PENGARUH EKS TERHADAP K
(Rattu DIME
Sebagai S
STRAK ETANOL DAUN SIRSAK (Annon KADAR GLUTATION JARINGAN HEPA attus norvegicus L.) YANG DIINDUKSI7,12 IMETHYLBENZ(A)ANTHRACENE(DMBA)
Oleh
KARIMAH IHDA HUSNAYAIN
Skripsi
ABSTRAK
PENGARUH EKSTRAK ETANOL DAUN SIRSAK (Annona muricata L.) TERHADAP KADAR GLUTATION JARINGAN HEPAR TIKUS
(Rattus norvegicus L.) YANG DIINDUKSI7,12 DIMETHYLBENZ(A)ANTHRACENE(DMBA)
Oleh
KARIMAH IHDA HUSNAYAIN
ABSTRACT
THE EFFECT OF SOURSOP LEAVES (Annona muricata L.) ETHANOL EXTRACT TO GLUTATHIONE LEVELS OF RATS LIVER TISSUE
(Rattus norvegicus L.) INDUCED BY7.12 DIMETHYLBENZ(A)ANTHRACENE(DMBA)
By
KARIMAH IHDA HUSNAYAIN
Cancer is an uncontrolled cell proliferation process in the body. From accounting in 2012, the mortality rate from cancer shows as much as 8.2 million people and almost 70% of them are from developing country. The tendency of antioxidants used as anticancer agents which derived from natural are increase. The content of the soursop leaves are known as antitumor and antioxidant properties that can affect the level of endogenous antioxidants. DMBA can cause cell mutations that could lead into liver parenchyma damage. This damage can be characterized by the decreased of endogenous antioxidants level such as glutathione. The research is about the effect of soursop leaves ethanol extract on rat liver tumorigenesis induced by DMBA. The research conducted on 4 groups with different treatment for 4 weeks. Group N (negative control), P (positive control DMBA induced 20 mg/kg 2x/week, P20 (DMBA induction 2x/week and soursop leaf ethanol extract of 20 mg/kg/day), P40 (DMBA induction 2x/week and extracts soursop leaf ethanol 20 mg/kg/day). The liver is removed and weighed to be making homogenates and glutathione measurement with Ellman method. The average of hepatic glutathione levels of each group: group N is 0.222±0.026 mol/g, group P decreased (0.208±0.016 mol/g), group P20 increased (0.280±0.012 mol/g) and group P40 increased higher (0.325±0.024 mol/g). Statistically showed significant differences among the groups. The results is the ethanol extract of soursop leaves can improve hepatic glutathione levels significantly.
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bandung pada tanggal 29 Maret 1994, sebagai anak pertama dari enam bersaudara dari Bapak dr. H. Achmad Chubaesy Yusuf, Sp.KFR, M.Kes dan Ibu dr. Hj. Marfuah Nuraini.
Pendidikan Taman Kanak-kanak (TK) diselesaikan di TK IT Lukmanul Hakim Kota Bandung dan TK IT Al Izzah Kota Serang pada tahun 1999, Sekolah Dasar (SD) diselesaikan di SDN IPPOR Labuan III Pandeglang pada tahun 2005, Sekolah Menengah Pertama (SMP) diselesaikan di SMP IT Baitul Anshor (Boarding School) Cimahi pada tahun 2008, dan Sekolah Menengah Atas (SMA) diselesaikan di SMA Negeri 1 Kota Serang pada tahun 2011. Selama bersekolah, penulis aktif dalam kegiatan ekstrakulikuler yang terdapat di sekolah, di antaranya Pramuka, Rohis, beladiri Thifan Putri Gading dan Karate.
PERSEMBAHAN
Maha Suci Allah, sedikitpun tiada pengertian kami, kecuali apa-apa yang
telah Engkau ajarkan kepada kami, sungguh Engkaulah yang Maha
Mengetahui lagi Maha Bijaksana.
(Q.S. Al-Baqarah: 32)
Kupersembahkan karya ini untuk Abi, Ummi, dan adik-adik.
