BAB III METODOLOGI PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Sebanyak 5 kg kelopak bunga rosella segar dicuci dengan air hasil destilasi mengalir sebanyak tiga kali. Kelopak bungga rosella yang dimaserasi dengan 5 L metanol pro analiss dengan menggunakan ultraturrax dan dibiarkan pada suhu ruangan selama 2 hari. Hasil maserasi disaring dengan menggunakan penyaring Buchner dengan kertas saring Whatman No.1. hasil filtrat di rotary evaporator pada suhu 40ºC, dan disimpan pada wadah PE yang telah dilapisi alumunium foil pada suhu -4 ºC. Ekstraksi kelopak bunga rosella dilakukan oleh Sanjayadi.
2. Karakterisasi fisika-kimia ekstrak kelopak bunga rosella
Ekstrak yang diperoleh dari Sanjayadi dilakukan karakterisasi secara organoleptis, pengukuran pH, dan kandungan kimia dengan menggunakan spektrofotometer visibel.
3. Penetapan bobot tetap ekstrak kelopak bunga rosella
Sebanyak 500 µ L ekstrak metanol rosella diuapkan dalam cawan porselin kering yang telah ditimbang dengan menggunakan waterbath pada suhu 40-50ºC kemudian ditimbang kembali hingga memperoleh bobot dua kali berturut tidak lebih dari 0,5 mg tiap gram sisa yang ditimbang (Depkes RI, 1975).
4. Optimasi multiemulsi A/M/A
a. Optimasi HLB emulsi primer A/M
Emulsi primer dibuat dengan menggunakan komposisi Span 80® dan Tween 80® dengan HLB 5; 5,3; 5,5; dan 5,8. HLB optimal dipilih berdasarkan persentase pemisahan dari 25 ml emulsi A/M selama 24 jam penyimpanan.
b. Optimasi kecepatan pencampuran emulsi A/M
Pembuatan emulsi A/M dilakukan dengan pembuatan emulsi A/M dengan kecepatan mixer 4 dan 5. Kecepatan optimal dipilih berdasarkan persentase pemisahan dari 25 mL selama 24 jam penyimpanan.
c. Optimasi setil alkohol sebagai stiffening agent
Setil alkohol yang merupakan komponen fase minyak dioptimasi dengan konsentrasi 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 8; dan 10%. Konsentrasi setil alkohol
optimal dipilih dengan melihat persentase pemisahan dari 25 mL emulsi A/M selama 24 jam.
d. Optimasi dimethicone sebagai antifoaming agent
Konsentrasi dimethicone yang dioptimasi adalah 2; 4; 6; dan 8%. Konsentrasi dimethicone optimal dipilih dengan melihat kestabilan dari persentase pemisahan dari 25 mL emulsi A/M selama 24 jam.
e. Optimasi rasio fase emulsi primer A/M dalam multiemulsi A/M/A
Emulsi primer A/M yang ditambahkan dalam multiemulsi A/M/A dioptimasi sejumlah 27,8; 37,8; dan 47,8 g. Jumlah optimal emulsi primer A/M yan dimasukkan dalam multiemulsi A/M/A dipilih berdasarkan persentase pemisahan minimal dari 25 mL yang dihasilkan setelah penyimpanan 24 jam.
f. Optimasi konsentrasi Tween 80® dalam multiemulsi A/M/A
Surfaktan pada multiemulsi A/M/A berupa Tween 80® dioptimasi dengan konsentrasi 2; 4; dan 6%. Konsentrasi surfaktan optimal dipilih berdasarkan persentase pemisahan dari 25 mL multiemulsi A/M/A selama penyimpanan 24 jam.
g. Optimasi lama pencampuran multiemulsi A/M/A
Waktu pencampuran multiemulsi A/M/A yang dioptimasi adalah 10; 12; dan 15 menit dengan kecepatan mixer 1. Pemilihan lama pencampuran optimal dipilih berdasarkan persentase pemisahan dari 25 mL multiemulsi A/M/A selama 24 jam.
