BAB III. METODE PENELITIAN
F. Tata Cara Penelitian
1. Preparasi serbuk kluwak dari biji kluwak
Biji kluwak yang sudah matang dipendam dalam abu selama 1 bulan untuk difermentasi. Biji kluwak yang sudah difermentasi dipecah kulitnya kemudian diambil dagingnya. Daging biji kluwak diratakan di atas nampan kemudian dimasukkan ke dalam dehumidifier kemudian ditutup. Dehumidifier diset dengan suhu 50oC selama 24 jam. Daging biji kluwak yang sudah kering kemudian dikeluarkan dari dehumidifier kemudian diblender sampai menghasilkan serbuk. Serbuk disimpan dalam wadah tertutup.
2. Ekstraksi serbuk daging biji kluwak
Serbuk yang didapatkan dari preparasi serbuk biji kluwak diekstraksi dengan maserator menggunakan pelarut etanol 99% pro analysis dengan penggantian pelarut (remaserasi) setiap 24 jam selama 3 hari. Ekstrak yang didapat kemudian dipekatkan dengan mengunakan vacuum rotary evaporator sampai ekstrak mengental. Ekstrak lalu dikeringkan dengan menggunakan
waterbath pada suhu 40o-45°C sampai didapat ekstrak dengan masa kental (ditunjukkan dengan bobot tetap), dihitung rendemennya.
3. Uji kualitatif ekstrak etanol biji kluwak dengan metode pewarnaan
Sebanyak 0,14 gram ekstrak etanol biji kluwak dilarutkan dalam 10 mL aquadest hangat, kemudian difraksinasi dengan 10 mL diklorometan. Fraksi diklorometan diambil kemudian ditotolkan pada silica gel GF 254 bersebelahan dengan penotolan standar kumarin dengan konsentrasi 1600 ppm dan fraksi etanol-air. Hasil penotolan dielusikan dengan menggunakan fase gerak campuran n-hexana dengan etil asetat dengan perbandingan 2:2, kemudian disemprot dengan menggunakan KOH etanolis 5%. Hasil spot dideteksi pada detektor sinar UV dengan panjang gelombang 366 nm.
4. Orientasi formula
Emulsi dibuat sesuai formula yang telah ditentukan dengan variasi jumlah Span 80 berturut-turut 1 gram, 2 gram, 3 gram, 4 gram, 5 gram, 6 gram, 7 gram, 8 gram, 9 gram, dan 10 gram masing-masing sebanyak 3 replikasi. Emulsi dilihat respon viskositas dan ukuran dropletnya setelah 48 jam. Irisan dari jumlah terkecil dan terbesar Span 80 dari kedua respon yang memberikan perubahan yang paling linear menjadi level rendah dan level tinggi pada penelitian ini.
Emulsi dibuat sesuai formula yang telah ditentukan dengan variasi jumlah Tween 80 berturut-turut 4 gram, 5 gram, 6 gram, 7 gram, 8 gram, 9 gram, dan 10 gram masing-masing sebanyak 3 replikasi. Emulsi dilihat respon viskositas dan ukuran dropletnya setelah 48 jam. Irisan dari jumlah terkecil dan terbesar
Tween 80 dari kedua respon yang memberikan perubahan yang paling linear menjadi level rendah dan level tinggi pada penelitian ini.
5. Formula emulsi ekstrak etanol biji kluwak
Formula yang dipilih sebagai dasar pembuatan emulsi ekstrak etanol biji kluwak memiliki komposisi formula yang dapat dilihat pada tabel V.