Untuk semua orang yang telah memberikan pelajaran berharga dalam
hidup
Semoga persaudaraan ini akan abadi sampai ke jannah-Nya
Ya Allah, Engkau mengetahui bahwa hati-hati ini telah terhimpun
dalam cinta kepada-Mu, telah berjumpa dalam taat kepada-Mu, telah
bersatu dalam dakwah kepada-Mu, telah berpadu dalam membela
syariat-Mu. Teguhkanlah, Ya Allah, ikatannya. Kekalkanlah cinta kasihnya.
Tunjukilah jalan-jalannya. Penuhi hati-hati ini dengan cahaya-Mu yang
tiada pernah padam. Lapangkanlah dada kami dengan karunia iman
kepada-Mu dan indahnya bertawakal kepada-Mu. Hidupkanlah hati ini
SANWACANA
Puji syukur Penulis ucapkan ke hadirat Allah SWT karena atas rahmat dan hidayah-Nya skripsi ini dapat diselesaikan. Shalawat serta salam semoga selalu tercurahkan kepada Nabi Muhammad SAW.
Skripsi dengan judul “Pengaruh Ekstrak Etanol Daun Sirsak (Annona muricata L.) Terhadap Kadar Glutation Jaringan Hepar Tikus (Rattus norvegicus L.) yang
Diinduksi 7,12 Dimethylbenz(a)anthracene (DMBA)” adalah salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana Kedokteran di Universitas Lampung.
Dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Bapak Dr. Sutyarso, M.Biomed., selaku Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Lampung;
2. Ibu dr. Tiwuk Susantiningsih, M.Biomed., selaku Pembimbing Utama atas kebaikan hatinya dan kesediaannya untuk memberikan bimbingan, saran, dan kritik dalam proses penyelesaian skripsi ini, tanpa mengurangi perhatiannya walaupun harus membagi waktu dengan banyak agenda lainnya;
4. Bapak Dr. dr. Asep Sukohar, M.Kes., selaku Penguji Utama pada Ujian Skripsi. Terima kasih atas waktu, ilmu, saran-saran yang telah diberikan di saat maupun di luar waktu seminar;
5. Ibu dr. Reni Zuraida, M.Si., selaku Pembimbing Akademik sejak semester awal hingga akhir di Fakultas Kedokteran;
6. Abi, dr. H. Achmad Chubaesy Yusuf, Sp.KFR, M.Kes yang selalu mendoakan, membimbing, menguatkan, memotivasi dan mengusahakan segalanya. Semoga Allah selalu menyayangimu seperti abi menyayangiku; 7. Umi, dr. Hj. Marfuah Nuraini yang selalu mendoakan, membimbing,
menguatkan, memotivasi dan mengusahakan segalanya. Semoga Allah selalu menyayangimu seperti umi menyayangiku;
8. Adik-adik saya, Muhammad Fadhil ‘Abdan Syakuro; Faqih Achmad Rabbani; Hilma Hanifah; Raihana Hamidah; dan Hasna Hayatina yang menjadi motivasi untuk terus menjadi contoh yang baik;
9. Seluruh sanak keluarga di perantauan, keluarga besar uwa H. Ahmad Jajuli dan dr. Endang Legiarti; keluarga besar uwa Joko Utomo; dan keluarga besar Pa’de Johnson Salawangi (alm) yang telah banyak membantu selama tinggal di Lampung;
