BAB II PENELAAHAN PUSTAKA
E. Validasi Metode
Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004).
Validasi metode dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis (Rohman, 2007).
Suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi masalah analisis, karenanya suatu metode harus divalidasi, ketika:
1. Metode baru dikembangkan untuk mengatasi problem analisis tertentu.
2. Metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan perkembangan atau karena munculnya suatu masalah yang mengarahkan bahwa metode baku tersebut harus direvisi.
3. Penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah berubah seiring dengan berjalannya waktu.
4. Metode baku digunakan di laboratoium yang berbeda, dikerjalan olh analis yang berbeda, atau dikerjakan dengan alat yang berbeda.
5. Untuk mendemonstrasikan kesetaraan dua metode, seperti antara metode baru dan metode baku (Rohman, 2007).
Menurut The United States Pharmacopeia 30 The National Formulary 25tahun 2007, suatu metode atau prosedur analisis dibagi menjadi empat kategori, yaitu:
1. Kategori I mencakup prosedur analisis kuantitatif, untuk menetapkan kadar komponen utama bahan obat atau zat aktif dalam sediaan farmasi.
2. Kategori II mencakup prosedur analisis kualitatif dan kuantitatif yang digunakan untuk menganalisis impurities ataupun degradation compounds
dalam sediaan farmasi.
3. Kategori III mencakup prosedur analisis yang digunakan untuk menentukan karakteristik penampilan suatu sediaan farmasi, misalnya disolusi atau pelepasan obat.
4. Kategori IV (tes identifikasi)
Parameter-parameter yang harus dipenuhi dari masing-masing kategori tersebut dapat dilihat pada tabel III di bawah ini.
Tabel III. Parameter Analisis yang harus Dipenuhi untuk Syarat Validasi Metode (Anonim, 2007)
Kategori 2 Parameter
analisis Kategori 1 Kuantitatif Uji batas Kategori 3 Kategori 4
Akurasi Ya Ya * * Tidak
Presisi Ya Ya Tidak Ya Tidak
Spesifisitas Ya Ya Ya * Ya
LOD Tidak Tidak Ya * Tidak
LOQ Tidak Ya Tidak * Tidak
Linearitas Ya Ya Tidak * Tidak
Range Ya Ya * * Tidak
* = mungkin tidak diperlukan (tergantung sifat spesifik tes)
Berdasarkan tabel di atas, maka parameter-parameter validasi yang harus ditetapkan untuk senyawaimpuritiesadalah sebagai berikut.
1. Akurasi
Akurasi adalah kedekatan hasil analisis yang diperoleh dengan memakai metode tersebut dengan nilai yang sebenarnya. Umumnya akurasi ditentukan melalui penetapanrecovery, tetapi ada tiga cara untuk menentukan akurasi, yaitu: a. Perbandingan denganreference standard
Penentuan recovery melalui perbandingan langsung terhadap standar (bahan standar referensi). Metode ini cocok untuk analit yang mengandung bahan obat yang murni dimana bukan merupakan sampel matriks yang kompleks (Snyder, Kirkland, and Glajch, 1997). Ketika menggunakan metode ini, maka analis harus menunjukkan bahwa metode yang digunakan memberikan pengukuran analit yang akurat dan teliti dalam matriks sampel tertentu (Rohman, 2007).
b. Recoveryanalit
Jika analit yang digunakan berada dalam matriks sampel yang kompleks, dapat digunakan metodespike recovery. Standar referensi analit ditambahkan dalam matriks kosong (placebo). Misalnya, dalam analisis formulasi obat, matriks kosong yang digunakan termasuk seluruh komposisi formulasi, kecuali analit yang diukur (Snyderet al., 1997).
c. Penambahan standar adisi ke dalam analit
Di dalam metode standar adisi, diketahui jumah analit yang ditambahkan pada konsentrasi yang berbeda ke dalam suatu matriks yang sebelumnya sudah diketahui analitnya melalui kuantifikasi. Sampel yang tidak ditambah baku dan sampel yang ditambahkan baku dianalisis dan hasil pengukuran
dibandingkan dengan jumlah analit yang ditambahakan. Metode ini digunakan saat kesulitan dalam menyiapkan matriks kosong tanpa analit (Snyderet. al, 1997).
Menurut Yuwono dan Indrayanto (2005), kriteria yang diterima untuk akurasi pada konsentrasi analit yang berbeda dapat dilihat pada tabel IV di bawah ini:
Tabel IV. Kriteria rangerecoveryyang diijinkan (Yuwono dan Indrayanto, 2005)
Konsentrasi Analit (%) Unit Rata-ratarecovery(%)
100 100% 98 – 102 > 10 10% 98 – 102 > 1 1% 97 – 103 > 0,1 0,1% 95 – 105 0,01 100 ppm 90 – 107 0,001 10 pm 80 – 110 0,0001 1 ppm 80 – 110 0,00001 100 ppb 80 – 110 0,000001 10 ppb 60 – 115 0,0000001 1 ppb 40 – 120 2. Presisi
Presisi atau keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen (Harmita, 2004). Presisi diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variasi) (AnonimC, 2011).