Tabel V. Formula acuan pembuatan emulsi (Yusvita, 2010)
Bahan Jumlah (g) Fungsi
Ekstrak etanol pare 14 senyawa aktif
Aquadest 10 pelarut senyawa aktif
Gliserin 7,9 peningkat viskositas fase air Sukrosa 50% b/v 5 menurunkan perbedaan densitas
fase air dan fase minyak
Span 80 12,6 surfaktan fase minyak
Tween 80 2,4 surfaktan fase air
VCO 48 pelarut fase minyak
Metil paraben 0,1 Pengawet
Modifikasi formula dilakukan untuk memperoleh emulsi dengan tipe M/A yang mempunyai nilai HLB 10. Nilai HLB 10 didasarkan pada nilai tengah dari rentang nilai HLB untuk emulsi tipe M/A. Total emulsi yang dibuat sebanyak 100 gram tiap formula. Formula yang digunakan dapat dilihat pada tabel VI.
Tabel VI. Formula emulsi ekstrak etanol biji kluwak
Bahan Jumlah (g) Fungsi
Ekstrak etanol biji
kluwak 4 senyawa aktif
Aquadest 27 pelarut fase air
Gliserin 7,9 peningkat viskositas fase air
Gula 15 pemberi rasa manis
Span 80 7 surfaktan fase minyak
Tween 80 8 surfaktan fase air
Olive oil 20 pelarut senyawa aktif
Metil paraben 0,1 Pengawet
Sodium bikarbonat 2 menaikkan pH
Gom arab 7 peningkat viskositas emulsi
Optimasi formula dilakukan pada penggunaan Span 80 dan Tween 80. Span 80 (faktor A) level rendah sebesar 3 gram dan level tinggi sebesar 5 gram. Tween 80 (faktor B) level rendah sebesar 7 gram dan level tinggi sebesar 9 gram. Nilai HLB campuran emulsi ekstrak etanol biji kluwak serta hasil optimasi formula dapat dilihat pada tabel VII dan VIII.
Tabel VII. Nilai HLB campuran emulsi ekstrak etanol biji kluwak
Formula Span 80 (g) Tween 80 (g) Nilai HLB
1 3 7 11,79
A 5 7 10,542
B 3 9 12,325
AB 5 9 11,179
Tabel VIII. Optimasi formula emulsi ekstrak etanol biji kluwak
Komposisi Formula (g)
1 A B AB
Ekstrak etanol biji kluwak 4 4 4 4
Olive oil 20 20 20 20 Span 80 3 5 3 5 Tween 80 7 7 9 9 Gliserin 7,9 7,9 7,9 7,9 Aquadest 27 27 27 27 Metil paraben 0,1 0,1 0,1 0,1 Sodium bikarbonat 2 2 2 2 Gula 15 15 15 15 Gom arab 7 7 7 7 Perisa 2 2 2 2
6. Pembuatan emulsi ekstrak etanol biji kluwak
Bahan-bahan yang diperlukan dalam formulasi ditimbang sesuai jumlahnya masing-masing ditambah dengan 20% dari jumlah masing-masing bahan untuk mengatasi adanya bahan yang masih tertinggal di alat. Bahan padat, yang terdiri dari metil paraben, sukrosa, sodium bikarbonat, gom arab, serta 50
bagian aquadest diaduk dan dilelehkan di atas waterbath. Fase minyak dibuat dengan cara ekstrak etanol biji kluwak dicampur dengan olive oil kemudian diaduk selama 2 menit, kemudian ditambah Span 80, diaduk kembali selama 2 menit. Fase air dibuat dengan cara gliserin, Tween 80, dan 50 bagian aquadest diaduk selama 2 menit. Kedua fase dicampur, ditambahkan perisa coklat, serta bahan padat yang telah meleleh. Campuran kemudian dihomogenkan dengan mixerdengan kecepatan konstan (pada mixerdengan kecepatan tingkat 3) selama 10 menit. Emulsi yang telah homogen dimasukkan ke dalam kemasan dan diberi label penanda. Pembuatan emulsi dilakukan sebanyak 5 replikasi untuk tiap formula.