10. Keluarga besar saya di tanah jawa yang juga tidak lupa memberikan semangat dan doa;
11. Seluruh Staf Dosen FK Unila atas ilmu yang telah diberikan kepada penulis untuk menambah wawasan yang menjadi landasan untuk mencapai cita-cita; 12. Seluruh Staf Tata Usaha dan Akademik FK Unila, serta pegawai yang turut
13. Mbak Nur, yang sangat banyak membantu sejak awal persiapan penelitian hingga selesai penelitian. Terima kasih telah dengan sabar mendampingi kami hingga selesai;
14. Sahabat sedari awal di fakultas ini, Anggia Shinta Wijaya Kusuma, Diah Septia Liantari dan Melly Annida. Terima kasih atas kebersamaan, kerjasama, keluh kesah dan candaannya yang membuat suasana menjadi lebih ceria dan ramai akan cerita. Semoga sukses selalu untuk kita semua;
15. Sahabat mencit asdos farmako, Nycho, Dessy, Rifka, Vivi dan Yoghi terimakasih atas kerjasama dan tambahan warna baru dalam rutinitas perkuliahan;
16. Rekan kerja seperjuangan Annonaers, Anggia Shinta Wijaya Kusuma, Annisa Ratya, Berta Yolanda Selviana dan Taufiqurrohman terimakasih atas bantuan, dukungan dan kerjasamanya selama ini;
17. Keluarga Besar FSI Ibnu Sina, Mba Putren, Mba Fira, Mba Tya, Mba Megan, Ayuk Arum, Mba Wika, Mba Ghina, Mba Nora, Mba Nyimas, Mba Nida, Mba Meta, Mba Vicha, Mba Laili, Mba Ninu, Mba Hani, Sartika, Rania, Mba Huzai, Zsazsa, Idzni, Azrie, Rosi, Laras, Eka, Siti N. Indah, Nuha, Nana, Andini, Tia dan sahabat-sahabat semua yang tidak bisa saya tulis satu persatu, telah menjadikan saya lebih dari sekadar mahasiswa, menjadi lebih bermanfaat dan dapat merasakan manisnya dakwah dalam ikatan ukhuwah lillahita’ala;
menyatukan kita, mengajarkan banyak hal tentang arti persaudaraan, nilai islam yang begitu indah dan nasihat yang selalu menguatkan iman. Persaudaraan ini semoga berlanjut sampai tempat pertemuan yang terindah, sebuah istana di surga untuk para wanita pelangi;
19. Keluarga besar PMPATD Pakis Rescue Team dan BEM FK Kabinet Kranial yang turut menjadi bagian dalam pembelajaran hidup yang tidak akan terlupakan;
20. Seluruh sahabat yang dipertemukan dalam lingkaran-lingkaran kecil dan menyejukkan, Bina Baca Quran (BBQ) yang selalu memberikan motivasi, informasi, dan siap menjadi tempat berbagi keluh kesah;
21. Teman-teman angkatan 2011 yang tak bisa disebutkan satu per satu. Terima kasih atas motivasi dan kebersamaan yang terjalin selama mengemban ilmu di kampus tercinta ini;
22. Kakak-kakak dan adik-adik tingkat (angkatan 2002-2014) yang sudah memberikan semangat kebersamaan dalam satu kedokteran.
Akhir kata, Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Akan tetapi, sedikit harapan semoga skripsi yang sederhana ini dapat berguna dan bermanfaat bagi kita semua. Amiin.
