Sumber: http://classroom.sdmesa.edu/eschmid/Lab8-Biol210.htm
Oleh itu, bagi tujuan menganalisis kandungan DNA sutur katgut, Porcine Trace PCR Kit dari PKL telah digunakan bagi menjalankan PCR kerana teknik ini sudah cukup membantu untuk membezakan spesis haiwan yang dalam suatu campuran7 Pengesanan unsur porsin menggunakan kit ini adalah pantas, sensitif dan sangat memuaskan bagi sampel DNA yang diekstrak dalam masa 3jam.8
Secara teorinya, teknik ini menggunakan platform ujian multiplex-PCR yang hanya menggandakan 3 amplikon; salah satu digunakan sebagai kawalan eksternal. Amplikon tersebut adalah potongan gen spesifik untuk mengesan DNA khinzir (398bp), DNA vertebrata (359bp) dan DNA tumbuhan (303bp).9
Secara prinsipnya, kit ini mampu mengesan unsur pada produk daging (produk vertebrata); bertujuan membezakannya dengan produk tumbuhan. Namun
6 "PCR," http://classroom.sdmesa.edu/eschmid/Lab8-Biol210.htm.
7 S. Edris et al., "Conventional Multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR) Versus Real-Time PCR for Species-Specific Meat Authentication," Life Science Journal 9, no. 4 (2012). 5831.
8 Ng Yi Peng, "Porcine Trace PCR Kit Product Insert," ed. Profound Kestrel Laboratories(2013). 1.
memandangkan ia dioptimumkan khusus untuk hanya mengesan DNA khinzir, sensitiviti apabila digunakan untuk tujuan ini tidak sebaik tujuan mengesan unsur khinzir. Berikut merupakan prosedur PCR yang telah dijalankan pada DNA sutur:
1. Semua tiub perlu diputarkan.
2. 4µl primer mix dimasukkan ke dalam tiub mastermix.
3. 1µl Taq DNA Polimerase yang telah dicairkan turut dicampur.
4. Sekiranya perlu, 1µl kawalan amplifikasi dalaman boleh dicampurkan untuk memeriksa kesalahan negatif (false negative).
5. Sampel DNA yang diekstrak dipipet ke dalam tiub mastemix PCR dan dipenuhkan dengan air bebas nukelase sehingga mencapai 25µl isipadu total. 6. Kawalan negatif: 1 tiub diketepikan seperti tiada kawalan templat dengan hanya
menambahkan air sebagai templat.
7. Kawalan positif: 1 tiub diketepikan sebagai kawalan positif dengan menambahkan 1µl kawalan positif sebagai templat.
8. Campuran tindak balas mengandungi bahan-bahan seperti dalam Jadual 4.2.
Jadual 4.2 : Bahan-bahan untuk Tindak Balas PCR
Komponen Isipadu
(µL) 1x
Mastermix (1 tiub) 7
Campuran primer (Primer mix) 4
Taq DNA polimerase (dicairkan sehingga 1U/ µl) 1
Templat DNA (dengan atau tanpa 1µl DNA kawalan amplifikasi dalaman)*
1-5
Air bebas nuklease** 13-8
Isipadu total untuk 1 tindak balas 25
* Isipadu sampel DNA yang digunakan adalah 1µL.
** Isipadu tindak balas perlu dipenuhkan sehingga 25µl dengan air bebas nuklease. 9. Tiub PCR kemudian diputarkan.
Jadual 4.3 : Kitaran Termal PCR bagi Sutur Katgut10 Fasa Suhu (oC) Tempoh masa Bilangan kitaran PCR Mix Setup 94 4 minit - Denaturatio n 94 30 saat 40 kitaran Annealing 59 30 saat Extension 72 40 saat Elongation 72 5 minit - 10 ∞ Sumber: Ng Yi Peng.
11. 3% gel agarose disediakan.
4.5 Keputusan dan Perbincangan
Keputusan dan perbincangan mengenai kandungan material sutur dari perspektif sains diperjelaskan melalui hasil kuantiti, ketulenan dan saiz DNA dan juga imej gel elektroforesis yang terbentuk.
4.5.1 Kuantiti, Ketulenan, dan Saiz DNA
Sebagaimana yang dinyatakan di awal bab ini, memandangkan masih belum dibangunkan protokol pengekstrakan DNA bagi sutur, kajian ini telah membandingkan tiga teknik pengekstrakan sedia ada untuk menentukan teknik terbaik yang boleh diteruskan untuk sampel-sampel sutur lain.