5. Cara pembuatan multiemulsi A/M/A hasil optimasi a. Pembuatan emulsi primer A/M
Ekstrak kental metanol Rosella yang telah diuapkan, Tween 80®, dan MgSO4 dilarutkan dalam aquadest internal. Span 80®, setil alkohol, dan dimethicone dilarutkan dalam parafin cair yang merupakan fase minyak. Kedua fase tersebut dipanaskan hingga suhu 50º±3C, fase air kemudian ditambahkan sedikit demi sedikit ke dalam fase minyak, diaduk selama 10 menit dengan menggunakan mixer dengan dialiri gas nitrogen. b. Pembuatan multiemulsi A/M/A
Tween 80® dan xanthan gum dilarutkan dalam aquadest sekunder hingga homogen sebagai fase air eksternal. Emulsi primer (A/M) dan fase air yang telah tercampur masing-masing dipanaskan hingga 50ºC. Emulsi primer ditambahkan sedikit demi sedikit dalam fase air yang telah mengandung Tween 80® dan xanthan gum sambil dicampur dengan menggunakan mixer selama 10 menit dengan dialiri gas nitrogen.
Multiemulsi A/M/A disimpan pada kondisi penyimpanan kontrol dan perlakuan. Multiemulsi A/M/A kontrol disimpan pada suhu 27 ºC dalam flakon yang telah dilapisi aluminium foil dan tanpa penjenuhan nitrogen ini ditutup rapat dengan parafilm. Multiemulsi A/M/A perlakuan disimpan pada suhu -4ºC dalam flakon yang telah dilapisi aluminium foil dan telah dijenuhkan dengan nitrogen, kemudian ditutup rapat dengan parafilm.
6. Evaluasi sediaan multiemulsi A/M/A a. Pengamatan organoleptis
Multiemulsi A/M/A kontrol dan perlakuan diamati bau, warna, dan homogenitas pada hari ke 1, 3, 7, 14 dan 28 setelah pembuatan. b. Penetapan pH
Sejumlah multiemulsi A/M/A dioleskan pada kertas indikator pH universal dan dibandingkan dengan warnanya dengan standar (Direktrorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1975).
c. Penentuan tipe emulsi
Pengujian fase dilakukan dengan memasukkan sejumlah emulsi primer A/M dan multiemulsi A/M/A ke dalam air dan minyak. Tipe A/M ditunjukkan apabila secara visual emulsi primer atau multiemulsi A/M/A larut dalam fase minyak dan tidak larut dalam fase air. Sedangkan tipe M/A ditunjukkan apabila emulsi primer atau multiemulsi A/M/A larut dalam air dan tidak larut dalam minyak (Billany, 2001). Air yang digunakan berupa aquadest dan fase minyak berupa parafin cair.
d. Pengukuran mikromeritik
Sampel multiemulsi A/M/A pada hari pertama, multiemulsi A/M/A perlakuan hari ke 28 dan multiemulsi A/M/A kontrol pada hari ke 28 dioleskan pada preparat cekung, lalu diletakkan pada meja objek mikroskop cahaya yang dilengkapi dengan lensa okuler mikrometer yang telah terkalibrasi dan seperangkat kamera (Martin, Swarbrick, dan Cammarata, 1990). Ukuran droplet multiemulsi A/M/A diamati dengan
menggunakan mikroskop dengan perbesaran 400 kali yang terhubung dengan software OptiLab, ukuran partikel diperoleh dengan mengukur diameter partikel menggunakan sofware ImageJ.
e. Uji mekanik
Sediaan multiemulsi A/M/A dimasukkan kedalam tabung sentrifugasi, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 20 menit. Hasil sentrifugasi diamati dengan melihat ada atau tidaknya pemisahan fase dari 25 mL multiemulsi A/M/A (Mahmmod, Akhtar, dan Manickam, 2014).
f. Uji persentase creaming
Multiemulsi A/M/A dengan kondisi penyimpanan kontrol dan perlakuan ditempatkan tabung reaksi berskala kemudian diamati secara berkala selama rentang waktu pengujian apabila terjadi perubahan tinggi akibat pemisahan. Multiemulsi A/M/A kontrol disimpan pada suhu 27ºC tanpa pemberian gas nitrogen dan multiemulsi A/M/A perlakuan disimpan pada suhu -4ºC dengan penambahan gas nitrogen. Tabung reaksi berskala 25 mL ditempatkan dalam wadah tertutup rapat dan terlindung dari cahaya (Billany, 2001).