Bandar Lampung, Desember 2014 Penulis
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR ISI... i
DAFTAR TABEL... iii
DAFTAR GAMBAR ... iv
DAFTAR LAMPIRAN ... v
I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang ... 1
B. Rumusan Masalah ... 4
C. Tujuan Penulisan ... 4
1. Tujuan umum ... 4
2. Tujuan khusus ... 5
D. Manfaat Penelitian ... 5
1. Manfaat teoretis ... 5
2. Manfaat praktis ... 5
II. TINJAUAN PUSTAKA A. Tanaman Sirsak ... 6
1. Deskripsi tanaman sirsak ... 6
2. Kandungan bioaktif daun sirsak ... 8
B. Senyawa7, 12 dimethylbenz[a]anthracene ... 13
C. Glutation (GSH) ... 15
D. Hepar Tikus (Rattus norvegicus L.) ... 17
1. Anatomi hepar tikus ... 17
ii
E. Tumorigenesis ... 20
F. Kerangka penelitian ... 25
1. Kerangka teori ... 25
2. Kerangka konsep... 28
H. Hipotesis... 28
III. METODE PENULISAN A. Jenis Penelitian... 29
B. Tempat dan Waktu Penelitian ... 29
C. Populasi dan Sampel ... 30
D. Bahan dan Alat Penelitian... 31
E. Prosedur Penelitian ... 32
F. Identifikasi Variabel dan Definisi Operasional Variabel... 34
1. Identifikasi variabel... 34
2. Definisi operasional variabel... 35
G. Pengolahan dan Analisis Data... 36
H. Diagram Alir Penelitian ... 37
I. Etika Penelitian... 40
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1. Jenisannonaceous acetogenindalam daun sirsak ... 9
2. Definisi operasional penelitian... 35
3. Absorbansi standar glutation pada λ 412 nm ... 42
4. Rerata kadar hasil pengukuran GSH ... 44
5. Rerata kadar glutation hepar tiap kelompok ... 45
6. Analisisshapiro-wilkkadar glutation hepar ... 46
7. Hasil analisisone-way anova... 47
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1. Surat keterangan lolos kaji etik ... 66
2. Pengukuran kadar glutation... 67
3. Pembuatan homogenat hepar ... 68
4. Analisis statistik ... 69
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Daun sirsak ... 7
2. Struktur umumannonaceous acetogenin ... 8
3. Model McLaughlin dalam sifat inhibisiacetogenin pada kompleks I mitokondria ... 10
4. Struktur DMBA ... 13
5. Metabolisme DMBA ... 14
6. Sintesis GSH ... 15
7. Mekanisme perlindungan oleh GSH ... 16
8. Reaksi GSH terhadap H2O2... 17
9. Anatomi hilar pada hepar tikus ... 18
10. Pembentukan radikal dan mekanisme kerja antioksidan enzimatik ... 21
11. Skema dasar molekuler tumorigenesis... 24
12. Kerangka teori ... 27
13. Kerangka konsep ... 28
14. Diagram alir penelitian... 39
15. Kurva standar GSH ... 42
16. Grafik rerata kadar GSH hepar ... 46
17. Prinsip pengukuran kadar GSH... 49
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Kanker merupakan suatu proses proliferasi sel-sel di dalam tubuh yang tidak terkendali. Angka kematian akibat kanker di dunia mencapai 13% atau mencapai 7,4 juta pada tahun 2008 dengan kasus kematian tertinggi adalah akibat kanker paru-paru, hepar dan abdomen. Kematian akibat kanker di seluruh duniaakan terus meningkat setiap tahunnya. Pada tahun 2012, terhitung terdapat 8,2 juta kematian akibat kanker (WHO, 2013; Ferlay dkk., 2010). Secara mengejutkan hampir 70% dari angka kematian tersebut terjadi di negara berpenghasilan rendah dan menengah. Angka kematian di Asia pada tahun 2002 adalah sebesar 3,5 juta dan akan mencapai 8,1 juta kematian pada tahun 2020 apabila tidak ditangani secara intensif (Alwan dkk., 2010).
2
Berdasarkan data-data dan kejadian tersebut maka, perlu dilakukan tindakan untuk menekan angka kejadian kanker. Penyakit kanker umumnya baru diketahui setelah sampai pada tahap progresi hingga sulit dilakukan terapi. Pengobatan pada kanker umumnya meliputi pembedahan, radioterapi dan kemoterapi. Namun ketiga cara tersebut memiliki efek samping seperti perdarahan, infeksi berat, mual, muntah, kulit kering, rambut rontok dan sulit menelan (Abdulmuthalib & Adiwijoyono,2009; Pertiwi dkk., 2014).
Kecenderungan penggunaan nutrisi antioksidan sebagai zat antikanker yang berasal dari alam atau tanaman herbal semakin meningkat. Perkembangan penggunaan herbal dalam mengatasi masalah kesehatan saat ini dibuktikan dari hasil riset bahwa persentase penduduk Indonesia yang mengonsumsi jamu terdapat sebanyak 59,12% dan dari jumlah tersebut 95,60% di antaranya merasakan manfaatnya (Kemenkes RI, 2011).
