III. METODOLOGI PENELITIAN
3.3 PROSEDUR ANALISIS
3.3.1
Analisis Kadar Air Metode Oven (SNI, 1992 yang Dimodifikasi)
Sejumlah sampel (1-2 g) dimasukkan ke dalam cawan yang telah diketahui beratnya. Kemudian cawan dimasukkan ke dalam oven bersuhu 105 oC hingga diperoleh berat yang konstan. Perhitungan kadar air dilakukan berdasarkan berat basah menggunakan rumus :
Kadar air = (a - b) c ×100% Dimana :
a = berat cawan dan sampel awal (g) b = berat cawan dan sampel akhir (g) c = berat sampel awal (g)
3.3.2
Analisis Kadar Protein Metode Kjeldahl (AOAC, 1995 yang Dimodifikasi)
Sejumlah sampel (100-250 mg) ditimbang ke dalam labu Kjeldahl. Kemudian ditambahkan 1.9 ± 0.1 g K2SO4 , 40 ± 10 mg HgO dan 2 ± 0.1 ml H2SO4. Sampel dididihkan selama 1-1.5 jam dengankenaikan suhu secara bertahap sampai cairan menjadi jernih, lalu didinginkan. Sejumlah kecil akuades diteteskan secara perlahan lewat dinding labu, kemudian labu digoyang pelan agar kristal yang terbentuk larut kembali. Isi labu kemudian dipindahkan ke dalam alat destilasi dan labu dibilas 5-6 kali dengan 1-2 ml akuades. Selanjutnya ditambahkan 8-10 ml larutan 60% NaOH-5% Na2S2O3 ke
dalam alat destilasi. Erlenmeyer yang berisi 5 ml H3BO3 dan 2 tetes indikator metilen red-metilen blue
diletakkan di bawah kondensor dengan kondisi ujung kondensor terendam di bawah larutan H3BO3.
Destilasi dilakukan hingga diperoleh destilat sebanyak ± 15 ml. Destilat yang diperoleh selanjutnya diencerkan hingga ± 50 ml dan dititrasi dengan HCl terstandar sampai terjadi perubahan warna menjadi abu-abu. Perhitungan kadar protein dilakukan dengan rumus :
% N = (mL HCl - mL blanko)
mg sampel × N HCl ×14.007 ×100 Kadar protein g
100g bahan basah = % N × Faktor konversi
3.3.3
Analisis pH dan Transmitan Whey Pres (Moizuddin et al., 1999)
Tingkat keasaman whey hasil pengepresan curd diukur menggunakan pH meter pada suhu ruang, sedangkan % transmitan (%T) whey diukur secara spektrofotometri pada panjang gelombang 400 nm.
3.3.4
Pelarutan Protein (Mujoo et al., 2003 yang Dimodifikasi)
Pelarutan atau ektraksi protein terhadap tepung kedelai dan curd dilakukan setelah penghilangan kandungan lemak yang terdapat dalam sampel. Sebanyak 20 mg sampel tepung kedelai atau curd yang telah dihilangkan lemaknya dilarutkan/diekstraksi menggunakan pelarut protein (Buffer Tris [Tris(hydroxymethyl)aminomethane] pH 8.4 yang mengandung 0.02 M β- mercaptoethanol) dalam tiga tahap sehingga diperoleh larutan atau supernatan protein. Sampel diekstrak dengan 500 µL larutan pengekstrak, kemudian divorteks dan diinkubasi dengan water bath
(Napco®) pada suhu 80 oC selama 1 jam. Selama proses inkubasi, larutan divorteks selama 1 menit tiap 10 menit. Setelah itu larutan disentrifugasi (Hettich Zentifugen, mikro 22R) dengan kecepatan 15000 rpm selama 20 menit pada suhu 25 oC. Supernatan yang diperoleh kemudian dimasukkan ke
20 dalam tabung mikro sebagai larutan stok protein. Sisa protein yang belum terekstrak (endapan) diekstraksi kembali pada tahap 2 dan 3. Diagram alir ekstraksi protein dapat dilihat pada Gambar 9.
