3. BAHAN DAN METODE
3.4. Prosedur Analisis
Prosedur analisis yang digunakan pada penelitian ini adalah prosedur analisis kimia, meliputi proksimat, histamin, angka anisidin dan bilangan peroksida. Analisis mikrobiologi, meliputi ALT dan kapang.
3.4.1 Analisis kimia 1) Analisis proksimat
Analisis proksimat yang dilakukan meliputi uji kadar air dan abu dengan metode oven, uji kadar lemak menggunakan metode sokhlet, dan uji kadar protein menggunakan metode Kjeldahl. Kadar karbohidrat ditentukan dengan metode by difference.
a) Analisis kadar air (SNI-01-2354.2-2006)
Analisis kadar air dilakukan dengan metode oven. Prinsipnya adalah menguapkan molekul air (H2O) bebas yang ada dalam contoh. Kemudian contoh ditimbang sampai didapat bobot konstan yang diasumsikan semua air yang terkandung dalam contoh sudah diuapkan. Selisih bobot sebelum dan sesudah pengeringan merupakan banyaknya air yang diuapkan.
Prosedur analisis kadar air sebagai berikut: cawan porselin kosong dipanaskan di dalam oven selama 1 jam pada suhu 105oC, kemudian didinginkan dalam desikator untuk menghilangkan uap air dan ditimbang (A). Contoh ditimbang sebanyak 0,1 g dalam cawan yang sudah dikeringkan kemudian dioven pada suhu 105oC selama 2 jam lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang bobot cawan dan sampel (B). Cawan dan sampel dipanaskan lagi selama 2 jam pada suhu 105oC lalu didinginkan di dalam desikator dan ditimbang bobot cawan dan sampel (C). Tahap pemanasan dan penimbangan diulangi sampai didapat bobot yang konstan. Kadar air dihitung dengan rumus:
b) Analisis kadar abu (SNI 2354.1:2010)
Analisis kadar abu dilakukan menggunakan metode oven. Prinsipnya adalah pembakaran atau pengabuan bahan-bahan organik yang diuraikan menjadi air (H2O) dan karbondioksida (CO2) tetapi zat anorganik tidak terbakar. Zat anorganik ini disebut abu.
37
Prosedur analisis kadar abu sebagai berikut: cawan yang akan digunakan dipanaskan di dalam tanur selama 1 jam pada suhu 550oC, kemudian didinginkan dalam desikator untuk menghilangkan uap air dan ditimbang (A). Contoh ditimbang sebanyak 0,1 g dalam cawan yang sudah dikeringkan (B) dan dibakar sampai timbul asap. Cawan dipanaskan di dalam tanur pada suhu 550oC selama 2 jam, kemudian didinginkan di dalam desikator dan ditimbang bobot cawan dan sampel (C). Cawan dan sampel dipanaskan lagi selama 2 jam pada suhu 550oC lalu didinginkan di dalam desikator dana ditimbang bobot cawan dan sampel. Tahap pemanasan dan penimbangan diulangi sampai didapat bobot yang konstan. Kadar abu dihitung dengan rumus:
c) Analisis kadar lemak (SNI 01-2354.3-2006)
Analisis kadar lemak dilakukan dengan metode sokhlet. Prinsipnya adalah lemak yang terdapat dalam sampel diekstrak dengan menggunakan pelarut lemak non polar.