3
anti-ulserogenik, antihiperglikemi, antitumor dan antineoplastik (Sawant dan Gogle, 2014).
Zat-zat yang dapat menyebabkan mutasi dan menimbulkan terjadinya tumorigenesis disebut mutagen. Salah satu mutagen yang diketahui adalah senyawa PAH (polisiklik aromatis hidrokarbon). PAH ditemukan pada pembakaran bahan organik yang tidak sempurna seperti asap rokok, hasil industri dan asap kendaraan. Senyawa 7,12 dimethylbenz[a]anthrancene
(DMBA) merupakan produk degradasi PAH yang berpotensi sebagai bahan sitotoksik, mutagenik, agen imunosupresif dan karsinogenik. Oleh karena itu, senyawa DMBA dapat menyebabkan stres oksidatif dan kerusakan pada jaringan sampai dengan timbulnya penyakit kronis (Hartono, 2013).
Sel memiliki mekanisme pertahanan untuk menangkal prooksidan, yaitu mekanisme antioksidan (Winarsi, 2011). Glutation (GSH) merupakan salah satu antioksidan endogen yang sangat penting sebagai mekanisme pertahanan terhadap senyawa toksik tertentu, misalnya obat dan karsinogen. Jika kadar GSH suatu jaringan, seperti hepar menurun (seperti dapat terjadi pada pemberian senyawa tertentu yang bereaksi degan GSH kepada tikus), jaringan tersebut terbukti lebih rentan terhadap cedera akibat berbagai bahan kimia, yang dalam keadaan normal dikonjugasikan dengan GSH (Murray dkk., 2014).
4
metabolik dalam tubuh (Adewole dan Ojowole, 2008). Kerusakan ini dapat ditandai dengan penurunan kadar antioksidan endogen glutation (Riani, 2004).
Berdasarkan teori tersebut, maka dapat diketahui bahwa kadar GSH dapat digunakan sebagai indikator terhadap penangkal radikal bebas. Oleh karena itu, perlu diketahui bagaimana pengaruh ekstrak etanol daun sirsak pada jaringan yang telah diinduksi DMBA terhadap kadar glutation (GSH).
B. Rumusan Masalah
Apakah terdapat pengaruh pemberian ekstrak etanol daun sirsak (Annona muricata L.) terhadap kadar glutation jaringan hepar tikus (Rattus norvegicus L.) yang diinduksi7,12 dimethylbenz(a)anthracene(DMBA)?
C. Tujuan Penelitian
1. Tujuan Umum
5
2. Tujuan Khusus
Mengetahui perbedaan pengaruh pemberian ekstrak etanol daun sirsak (Annona muricata L.) antara dosis 20 mg/kgBB dan dosis 40 mg/kgBB terhadap kadar glutation jaringan hepar tikus (Rattus norvegicus L.) yang diinduksi7,12 dimethylbenz(a)anthracene(DMBA).
D. Manfaat Penelitian
1. Manfaat Teoretis
Sebagai sarana pengembangan ilmu pengetahuan bidang farmakologi mengenai pengaruh ekstrak etanol daun sirsak sebagai bahan antioksidan. Selain itu, dapat mengembangkan penelitian diagnostik secara biokimia dan biologi molekuler mengenai tumorigenesis.