Gambar 9. Diagram alir ekstraksi protein modifikasi Mujoo et al. (2003) 0.5 mL pelarut buffer Tris pH 8.4 yang mengandung 0.02 M 2-Merkaptoetanol 0.5 mL pelarut buffer Tris pH 8.4 yang mengandung 0.02 M 2-Merkaptoetanol 0.5 mL pelarut buffer Tris pH 8.4 yang mengandung 0.02 M 2-Merkaptoetanol
20 mg sampel bebas lemak
Homogenisasi (vorteks, 1 menit)
Inkubasi pada penangas air suhu 80 oC selama 1 jam (vorteks setiap 10 menit selama 1 menit)
Sentrifugasi
(20 menit, 25 oC, 15000 rpm)
Endapan
Homogenisasi (vorteks, 1 menit)
Inkubasi pada penangas air suhu 80 oC selama 1 jam (vorteks setiap 20 menit selama 1 menit)
Sentrifugasi
(20 menit, 25 oC, 15000 rpm)
Endapan
Homogenisasi (vorteks, 1 menit)
Inkubasi pada penangas air suhu 80 oC selama 40 menit (vorteks setiap 20 menit selama 1 menit)
Sentrifugasi (20 menit, 25 oC, 15000 rpm) Endapan Supernatan Larutan Stok Supernatan Supernatan
21
3.3.5
Analisis Kadar Protein Metode Bradford (Bradford, 1976)
a. Preparasi pereaksi Bradford
Sebanyak 100 mg pewarna CBB G-250 dilarutkan ke dalam 50 mL etanol 95%. Selanjutnya ditambahkan 100 mL asam fosforat 85% dan ditepatkan hingga 1 L menggunakan akuades. Larutan kemudian disaring menggunakan kertas Whatman No.1, kemudian disimpan dalam botol gelap dan suhu refrigerasi.
b. Pembentukan kurva standar
Sebanyak 100 µL larutan BSA (100-1000 µg/mL) dipipet ke dalam tabung reaksi berukuran 1.2 x 10 cm. Kemudian ditambahkan 5 mL pereaksi Bradford. Larutan kemudian divorteks dan diukur secara spektrofotometri pada λ= 595 nm setelah 5 menit. Untuk blanko, sebanyak 100 µL akuades ditambahkan 5 mL perekasi Bradford dan diukur dengan cara yang sama. Kurva standar yang diperoleh digunakan untuk mengukur konsentrasi sampel.
c. Pengukuran sampel
Sebanyak 100 µL sampel dipipet ke dalam tabung reaksi berukuran 1.2 x 10 cm. Kemudian ditambahkan 5 mL pereaksi Bradford. Larutan kemudian divorteks dan diukur secara spektrofotometri pada λ= 595 nm setelah 5 menit.
3.3.6
Analisis SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Bollag dan Edelstein,
1991)
Analisis SDS-PAGE dilakukan menggunakan gel akrilamid dengan konsentrasi separating gel
12% dan stacking gel 5%. Sampel yang dielektroforesis adalah supernatan protein hasil ekstraksi protein dari sampel curd kedelai. Tahapan yang harus dilakukan dalam analisis SDS-PAGE adalah 1) pembuatan separating gel; 2) pembuatan stacking gel; 3) preparasi dan injeksi sampel; 4) running
SDS-PAGE; 5) pewarnaan gel; 6) destaining gel; dan 7) penentuan berat molekul protein-protein yang terpisahkan. Pembuatan larutan stok dan larutan kerja untuk analisis SDS-PAGE dapat dilihat pada Lampiran 1.
a. Pembuatan separating gel
Dua lempengan kaca (mini slab) yang akan digunakan sebagai cetakan gel dirangkai sesuai dengan petunjuk pemakaian. Sebanyak 4 mL larutan A dipipet ke dalam gelas piala, kemudian ditambahkan 2.5 mL larutan B dan 3.5 mL akua-biodestilat. Campuran tersebut kemudian diaduk perlahan dengan menggoyangkan gelas piala. Selanjutnya, sebanyak 50 µL APS 10% dan 5 µ L TEMED ditambahkan ke dalam campuran dan diaduk kembali dengan perlahan. Campuran dimasukkan ke dalam lempengan kaca (mini slab) tanpa menimbulkan gelembung udara dengan menggunakan mikropipet sampai sekitar 1 cm dari atas lempengan. Bagian yang tidak diisi gel diberi akuades untuk meratakan gel yang terbentuk. Gel kemudian dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30 - 60 menit.
b. Pembuatan stacking gel
Air dibuang dari atas separating gel dan dikeringkan dengan menggunakan tisu. Akua- biodestilat, larutan A, dan larutan C masing-masing sebanyak 2.3 mL, 0.67 mL, dan 1.0 mL dicampurkan ke dalam gelas piala dan diaduk perlahan dengan menggoyangkan gelas piala. Selanjutnya, sebanyak 30 µ L APS 10% dan 5 µ L TEMED ditambahkan ke dalam campuran dan diaduk kembali dengan perlahan. Kemudian sisir dimasukkan dengan cepat tanpa menimbulkan gelembung udara. Stacking gel dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30-60 menit. Setelah gel berpolimerisasi, sisir diangkat dari atas gel dengan perlahan dan slab ditempatkan ke dalam
22 wadah elektroforesis. Buffer elektroforesis dimasukkan ke wadah elektroforesis di bagian dalam dan luar agar gel terendam.