Kualiti dan kualiti DNA dinilai melalui bacaan pada NanoDrop v1000 Spectrophotometer. Kuantiti DNA diwakili oleh bacaan min kepekatan DNA, sementara kualiti DNA pula diwakili oleh bacaan absorbans pada julat tertentu yang menunjukkan ketulenan DNA. Ketulenan DNA ditentukan dinilai berdasarkan bacaan nisbah ketumpatan optik atau optical density DNA (OD 260) dan ketumpatan optik protein
10 Ibid.
(OD 280). Nisbah kuantiti pada 260nm dan 280nm digunakan bagi menentukan ketulenan DNA dan secara umumnya, julat antara 1.8-2.0 diterima sebagai DNA yang ‘tulen’. Bacaan julat yang lebih rendah menunjukkan kehadiran protein, fenol atau bahan cemar yang lain.11 Saiz DNA pula dianalisis berdasarkan hasil elektroforesis terhadap sampel (5µL) di dalam 3% gel agarose yang dilumurkan dengan ethidium bromide (EtBr) dan divisualkan di bawah cahaya UV.
Jadual 4.4 menunjukkan kuantiti dan kualiti DNA yang terkumpul dari ketiga-tiga teknik pengekstrakan :
Jadual 4.4 : Kuantiti dan Kualiti DNA Sutur dari Tiga Metode Pengekstrakan Metode Pengekstrakan Min Kepekatan DNA (ng/µl) Ketulenan DNA A260/280 A260/230 Kit Tumbuhan 10.2 1.99 0.50 Kit Makanan 2.86 1.56 0.98 Konvensional 0.90 0.56 0.32
Sumber: Analisis pengkaji.
Bacaan dari Jadual 4.4 menunjukkan bahawa kepekatan DNA sutur bagi kesemua sampel, melainkan metode konvensional adalah di dalam julat yang boleh diterima untuk PCR. Hasil pengekstrakan DNA sutur menggunakan ketiga-tiga metode mendapati, pengekstrakan menggunakan Kit Tumbuhan menghasilkan kuantiti dan kualiti DNA yang terbaik berbanding metode pengekstrakan menggunakan Kit Makanan dan Konvensional. Oleh itu, metode pengekstrakan DNA menggunakan Kit Tumbuhan telah digunakan dengan beberapa pengubahsuaian bagi sampel sutur yang lain untuk mendapatkan bacaan DNA yang optimum.
Bacaan DNA sutur katgut yang terdiri daripada lima jenis sutur diringkaskan dalam Jadual 4.5.
Jadual 4.5 : Kuantiti dan Kualiti DNA Sutur Menggunakan Kit Tumbuhan
Sutur Kepekatan DNA Sutur A260/280
Katgut WMSB 4.538 1.614
Katgut kromik WMSB 4.195 1.699
Katgut Benz Medic 4.685 1.708
Katgut kromik DemeTech 3.056 1.720
Katgut kromik BBraun 3.333 1.715
4.5.2 Imej Gel Eletrophoresis
Setelah menjalani PCR, kandungan DNA sutur dianalisis melalui imej yang terhasil pada gambar gel elektropherosis. Saiz pasangan bes (bp) menentukan komposisi DNA sutur dengan spesifik. Intepretasi hasil eksperimen dibantu dengan merujuk Jadual 4.6.
Jadual 4.6 : Panduan Intepretasi Keputusan Eksperimen
Landasan Jalur Interpretasi Keputusan
1 100,200,300,400,500,600,700,800,900
dan 1000bp
100 bp DNA
2 398, 359 dan 303bp Sampel positif khinzir dan
tumbuhan
3 398 dan 359bp Sampel positif khinzir
4 303bp Sampel positif tumbuhan/
kawalan amplifikasi dalaman
5 359bp Sampel positif vertebrata
6 Tiada jalur Sampel negatif
Rajah 4.3 menunjukkan imej gel elektroforesis bagi sampel sutur katgut telah diekstrak menggunakan tiga metode pengekstrakan berbeza. L merupakan tangga 100bp; Landasan 1 mengandungi DNA porsin; Landasan 2 DNA tumbuhan; Landasan 3 terdiri daripada DNA vertebrata; Landasan 4 mengandungi campuran porsin dan tumbuhan; Landasan M adalah penanda porsin; Landasan 8-10 mengandungi hasil amplifikasi produk DNA dari Kit Tumbuhan; Landasan 11-13 mengandungi hasil amplifikasi produk DNA dari Kit Makanan; Landasan 14-16 mengandungi hasil amplifikasi produk DNA dari metode konvensional; Landasan 17 merupakan kawalan negatif.
Rajah 4.3 : Imej Gel Elektroforesis Menunjukkan Perbandingan Hasil Reaksi