7. Evaluasi emulsi ekstrak etanol biji kluwak
a. Uji organoleptis. Emulsi yang dihasilkan diamati bau, warna, dan bentuknya pada 48 jam setelah pembuatan.
b. Uji pH. Sejumlah emulsi dioleskan pada kertas indikator pH universal kemudian dicocokkan warnanya dengan indikator warna yang telah tertera pada kemasan indikator pH universal sehingga dapat ditentukan pH dari emulsi. Uji pH dilakukan 48 jam dan 28 hari setelah pembuatan. c. Uji penentuan tipe emulsi. Uji ini dilakukan dengan metode pewarnaan
menggunakan reagen methylene blue. Sejumlah emulsi dioleskan di atas object glasskemudian ditetesi dengan reagen methylene bluedan diamati di bawah mikroskop apakah terdapat pendispersian warna biru pada medium atau tidak. Hasil pengamatan di bawah mikroskop dapat digunakan untuk menentukan apakah emulsi tersebut bertipe M/A atau
A/M. Uji ini dilakukan untuk tiap formula pada 48 jam dan 28 hari setelah pembuatan.
d. Uji indeks creaming. Emulsi tiap formula dimasukkan ke dalam tabung reaksi berskala dan diamati pemisahan fase yang terjadi pada 48 jam, 7 hari, 14 hari, 21 hari, dan 28 hari setelah pembuatan. Hasil pemisahan fase dinyatakan dengan persentase indeks creaming.
% indekscreaming= ...(5) Keterangan : ho = tinggi emulsi mula-mula
hu = tinggi creamingyang terjadi (Yusvita, 2010).
e. Uji perhitungan ukuran droplet. Sejumlah emulsi dioleskan di atas object glass kemudian diamati ukuran droplet yang terdispersi dengan menggunakan mikroskop. Sebelum dilakukan pengukuran, lensa mikroskop dikalibrasi dengan micrometer objective. Diameter terjauh dari tiap droplet sejumlah 500 droplet tiap replikasi pada semua formula diukur dan dicatat kemudian dihitung nilai rata-ratanya. Ukuran droplet dihitung pada 48 jam, 7 hari, 14 hari, 21 hari, dan 28 hari setelah pembuatan. Pertumbuhan ukuran droplet sebagai uji stabilitas fisis dihitung dengan % pertumbuhan ukuran droplet.
f. Uji viskositas. Sejumlah emulsi dimasukkan ke dalam viscotester kemudian viskositas diukur dengan mengamati gerakan jarum penunjuk viskositas. Uji viskositas dilakukan 48 jam, 7 hari, 14 hari, 21 hari, dan 28 hari setelah pembuatan untuk tiap replikasi pada semua formula.
Pergeseran viskositas sebagai uji stabilitas fisis viskositas dihitung dengan % pergeseran viskositas.
% pergeseran viskositas =│ ...(6)
% pertumbuhan ukuran droplet=│ (7)
8. Penentuan area komposisi optimum
Hasil uji ukuran droplet dan viskositas pada 48 jam setelah pembuatan dimasukkan ke dalam perhitungan statistik sehingga dapat dihasilkan persamaan desain faktorial untuk masing respon. Persamaan desain faktorial masing-masing respon digunakan dalam pembuatan contour plot untuk respon ukuran droplet dan viskositas yang memuat area optimum dari respon yang diinginkan. Hasil irisan kedua contour plot digabungkan menjadi superimposed contour plot untuk menghasilkan prediksi area komposisi optimum emulsi ekstrak etanol biji kluwak.
9. Validasi area komposisi optimum
Dibuat emulsi ekstrak etanol biji kluwak dengan komposisi Span 80 dan Tween 80 yang ada pada area optimum (Span 80 sebesar 3,5 gram dan Tween 80 sebesar 8,4 gram). Emulsi ekstrak etanol biji kluwak kemudian diukur respon ukuran droplet dan viskositasnya pada 48 jam setelah pembuatan, kemudian dibandingkan dengan respon teoritis.