7. Evaluasi sediaan suspensi liposom
Suspensi liposom yang diperoleh dari Sanjayadi disimpan pada suhu 4ºC selama 14 hari dengan wadah terbungkus dengan alluminium foil agar terlindung dari cahaya.
a. Pengamatan organoleptis
Suspensi liposom diamati bau, warna, dan homogenitas pada hari ke-1 dan 14 setelah pembuatan.
b. Penetapan pH
Sejumlah suspensi liposom dioleskan pada kertas indikator pH universal dan dibandingkan dengan warnanya dengan standar (Direktrorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1975).
c. Pengukuran mikromeritik
Sampel suspensi liposom pada hari pertama dioleskan pada preparat cekung, lalu diletakan pada meja objek mikroskop cahaya yang dilengkapi dengan lensa okuler mikrometer yang telah terkalibrasi dan seperangkat kamera (Martin dkk., 1993). Ukuran droplet suspensi liposom diamati dengan menggunakan mikroskop dengan perbesaran 400 kali yang terhubung dengan software OptiLab, ukuran partikel diperoleh dengan mengukur diameter partikel menggunakan sofware ImageJ.
8. Pembuatan kurva baku
a. Kurva baku ekstrak kelopak bunga rosella dengan pelarut metanol
Pembuatan kurva baku dilakukan dengan membuat larutan stok kemudian diencerkan dan diukur. Larutan stok diambil dari 100 µ L ekstrak kental rosella dilarutkan dalam metanol pro analisis dan encerkan ke dalam labu takar 25 mL hingga batas tanda. Larutan stok diambil sejumlah 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1; 2; 3; 4; dan 5 mL larutan kemudian
dilarutkan dengan metanol pro analisis ke dalam labu takar 10 mL, lalu di encerkan hingga batas tanda.
b. Kurva baku ekstrak kelopak bunga rosella dengan pelarut aquadest
Pembuatan kurva baku dilakukan dengan membuat larutan stok kemudian diencerkan dan diukur. Larutan stok diambil dari 100 µ L ekstrak kental rosella dilarutkan dalam aquadest dan encerkan dalam labu takar 10 mL hingga batas tanda. Larutan stok diambil sejumlah 0,08 ; 0,09; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; dan 1 mL, larutan kemudian dilarutkan dengan aquadest dalam labu takar 5 mL, dan diencerkan hingga batas tanda
c. Kurva baku ekstrak kelopak bunga rosella : Triton X-100 10% (1:1) dengan pelarut metanol
Pembuatan kurva baku dilakukan dengan membuat larutan stok kemudian diencerkan dan diukur. Larutan stok diambil dari 100 µ L ekstrak kental kelopak bunga rosella dilarutkan dalam aquadest dan encerkan ke dalam labu takar 10 mL hingga batas tanda. Larutan stok diambil sejumlah 0,08; 0,09; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; dan 1 mL, dan larutan ditambahkan Triton X-100 10% (1:1) dan metanol pro analisis dalam labu takar 5 mL, dan diencerkan hingga batas tanda.
9. Optimasi Preparasi Multiemulsi A/M/A
a. Optimasi lama ultrasonifikasi multiemulsi A/M/A ekstrak kelopak bunga rosella
Sebanyak 8,5 g multiemulsi AM/A dilakukan ultrasonifikasi selama 0; 15; dan 30 menit. Bagian supernatan diambil dan ditambahkan metanol pro analisis 5 mL dan disentrifugasi selama 20 menit. Hasil tinggi spektra derivat optimum yang dihasilkan kemudian digunakan sebagai lama ultrasonifikasi pada multiemulsi A/M/A untuk memperoleh ekstrak kelopak bunga rosella dalam total sediaan dan hasil minimun digunakan untuk memperoleh ekstrak kelopak bunga rosella yang berada pada fase luar multiemulsi A/M/A.
b. Optimasi lama sentrifugasi sediaan multiemulsi A/M/A
Sebanyak 8,5 g multiemulsi A/M/A di ultrasonifikasi selama 30 menit. Multiemulsi A/M/A tersebut selanjutnya sentrifugasi selama 0; 20; dan 40 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Lama sentrifugasi optimum ditentukan dari volume supernatan multiemulsi A/M/A optimum.
c. Optimasi volume metanol pada supernatan sediaan multiemulsi A/M/A ekstrak kelopak bunga rosella
Bagian supernatan multiemulsi A/M/A di tambahkan metanol dengan volume 1; 3; 4; dan 5 mL kemudian di-vortex. Volume metanol optimum ditentukan dari tingkat kejernihan setelah di sentrifugasi selama 10 menit.
d. Optimasi lama sentrifugasi supernatan yang telah ditambahkan metanol Bagian supernatan yang telah ditambahkan metanol dan di vortex, selanjutnya di sentrifugasi selama 10 dan 20 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Lama sentrifugasi optimum ditentukan dari volume optimum supernatan yang telah jernih.
