BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
G. Analisis Kuantitatif dengan KLT-Densitometri
2. Validasi metode
Suatu metode analisis harus divalidasi ketika suatu metode menggunakan
sistem baru yang belum divalidasi sebelumnya. Validasi ini bertujuan untuk
memberikan jaminan bahwa metode analisis dengan sistem yang digunakan
tersebut memenuhi parameter-parameter validasi sehingga dapat memberikan
hasil analisis yang valid atau dapat dipercaya. Oleh karena itu, validasi metode
merupakan tahapan yang penting untuk dilakukan sebelum metode ini
diaplikasikan untuk analisis kadar asam ursolat dalam herba rumput mutiara.
Menurut Liang et al. (2008), asam ursolat merupakan kandungan utama
dari rumput mutiara dan digunakan sebagai marker bagi tanaman tersebut. Oleh
karena itu, metode penetapan kadar asam ursolat dalam herba rumput mutiara
termasuk dalam metode analisis kategori I menurut The United States
Pharmacopeia 30th tahun 2007. Parameter-parameter validasi yang perlu dipenuhi
oleh metode analisis kategori I adalah akurasi, presisi, selektivitas, linearitas, dan
range.
Validasi dilakukan dengan 3 seri konsentrasi sebanyak 3 replikasi.
Konsentrasi yang digunakan merupakan konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi
dari konsentrasi seri baku yaitu 100 ppm, 300 ppm, dan 500 ppm. Pemilihan
yaitu 100 ppm sampai 500 ppm. Berikut adalah hasil pengujian validasi metode
analisis:
a. Akurasi
Akurasi dimaksudkan untuk mengetahui seberapa dekat hasil
pengukuran suatu metode analisis dengan hasil yang sebenarnya. Semakin
kecil selisih antara keduanya maka akurasi metode tersebut semakin baik.
Akurasi metode dinyatakan dengan perolehan kembali atau recovery. Jika %
recovery baku asam ursolat 100 ppm berada pada rentang 90-107% (United
States Pharmacopeial Convention, 2007), maka metode ini memiliki akurasi
yang baik. Pengukuran akurasi dari percobaan ini disajikan pada tabel V.
Tabel V. Data % recovery baku asam ursolat
Konsentrasi
Recovery (%) Nilai yang diterima recovery (United States Pharmacopeial Convention, 2007) Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 100 ppm 90,967 94,265 109,417 90-107% 300 ppm 97,878 96,361 111,778 91-106,6% 500 ppm 100,764 102,401 98,447 93-106%
Dari tabel dapat dilihat bahwa % recovery asam ursolat untuk replikasi
1 dan 2 masuk pada rentang yang dipersyaratkan namun untuk replikasi 3
hanya konsentrasi tinggi (500 ppm) yang memenuhi persyaratan. Hal ini
kemungkinan terjadi akibat kesalahan pada saat penyiapan baku untuk
replikasi 3 dimana terjadi kesalahan dalam pemilihan timbangan.
Pada pembuatan larutan stok asam ursolat 1000 ppm, baku asam ursolat
ditimbang secara seksama lebih kurang 10,0 mg. Pengertian lebih kurang
pemeriksaan atau penetapan kadar, berarti bahwa jumlah yang harus
ditimbang atau diukur tidak boleh kurang dari 90% dan tidak boleh lebih dari
110% dari jumlah yang tertera, sedangkan pernyataan timbang seksama
dimaksudkan bahwa penimbangan dilakukan sedemikian rupa sehingga batas
kesalahan penimbangan tidak lebih dari 0,1% dari jumlah yang ditimbang
(Depkes RI, 1977). Hal ini berarti untuk menimbang 10,0 mg asam ursolat,
rentang yang diperbolehkan adalah 9-11 mg dengan kesalahan tidak lebih dari
0,01 mg (0,00001 g), dan oleh karena itu dibutuhkan timbangan semimicro
(ketelitian 5 angka di belakang koma). Namun karena keterbatasan alat, maka
timbangan yang digunakan adalah timbangan analitik (ketelitian 4 angka di
belakang koma), sehingga kesalahan pada saat penimbangan bisa tidak
terdeteksi. Secara umum, metode ini memiliki akurasi yang baik pada
konsentrasi rendah, menengah, dan tinggi.
b. Presisi
Presisi menunjukkan keterulangan hasil yang diperoleh. Presisi
dinyatakan dalam coefficient of variation (CV). Menurut United States
Pharmacopeial Convention (2007), % CV yang dapat diterima untuk
konsentrasi analit 1000 ppm adalah <16%. Semakin kecil % CV yang
diperoleh maka semakin baik presisi metode yang digunakan.