Presisi terdiri dari 3 macam, yaitu (Anonim, 2005):
a. Ketertiruan (reproducibility) yaitu keseksamaan metode bila analisis dikerjakan di laboratorium yang berbeda.
b. Presisi antara (intermediate precision) yaitu keseksamaan metode jika analisis dikerjakan di laboratorium yang sama pada hari yang berbeda atau analis yang berbeda atau peralatan yang berbeda.
c. Keterulangan (repeatibility) yaitu keseksamaan metode jika analisis dilakukan oleh analis yang sama dengan peralatan yang sama pada interval waktu yang pendek.
Ketentuan nilai KV yang dapat diterima dapat dilihat pada tabel V di bawah ini:
Tabel V Kriteria nilai presisi yang diijinkan (Yuwono dan Indrayanto, 2005) Konsentrasi analit (%) Unit Presisi (RSD %)
100 100% 1,3 ≥10 10% 2,7 ≥1 1% 2,8 ≥0,1 0,1% 3,7 0,01 100 ppm 5,3 0,001 10 ppm 7,3 0,0001 1 ppm 11 0,00001 100 ppb 15 0,000001 10 ppb 21 0,0000001 1 ppb 30 3. Linearitas
Linearitas adalah kemampuan metode analisis memberikan respon proporsional terhadap konsentrasi analait dalam sampel. Rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertingi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima (AnonimC, 2011).
Linearitas suatu metode meruapakan ukuran seberapa baik kurva kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi (x).
Linearitas dapat diukur dengan melakukan pengukuran tunggal pada konsentrasi yang berbeda-beda. Data yang diperoleh kemudian selanjutnya diproses dengan metode kuadrat terkecil, untuk selanjutnya dapat ditentukan nilai kemiringan (slope), intersep, dan koefisien korelasi (Rohman, 2007).
Koefisien korelasi akan mengindikasikan linearitas yang baik apabila nilai r > 0,999 (Yuwono dan Indrayanto, 2005).
4. Batas deteksi (Limit of Detection)
Batas deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi.
Limit of detection (LOD) merupakan batas uji yang spesifik menyatakan apakah analit di atas atau di bawah nilai tertentu.
Rasio signal to noise untuk LOD adalah 2:1 atau 3:1. Selain itu, penentuan LOD dapat juga didasarkan padaslope kurva baku dan standar deviasi (simpangan baku) (Anonim, 2005).
5. Batas kuantifikasi (Limit of Quantification)
Limit of quantification (LOQ) didefiisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan. Perhitungan nilai LOQ adalah dengan rasio signal to noise 10:1 (Rohman, 2007). Penentuan LOQ dapat juga didasarkan pada slope kurva baku dan standar deviasi (simpangan baku) (Anonim, 2005).
Kesalahan pada metode analisis kimia memungkinkan untuk terjadi. Kesalahan yang mungkin terjadi yaitu (Mulja dan Suharman, 1995):
a. Kesalahan sistematik merupakan hasil analisis yang menyimpang secara tetap dari nilai sebenarnya karena proses pelaksanaan prosedur analisis. Kesalahan sistematik ada dua macam, yaitu:
1) Kesalahan pada metode analisis, agak sulit dideteksi karena kesalahan metode analisis ini antara lain disebabkan sifat fisika kimia pereaksi yang dipakai tidak memadai.
2) Kesalahan individual adalah kesalahan yang timbul karena kesalahan individu dalam pengamatan atau pembacaan instrumen yang dihadapi. Kesalahan ini dapat dicari sebabnya dan dapat dikendalikan dengan kalibrasi instrumen secara berkala, pemilihan metode dan prosedur standar dari badan resmi, pemakaian bahan kimia dengan derajat untuk analisis, dan peningkatan pengetahuan peneliti.
b. Kesalahan tidak sistematik merupakan penyimpangan tidak tetap dari hasil penentuan kadar dengan instrumentasi yang disebabkan oleh fluktuasi instrumen yang dipakai. Meningkatnya kesalahan tidak sistematik disebabkan tiap bagian instrumen memberikan noise yang kecil yang kemudian ini tidak diketahui. Pemakaian instrumen dengan kualitas baik akan menekan nilai kesalahan ini (Mulja dan Suharman, 1995).
6. Spesifisitas
Spesifisitas suatu metode adalah kemampuan suatu metode untuk mengukur dengan akurat respon analit dalam sampel dengan adanya komponen
lain yang mungkin ada dalam sampel seperti pengotor dan produk degradasi (Anonim, 2005).
Penentuan spesifitas metode dapat diperoleh dengan dua jalan. Yang pertama adalah dengan melakukan optimasi sehingga diperoleh senyawa yang dituju terpisah secara sempurna dari senyawa-senyawa lain. Cara kedua untuk memperoleh spesifisitas adalah dengan menggunakan detektor selektif (Rohman, 2007).