Prosedur analisis kadar lemak sebagai berikut: labu lemak yang akan digunakan dioven selama 30 menit pada suhu 100-105oC, kemudian didinginkan dalam desikator untuk menghilangkan uap air dan ditimbang (A). Sampel ditimbang sebanyak 2 gram (B) lalu dibungkus dengan kertas saring, ditutup dengan kapas bebas lemak dan dimasukkan ke dalam alat ekstraksi sokhlet yang telah dihubungkan dengan labu lemak yang telah dioven dan diketahui bobotnya. Pelarut heksana atau pelarut lemak lain dituangkan sampai sampel terendam dan dilakukan refluks atau ektraksi lemak selama 5-6 jam atau sampai palarut yang turun ke labu lemak berwarna jernih. Pelarut lemak yang telah digunakan disuling dan ditampung setelah itu ekstrak lemak yang ada dalam labu lemak dikeringkan dalam oven bersuhu 100-105oC selama 1 jam, lalu labu lemak didinginkan dalam desikator dan ditimbang (C). Tahap pengeringan labu lemak diulangi sampai diperoleh bobot yang konstan. Kadar lemak dihitung dengan rumus:
d) Analisis kadar protein (SNI 01-2354.4-2006)
Analisis kadar protein dilakukan dengan metode kjeldahl. Prinsipnya adalah oksidasi bahan-bahan berkarbon dan konversi nitrogen menjadi amonia oleh asam sulfat, selanjutnya amonia bereaksi dengan kelebihan asam membentuk amonium sulfat. Amonium sulfat yang terbentuk diuraikan dan larutan dijadikan basa dengan NaOH. Amonia yang diuapkan akan diikat dengan asam borat. Nitrogen yang terkandung dalam larutan ditentukan jumlahnya dengan titrasi menggunakan larutan baku asam.
Prosedur analisis kadar protein sebagai berikut: sampel ditimbang sebanyak 0,1-0,5 g, dimasukkan ke dalam labu kjeldahl 100 mL, ditambahkan dengan 1/2 buah tablet kjeltab, kemudian didestruksi (pemanasan dalam keadaan mendidih) sampai larutan menjadi hijau jernih dan SO2 hilang. Larutan dibiarkan dingin dan dipindahkan ke labu 50 mL dan diencerkan dengan akuades sampai tanda tera, dimasukkan ke dalam alat destilasi, ditambah dengan 5-10 mL NaOH 30-33% dan dilakukan destilasi. Destilat ditampung dalam larutan 10 mL asam borat 3% dan beberapa tetes indikator (larutan bromcresol green 0,1% dan larutan metil merah 0,1% dalam alkohol 95% secara terpisah dan dicampurkan antara 10 mL bromcresol green dengan 2 mL metil merah) kemudian dititrasi dengan larutan HCl 0,02 N sampai larutan berubah warnanya menjadi merah muda. Kadar protein dihitung dengan rumus:
Keterangan:
A = volume HCl untuk titrasi blanko B = volume HCl untuk titasi sampel (mL)
C = normalitas HCl yang digunakan (0,02374 N) D = bobot sampel (mg)
FK = faktor konversi (6,25 untuk produk perikanan) e) Karbohidrat (SNI 01-2891-1992)
Perhitungan kadar karbohidrat dilakukan menggunakan metode by difference yaitu pengurangan 100 % dengan jumlah dari hasil empat komponen yaitu kadar air, protein, lemak, dan abu. Perhitungannya sebagai berikut:
39
2) Analisis histamin (SNI 2354.10: 2009)
Penentuan histamin dilakukan secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Prosedur analisis metode KCKT adalah contoh diblender hingga homogen. Contoh ditimbang seksama lebih kurang 50 g pada gelas piala, ditambahkan 100 mL TCA 10% kemudian diblender. Contoh yang telah diblender dipindahkan ke dalam tabung reaksi 50 mL, disentrifugasi pada 3.500 rpm selama 10 menit. Supernatan contoh disaring dengan membran filter 0,45 μm kemudian disimpan pada suhu refrigerator (±4°C), selanjutnya diderivatisasi. Supernatant yang telah diderivatisasi dipipet masing-masing 135 μL larutan baku kerja dan filtrat contoh, dimasukkan ke dalam tabung reaksi 10 mL, ditambahkan masing- masing ke dalam larutan baku kerja dan filtrat contoh berturut-turut, 86 mL air pro KCKT kemudian divortex, 0,4 mL NaOH 1 N dibiarkan selama 1 menit, dan 0,1 mL larutan OPA divortex dan dibiarkan selama 4 menit, serta 0,2 mL HCl 3 N lalu divortex. Contoh yang telah divortex dimasukkan ke vial dan siap untuk diinjeksikan ke kromatograf. Selanjutnya dilakukan pengerjaan blanko 1,86 μL Larutan Asam Trikloroasetat (TCA) 10% pengganti contoh dan dikerjakan seperti pengerjaan contoh. Larutan blanko baku, baku kerja dari konsentrasi terendah, blanko pereaksi, dan contoh diinjeksikan ke dalam kromatograf secara berurutan. Area puncak kromatogram utama dari masing-masing larutan yang diinjeksikan direkam.