Hasil menunjukkan bahwa metode yang digunakan memiliki presisi
yang baik. Hal ini dapat dilihat dari nilai % CV dari setiap konsentrasi yang
Tabel VI. Data % CV baku asam ursolat Konsentrasi % CV
Nilai % CV yang diterima (United States Pharmacopeial
Convention, 2007)
100 ppm 3,013 < 14,9
300 ppm 0,565 < 12,7
500 ppm 1,057 < 10,5
c. Linearitas
Linearitas menyatakan hubungan korelasi antara kadar dengan respon
yang diukur instrumen. Untuk metode KLT-Densitometri, respon terukur
yang dimaksud adalah nilai AUC. Linearitas dinyatakan dari nilai r yang
diperoleh dari kurva baku. Jika nilai r ≥0,99 (APVMA, 2004) maka dikatakan memiliki linearitas yang baik. Semakin baik nilai r artinya peningkatan kadar
proporsional dengan peningkatan nilai AUC.
Tabel VII. Nilai r seri baku asam ursolat Replikasi Nilai r
1 0,9816
2 0,9893
3 0,9933
Dari tabel diketahui bahwa nilai r seri baku asam ursolat replikasi 3
memenuhi persyaratan. Oleh karena itu, untuk selanjutnya digunakan seri
baku replikasi 3 untuk membuat persamaan kurva baku.
d. Selektivitas
Selektivitas menunjukkan kemampuan suatu metode untuk mengukur
senyawa tertentu secara akurat dan presisi dalam sampel yang terdiri dari
banyak senyawa lain. Metode dengan selektivitas yang baik hanya akan
mengukur kadar analit yang dimaksud. Penelitian ini membutuhkan metode
ekstraksi yang dilakukan dengan menggunakan cairan penyari etanol 96%
selain dapat mengekstraksi asam ursolat juga dapat mengekstraksi
senyawa-senyawa lain dalam herba rumput mutiara yang juga larut dalam etanol 96%.
Dalam herba rumput mutiara, selain terkandung asam ursolat juga
terkandung senyawa isomer dari asam ursolat yaitu asam oleanolat.
Kemiripan struktur kimia menyebabkan kedua senyawa triterpen ini sulit
untuk dipisahkan, terutama dengan KLT. Terdapat beberapa sistem
kromatografi untuk analisis triterpen namun belum ada yang dapat
memisahkan asam ursolat dan asam oleanolat (Wojciak-Kosior, 2007).
Pada proses defatisasi, asam oleanolat tidak terekstraksi oleh petroleum
eter seperti asam ursolat karena sifatnya yang tidak larut petroleum eter,
sedangkan pada proses digesti senyawa ini juga dapat larut dalam etanol 96%.
KLT tidak mampu memisahkan kedua senyawa isomer ini sehingga metode
ini tidak selektif untuk penetapan kadar asam ursolat. Bercak kedua senyawa
ini tidak terpisah sama sekali sehingga dalam penelitian ini yang ditetapkan
adalah kadar triterpen total terhitung sebagai kadar asam ursolat.
Selektivitas metode KLT-Densitometri ini untuk penetapan kadar
triterpen total dapat dilakukan dengan membandingkan nilai Rf baku dengan
Rf analit dalam ekstrak. Nilai Rf merupakan parameter analisis kualitatif suatu
senyawa pada metode KLT, sehingga dapat digunakan sebagai parameter
selektivitas. Selektivitas metode juga dapat dilihat dari resolusi, dimana suatu
resolusi >1,5 (Swartz and Krull, 1997). Perbandingan nilai Rf antara baku dan
analit dalam sampel serta nilai resolusi dapat dilihat pada tabel VIII.
