu teknik membedakan suatu organisme berdasarkan pola pemotongan DNA oleh suatu organisme berdasarkan pola pemotongan DNA oleh enzim restriksi, sehingga menjadi fragmen DNA dengan enzim restriksi, sehingga menjadi fragmen DNA dengan panjang yang berbeda. Enzim restriksi yang biasa digunakan panjang yang berbeda. Enzim restriksi yang biasa digunakan
adalah
adalah HindIII, Pst I, Bgl II HindIII, Pst I, Bgl II dandan Rsa I,. Rsa I,. Dua organisme yangDua organisme yang berbeda mempunyai tempat pemotongan enzim yang tidak berbeda mempunyai tempat pemotongan enzim yang tidak sama, sehingga menghasilkan fragmen DNA dengan panjang sama, sehingga menghasilkan fragmen DNA dengan panjang yang berbeda pula
yang berbeda pula((7)7)
..
Tabel 1.
Tabel 1. Pola pemotongaPola pemotongan gen nukleotida n gen nukleotida (gen N) oleh enzim (gen N) oleh enzim restriksirestriksi untuk menentukan subgrup RSV pada produk PCR
untuk menentukan subgrup RSV pada produk PCR (2)(2)
Hasil pemotongan oleh enzim Hasil pemotongan oleh enzim Pola
Pola NP
NP Hae Hae III III RsaI RsaI BglII BglII PstI PstI Hind Hind IIIIII
Subgrup Subgrup RSV RSV NP1 NP1 - - + + - - - - - - BB NP2 NP2 + + + + - - - - - - AA NP3 NP3 - - + + + + - - - - BB NP4 NP4 + + + + + + - - - - AA NP5 NP5 + + + + + + - - + + AA NP6 NP6 - - + + + + - - - - BB NP7 NP7 - - - - - - + + - - BovineBovine NP8 NP8 - - - - - - + + + + Mice Mice PVPV NP9 NP9 - - + + + + - - + + BB NP10 NP10 + + + + + + - - - - AA Keterangan : Keterangan :
hasil + ; bila terjadi pemotongan fragmen DNA oleh enzim, hasil + ; bila terjadi pemotongan fragmen DNA oleh enzim, hasil
hasil -; bila tidak terjadi pemotongan fragmen DNA -; bila tidak terjadi pemotongan fragmen DNA oleh enzimoleh enzim