2. Manfaat Praktis
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Tanaman Sirsak
1. Deskripsi Tanaman Sirsak
Sirsak (Annona muricata L.) merupakan tanaman yang berasal dari daerah tropis di Benua Amerika, yaitu Hutan Amazon (Amerika Selatan), Karibia dan Amerika Tengah. Di Indonesia tanaman sirsak menyebar dan tumbuh baik mulai dari daratan rendah beriklim kering sampai daerah basah dengan ketinggian 1.000 meter dari permukaan laut (Zuhud, 2011). Berikut sistematika penulisan daun sirsak:
Kingdom : Plantae
Divisio : Spermatophyta Sub Divisio : Angiospermae Ordo : Dicotyldonae Classis : Ranunculales Familia : Annonaceae Genus : Annona
7
Tanaman sirsak telah digunakan sebagai obat tradisional yang dikenal karena sifat antidiare, antidiabetik, obat penenang, pembasmi cacing, larvasida, anti serangga dan parasit. Berbagai studi kimia dan biologi telah dilakukan pada bagian yang berbeda dari tanaman ini, seperti pada buah, batang dan biji. Telah diaporkan bahwa tanaman ini memiliki aktivitas yang beragam, yaitu sebagai antiparasit, antidepresif dan sitotoksik (Luna, 2006).
Gambar 1. Daun Sirsak (Herlina dan Rifai N, 2011).
8
2. Kandungan bioaktif dalam Daun Sirsak a. Annonaceous acetogenin
Annonaceous acetogenin merupakan kelompok dari produk alami poliketida yang diisolasi dari tanaman familiAnnonaceae. Sifat umum dari molekul ini adalah berupa rantai panjang asam lemak sepanjang 35 atau 37 karbon yang diakhiri γ-lakton. Gambar struktur umumnya dapat dilihat pada gambar 2.
Gambar 2. Struktur umumAnnonaceous acetogenin
Di dalam tanaman sirsak telah ditemukan lebih dari 82 jenis
annonaceous acetogenin dan 18 jenis di antaranya ditemukan pada daun sirsak. Acetogenin dari daun ini telah diteliti memiliki sifat sitotoksik terhadap sel kanker yang telah teruji secara in vitro. Selain itu acetogenin juga bersifat sebagai antitumor, antimikroba, antiparasit, antimalaria, antimikroba, antivirus dan antifeedant
9
Tabel 1. JenisAnnonaceous Acetogenindalam Daun Sirsak
No Nama Rumus Molekul Berat
Molekul
17 Cis-Annomuricinone-D C35H64O8 613
18 Trans-Annomuricinone-D C35H64O8 613
(Sumber: Wijaya M, 2012)
10
interior membran dan berinteraksi dengan binding site dari enzim. Inhibisi kompleks I membuat sel kekurangan ATP, menghambat pertumbuhan sel dan mengganggu kinerja sel. Hal tersebut memicu terjadinya kematian sel (McLaughlin, 2006).
Gambar 3. Model McLaughin dalam sifat inhibisi acetogenin pada Kompleks I Mitokondria (McLaughlin, 2006).
b. Tanin
Tanin merupakan grup metabolit sangat kompleks yang larut dalam air. Zat ini dapat dibedakan dengan kandungan polyphenolic lain karena tanin dapat mengendapkan protein. Pada penerapannya tanin dapat digunakan sebagai astrigensia, antibakteri dan antijamur. Tanin
11
menghambat sel tumor yang invasif melalui mekanisme antioksidan sekaligus antidotum golongan alkaloida (Hassanpour, 2011).
c. Flavonoid
Flavonoid merupakan senyawa derivat polifenol yang banyak terdapat pada buah-buahan dan sayuran (Farkas dkk., 2004). Flavonoid memiliki peran sebagai antioksidan dan chelating (kemampuan detoksifikasi senyawa logam) (Lazarus dan Schmitz, 2000; Amelia dkk., 2012).
Flavonoid dapat menghambat proses onkogenesis dengan tiga cara, yang pertama adalah dengan menginduksi apoptosis dan menghentikan siklus sel melalui mekanisme inhibisi enzim topoisomerase, inhibisi sitokrom P-450 sehingga senyawa karsinogen menjadi tidak reaktif dan meningkatkan ekspresi enzim gluthation S-transferase yang dapat mendetoksifikasi karsinogen sehingga cepat dieliminasi tubuh (Lazarus dan Schmitz, 2000).
d. Saponin
12
menghambat pertumbuhan kanker serviks dan sel leukemia (Podolak dkk., 2010).