Tabel VIII. Perbandingan nilai Rf baku dan sampel, serta nilai resolusi Konsentrasi
seri larutan baku asam ursolat (ppm)
Rf baku Replikasi
sampel Rf sampel Resolusi
100 0,35 1 0,34 1,58 200 0,34 2 0,34 1,50 300 0,34 3 0,34 1,53 400 0,34 4 0,34 1,62 500 0,34 5 0,34 1,67 Rata-rata 0.34 0.34 1,58
Tabel VIII menunjukkan nilai Rf baku dan analit dalam ekstrak yang
identik, dimana nilai Rf rata-rata dari baku adalah 0,34 dan Rf rata-rata dari
analit dalam ekstrak adalah 0,34. Nilai rata-rata resolusi antara peak bercak
triterpen dengan peak terdekat adalah 1,58. Nilai ini lebih dari nilai resolusi
yang dipersyaratkan, yaitu >1,5. Oleh karena itu dapat disimpulkan bahwa
metode KLT-Densitometri ini memenuhi parameter selektivitas dalam
menetapkan kadar triterpen total.
Gambar 14. Rf ekstrak replikasi 1 = 0,34 e. Range
Range adalah interval antara konsentrasi analit pada level rendah dan
level tinggi dalam sampel yang masih memenuhi parameter linearitas,
akurasi, dan presisi. Hasil analisis menunjukkan bahwa range konsentrasi
metode ini adalah 100-500 ppm dimana pada konsentrasi terkecil dan
terbesarnya masih memenuhi persyaratan linearitas, akurasi, dan presisi yang
baik. Oleh karena itu, analit dalam sampel dapat diukur dalam range
konsentrasi ini.
Gambar 15. Range konsentrasi asam ursolat
y = 18.591x + 2699.3 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 0 100 200 300 400 500 600 A U C
Kadar baku asam ursolat (ppm)
f. Akurasi dan presisi dalam matriks sampel
Akurasi dan presisi dalam matriks sampel perlu ditentukan untuk
mengetahui pengaruh matriks sampel terhadap pengukuran analit, apakah
metode tetap dapat mengukur analit secara akurat dan seksama di dalam
matriks sampel.
Gambar 16. Kromatogram ekstrak tanpa adisi baku asam ursolat
Gambar 17. Kromatogram ekstrak dengan adisi baku asam ursolat
Penentuan akurasi dan presisi baku asam ursolat dilakukan dengan
menambahkan sejumlah tertentu baku asam ursolat dalam matriks ekstrak
(adisi). Tahap ini juga bertujuan untuk menentukan bahwa bercak dengan Rf
ursolat. Bila terjadi penambahan luas area (AUC) pada peak bercak yang
semula diduga sebagai bercak asam ursolat berarti bercak tersebut memang
merupakan bercak asam ursolat. Hasil yang diperoleh menunjukkan adanya
penambahan luas area untuk peak dengan nilai Rf identik dengan baku asam
ursolat (gambar 16 dan 17). Oleh karena itu dapat dipastikan bahwa bercak
tersebut merupakan bercak asam ursolat.
Akurasi dan presisi baku asam ursolat yang ditambahkan dalam ekstrak
herba rumput mutiara dapat dilihat pada tabel IX. Dalam percobaan ini, kadar
baku asam ursolat yang ditambahkan pada ekstrak herba rumput mutiara
sebesar 100 ppm. Menurut United States Pharmacopeial Convention (2007),
% recovery konsentrasi 100 ppm berada pada rentang 90-107% sedangkan %
CV harus lebih rendah dari 14,9%. Metode ini dapat mengukur analit dalam
matriks ekstrak dengan akurat dan seksama dilihat dari nilai % recovery dan
% CV yang memenuhi syarat.
Tabel IX. Data recovery dan CV baku asam ursolat dalam matriks ekstrak Replikasi Recovery (%) CV (%) 1 100,617 2,426 2 99,067 3 103,876