c. Preparasi dan injeksi sampel
Sebanyak 40 µL sampel dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf dan ditambahkan 10 µL buffer sampel. Tabung kemudian dipanaskan selama 5 menit dalam air mendidih 100 oC. Sampel kemudian siap diinjeksikan ke dalam sumur menggunakan mikropipet. Mikropipet dibilas menggunakan akuades setiap kali ingin memasukkan sampel lain. Pada salah satu sumur, ditempatkan sebanyak 7 µL protein marker.
d. Running SDS-PAGE
Katup elektroda dipasang dengan arus mengalir ke anoda. Sumber listrik dinyalakan dan dijaga konstan pada 70 V. Running dilakukan selama 180 menit sampai migrasi dye tersisa sekitar 0.5 cm dari dasar. Setelah selesai, aliran listrik dimatikan dan katup elektroda dilepaskan, lalu plat gel dipindahkan dari elektroda.
e. Pewarnaan gel
Gel diangkat dari slab dan dipindahkan ke dalam wadah tertutup yang telah berisi pewarna coomassie brilliant blue (kurang lebih 20 mL). Kemudian digoyang-goyangkan sesekali selama 5-10 menit.
f. Destaining gel
Gel diangkat dan dicuci menggunakan akuades beberapa kali. Larutan penghilang warna ditambahkan (destaining solution) dan digoyangkan sesekali hingga latar belakang pita protein menjadi terang. Selanjutnya, larutan penghilang warna dibuang dan gel siap dianalisis.
g. Penentuan berat molekul protein yang terpisahkan
Berat molekul protein sampel dapat dihitung dari persamaan regresi antara mobilitas relatif protein marker (penanda protein) dan logaritma dari berat molekul marker yang telah diketahui.
Mobilitas relatif protein dihitung dengan membandingkan jarak migrasi protein, diukur dari garis awal separating gel sampai ujung pita protein, dan jarak migrasi tracking dye. Mobilitas relatif tersebut dirumuskan sebagai:
Rf = Jarak migrasi protein Jarak migrasi tracking dye
3.3.7
Analisis Densitas Pita Protein
Densitas dari pita protein yang terlihat dalam gel dianalisis dengan software ImageJ 1.42q dari Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA (http://rsb.info.nih.gov/ij). Gel Doc (Bio-Rad) digunakan untuk memperoleh foto gel dalam bentuk digital untuk kemudian dianalisis dengan
software ImageJ 1.42q.
3.3.8
Analisis Tekstur Curd secara Objektif
Tekstur curd dianalisis dengan metode Texture Profile Analysis (TPA) menggunakan alat TA- XT2i. Setting alat TA-XT2i untuk pengukuran TPA curd dapat dilihat pada Tabel 5.
Pengukuran sampel curd dilakukan sebanyak empat kali dari empat titik yang berbeda. Sampel
curd yang akan diukur dipotong berbentuk silinder dengan diameter ±1 cm. Sampel dianalisis menggunakan probe P/100 dengan diameter 100 mm. Parameter yang diukur menggunakan metode TPA adalah kekerasan, kohesivitas, dan daya kunyah.
23 Tabel 5. Setting TA-XT2i untuk pengukuran TPA curd
3.3.9
Analisis Kekerasan Curd secara Subjektif
Analisis kekerasan curd secara subjektif dilakukan dengan memplotkan nilai kekerasan curd objektif pada persamaan kurva standar kekerasan curd komersial. Kurva ini diperoleh dari pengujian sederetan curd komersial dengan berbagai tingkat kekerasan menggunakan panelis terlatih dalam bidang kekerasan curd. Pengujian kekerasan curd dilakukan menggunakan telunjuk dan ibu jari panelis terlatih. Panelis terlatih ini diperoleh dari proses seleksi dan pelatihan calon panelis terpilih.
Serangkaian uji segitiga terhadap kekerasan curd dilakukan dalam beberapa tahap untuk menyeleksi panelis. Selanjutnya, calon panelis terlatih diberikan pelatihan mengenai pengujian kekerasan curd menggunakan telunjuk dan ibu jari. Pelatihan yang dilakukan meliputi teknik pengujian, penyamaan persepsi kekerasan, penentuan sampel referen, dan teknik penilaian organoleptik. Dalam pelatihan panelis, dilakukan uji rating 3 sampai 4 sampel curd komersial terhadap sampel referen hingga diperoleh konsistensi panelis pada penilaian sampel tahu komersial. Selanjutnya, panelis diminta menguji lebih banyak (6) sampel curd komersial mentah menggunakan uji rating skala garis (15 cm) dari sangat lunak (ujung kiri) dan sangat keras (ujung kanan). Kuesioner uji rating penekanan sampel curd dapat dilihat pada Lampiran 3. Pengolahan data uji penekanan menggunakan bantuan program statistik SPSS 15.0.