e. Triterpenoid
Triterpenoid digunakan untuk tujuan pengobatan di banyak negara Asia sebagai antiinflamasi, analgesik, antipiretik, hepatoprotektif, kardiotonik, obat penenang dan pemanfaatan efek tonik. Pada sel tumor, triterpenoid bekerja dengan memblok siklus sel pada fase G2/M dengan menstabilkan benang-benang spindle pada fase mitosis sehingga proses mitosis sel tumor dapat terhambat (Bishayee dkk., 2011).
f. Polifenol danphytosterol
13
Fitosterol merupakan jenis lemak yang berasal dari sumber makanan nabati atau tumbuhan yang mempunyai struktur dan fungsi yang mirip kolesterol dalam tubuh manusia. Fungsi tersebut berkaitan dengan menangkal radikal bebas karena fitosterol memiliki sifat sebagai antioksidan (Del Rio dkk., 2002; Winarsi, 2011).
B. Senyawa7,12 dimethylbenz[a]anthracene(DMBA) sebagai Karsinogen
Senyawa DMBA merupakan suatu karsinogen yang akan bereaksi dengan sitokrom P450 untuk membentuk ikatan kovalen dengan DNA pada sel yang aktif membelah sehingga menyebabkan DNA adduct (DNA yang berikatan dengan molekul lain sehingga mengalami perubahan struktur) (Sigma-Aldrich, 2007).
Gambar 4. Struktur DMBA (Sigma-Aldrich, 2007)
14
menginduksi kanker dengan formasi, latensi dan multiplisitas yang bervariasi (Wongso dan Iswahyudi, 2013).
Pada proses aktivasi, senyawa DMBA (sebagai prokarsinogen) diubah oleh sitokrom P-450 menjadi metabolit reaktif, DMBA-DE (DMBA-dihidrodiolepoksida). Metabolit ini bisa berikatan dengan DNA dan menyebabkan mutasi. Senyawa DMBA memiliki efek stresor oksidatif yang bersifat genotoksik juga imunosupresif. Stres oksidatif oleh karena radikal bebas atau prooksidan intrasel berlebihan bisa terjadi pada sel yang terpapar metabolit DMBA (Hakkak dkk., 2005).
15
Telah diketahui bahwa metabolisme DMBA menjadi metabolit aktif yang bersifat imunosupresan melibatkan enzim CY1P1B1 danmychrosomal epoxide hidrolase. Metabolisme DMBA oleh CY1P1B1 dan enzim epoksida hidrolase mikrosomal akan menghasilkan DMBA-DE. Metabolit DMBA-DE bersifat hematotoksik yaitu menekan eritropoesis pada sumsum tulang dan imunosupresif (Androutsopoulos, 2009).
C. Glutation (GSH)
Glutation adalah senyawa yang mengandung gugus sulfhidril (-SH). Senyawa yang mengandung sulfhidril dibagi menjadi dua kelompok yaitu senyawa gugus–SH protein dan kelompok gugus –SH nonprotein. Glutation merupakan salah satu dari senyawa gugus –SH nonprotein. GSH disentesis oleh enzim γ -glutamil-sisteinsintetase dan glutation sintetase yang terdapat di sitoplasma (Wardaya, 2005).
Gambar 6. Sintesis GSH (Rianti, 2004) γ-glutamil sistein sintetase
Glutamat + sistein + ATP γ-glutamil-sistein ADP + Pi
Glutation sintetase
16
Di dalam sel GSH berperan dalam sintesis prekursor DNA, reduksi ikatan disulfida protein, transpor asam amino, koenzim untuk beberapa enzim dan melindungi sel terhadap radikal bebas dan komponen toksik lain, baik yang berasal dari dalam atau dari luar tubuh. Sebagai antioksidan, GSH dapat bertindak sebagai substrat untuk glutation peroksidase ataupun dapat secara langsung sebagai radikal bebas scavanger. Adanya gugus sulfhidril bebas dalam struktur molekul glutation menyebabkan glutation mampu melindungi sel terhadap beban oksidatif (Ballatori dkk., 2009; Marl dkk., 2009; Murray dkk., 2014). Reaksi perlindungan yang dilakukan oleh gutation dapat dilihat pada Gambar 7.