10. Preparasi multiemulsi A/M/A
a. Preparasi sampel penetapan laju disipasi dan entrapment efficiency multiemulsi A/M/A
Laju disipasi dan entrapment efficeincy diukur dengan melakukan pemisahan terhadap antosianin ekstrak kelopak rosella total dan yang berada pada fase luar multiemulsi A/M/A dengan cara sentrifugasi. Sebanyak 8,5 g multiemulsi A/M/A yang mengandung ekstrak kelopak bunga rosella diultrasonifikasi selama 30 menit, kemudian disentrifugasi selama 40 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Bagian supernatan dari hasil sentrifugasi diambil kemudian ditambahkan 5 mL metanol pro analisis. kemudian di-vortex dan di sentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Hasil sentrifugasi kemudian diambil dan ditambahkan pada labu takar 10 mL dan dianalisis dengan menggunakan spektrofotometer visibel metode derivatisasi. Jumlah antosianin ekstrak kelopak bunga rosella yang berada di fase luar multiemulsi A/M/A dilakukan dengan cara yang sama tanpa ultrasonifikasi.
b. Penetapan laju disipasi pada multiemulsi A/M/A
Laju disipasi ditetapkan dengan slope (b) persamaan y = bx+a fungsi ln dari jumlah antosianin ekstrak kelopak bunga rosella total dan berada pada fase luar multiemulsi A/M/A ada rentang pengujian yaitu 1, 3, 7, 14 dan 28 hari. Penetapan laju disipasi dilakukan pada multiemulsi dengan kondisi penyimpanan kontrol dan perlakuan.
c. Penetapan entrapment efficiency multiemulsi A/M/A
Entrapment efficiency diukur dengan menghitung selisih jumlah antosianin total ekstrak kelopak bunga rosella (dengan ultrasonifikasi) dengan jumlah antosianin ekstrak kelopak bunga rosella yang berada pada fase luar dari jumlah antosianin total multiemulsi A/M/A.
Selain itu, dilakukan pengukuran entrapment efficeiency pada multiemulsi A/M/A yang dilakukan pada penyimpanan perlakuan dan kontrol dengan waktu hari ke 1,3, 7, 14, dan 28.
11. Preparasi Suspensi Liposom
a. Preparasi sampel penetapan laju disipasi dan entrapment efficiency suspensi liposom
Laju disipasi dan entrapment efficeincy diukur dengan melakukan pemisahan terhadap antosianin ekstrak kelopak rosella total dan yang berada pada fase luar suspensi liposom. Jumlah antosianin ekstrak kelopak bunga rosella total diperoleh dari 500 µ L suspensi liposom mengandung ekstrak kelopak bunga rosella yang diperoleh dari Sanjayadi, ditambahkan TritonX-100 10% (1:1) kemudian di vortex. Hasil vortex kemudian di
tambahkan dalam labu takar 5 mL dengan metanol pro analisis. Jumlah antosianin ekstrak kelopak bunga rosella suspensi liposom yang berada pada fase luar suspensi liposom diperoleh dari 500 µ L suspensi liposom ditambahkan aquadest sebanyak 500 µL dan ditambahkan labu takar 5 mL dengan aquadest.
b. Penetapan laju disipasi pada suspensi liposom
Laju disipasi ditetapkan dengan slope (b) persamaan y = bx+a fungsi ln dari jumlah antosianin ekstrak kelopak bunga rosella total dan berada pada fase luar suspensi liposom pada hari ke-1 dan 14. Laju disipasi diukur dengan membandingkan kandungan total ekstrak kelopak bunga rosella dalam suspensi liposom total dengan kandungan ekstrak kelopak bunga rosella yang berada di fase luar suspensi liposom pada hari pertama dan hari ke-14 pada penyimpanan suhu rendah (4ºC) dengan penambahan gas nitrogen (Juniarka, 2012).
c. Penetapan entrapment efficiency suspensi liposom
Entrapment efficiency diukur dengan menghitung selisih jumlah antosianin total ekstrak kelopak bunga rosella (dengan ultrasonifikasi) dengan jumlah antosianin ekstrak kelopak bunga rosella yang berada pada fase luar dari jumlah antosianin total suspensi liposom.
F. Analisis Hasil