Perhitungan
Keterangan:
AC = Area contoh;
ABPr = Area blanko pereaksi; AS = Area baku;
ABs = Area blanko baku;
Cstd = Konsentrasi baku (μg/mL); VA = Volume akhir (mL); W = Berat contoh (g).
3) Bilangan peroksida (SNI 01.2347. 1991)
Penentuan bilangan peroksida biasanya didasarkan pada pengukuran sejumlah Iod yang dibebaskan dari potassium Iodida melalui reaksi oksidasi oleh peroksida dalam lemak/minyak pada suhu ruang di dalam medium asam asetat/kloroform. Prosedur penentuan bilangan peroksida yaitu sampel minyak sebanyak 5 g dimasukkan ke dalam 250 mL erlenmeyer dan ditambahkan 30 mL pelarut, dikocok sampai semua contoh minyak larut. Kemudian ditambahkan potassium iodida jenuh dan didiamkan selama 2 menit di ruang gelap sambil digoyang. Contoh ditambahkan air destilasi dan larutan amilum sebanyak 1 mL. Kelebihan iod dititer dengan larutan sodium tiosulfat 0,01 N. Bilangan peroksida dihitung dengan rumus :
Dimana :
A = mL sodium tiosulfat
N = Normalitas sodium tiosulfat 3.4.2 Analisis mikrobiologi
1) Penentuan angka lempeng total (ALT) (SNI 19-2897-1992)
Pengenceran sampel dilakukan secukupnya (sampai 10-5) sebelum dibiakkan dalam nutrien agar. 1 mL dari setiap pengenceran dimasukkan ke dalam cawan petri steril (dilakukan secara duplo), selanjutnya ditambahkan 12–15 mL PCA yang sudah dingin ke dalam cawan petri yang berisi sampel dan dilakukan pemutaran cawan secara sempurna. Cawan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC. Perhitungan koloni bakteri pada cawan dilakukan setelah inkubasi. Perhitungan jumlah bakteri total: jumlah bakteri per gram sampel dapat dihitung berdasarkan jumlah yang layak dihitung (25-250 koloni) pada cawan
2) Analisis kapang (SNI 01-2332.7-2006)
Sampel secara aseptik ditimbang sebanyak 25 g kemudian dimasukkan dalam wadah atau plastik steril. Sebanyak 225 mL larutan butterfield’s phospate buffered ditambahkan ke dalam sampel, dihomogenkan selama 2 menit. Homogenat ini merupakan larutan pengencer 10-1 dengan menggunakan pipet steril homogenate diambil 1 mL dan dimasukkan ke dalam 9 mL sampel dari pengenceran 10-2. Pengenceran selanjutnya dilakukan dengan mengambil 1 mL
41
sampel dari pengenceran 10-2 ke dalam 9 mL larutan butterfield’s phospate buffered dan seterusnya. Sebanyak 1 mL dari setiap pengenceran 10-1, 10-2, dan seterusnya dimasukkan ke dalam cawan petri steril. Sampel dilakukan secara duplo untuk setiap pengenceran, selanjutnya ditambahkan 12–15 mL PDA yang sudah didinginkan sampai suhu (45±1)°C ke dalam masing-masing cawan yang sudah berisi sampel. Agar sampel dan media PDA tercampur sempurna dilakukan pemutaran cawan ke depan-ke belakang dan ke kiri- ke kanan. Cawan diinkubasi dalam posisi terbalik selama 48 jam ±2 jam pada suhu 35°C setelah agar menjadi padat.