Gambar 7. Mekanisme perlindungan oleh GSH (Ballatori dkk., 2009).
Selain berperan melindungi gugus –SH protein dan gugus –SH nonprotein, GSH juga berperan dalam detoksifikasi dengan mereduksi lipid hidroksida (LOOH) dan H2O2. Sebagai substrat untuk glutation peroksidase (GSH-Px), GSH dapat mendetoksifikasi hidrogen peroksida (H2O2) dan peroksida organik lainnya. Dari reaksi tersebut hidrogen peroksida akan diubah menjadi H2O dan akan dihasilkan glutation teroksidasi (GSSG) yang dapat direduksi kembali
S SH
Protein + 2GSH Protein + GSSG
S SH
17
menjadi GSH oleh NADPH dengan dikatalis oleh GSH reduktase (GSH-Rx) (Marl dkk., 2009; Wu dkk., 2004). Mekanisme tersebut adalah sebagai berikut:
Gambar 8. Reaksi GSH terhadap H2O2(Wu dkk., 2004)
Dengan demikian, hidrogen peroksida serta berbagai peroksida lain yang terus menerus terbentuk dapat dinetralkan dengan mengubahnya menjadi molekul air (Stephensen dkk., 2007).
D. Hepar Tikus (Rattus novergicus L.)
1. Anatomi
Hepar tikus terdiri atas empat lobus utama yang saling berhubungan di bagian belakang. Lobus tengah dibagi menjadi kanan dan kiri oleh
bifurcatio (percabangan dua) yang dalam. Lobus bagian kiri tidak terbagi sedangkan lobus bagian kanan terbagi secara horizontal menjadi bagian anterior dan posterior. Lobus bagian belakang terdiri atas dua lobus berbentuk daun yang berada di sebelah dorsal dan ventral dari oesophagus
GSH-Px
GSH + R-O-O-R GSSG + ROH + H2O
GSH-Rx
18
sebelah kurvatura dari lambung. Struktur dan komponen hepar tikus sama dengan mamalia lainnya, hanya saja tikus tidak mempunyai kandung empedu dan lobus quadratus seperti mamalia lain. Pada tikus, cairan empedu langsung dialirkan dari hepar ke duodenum melalui ductus choledochus (enterohepatik). Gambar 9 menunjukkan lobus-lobus hepar pada tikus (Komàrek, 2000; Wijayanto H, 2010).
Gambar 9. Anatomi hilar pada hepar tikus (Komàrek, 2000; Aller dkk., 2012).
19
2. Fisiologi Hepar
Hepar merupakan pusat metabolisme tubuh dengan fungsi yang sangat beragam, yaitu:
a. Pembentukan energi dan interkonversi substrat 1) Metabolisme karbohidrat
2) Metabolisme protein 3) Metabolisme lipid.
b. Sintesis dan sekresi protein-protein plasma 1) sintesis albumin dan protein pembekuan darah
2) fungsi pengaturan tekanan darah melalui produksi angiotensinogen 3) fungsi pertumbuhan melalui produksiinsulin like growth factor-1
4) metabolisme hormon melalui produksi steroid hormone-binding globulin(SHBG) danthyroid-binding globulin(TBG).
c. Solubilisasi, transportasi dan penyimpanan 1) Sirkulasi enterohepatik asam empedu
2) Inaktivasi dan detoksifikasi komponen dam metabolit xenobiotik 3) Solubilisasi lipid
4) Produksi protein-protein pengikat. d. Proteksi dan Pembersihan
1) Fungsi fagositik dan endositik sel-sel Kupfer 2) Fungsi endositik hepatosit
2) Metabolisme amonia
20
E. Tumorigenesis
Sel menghasilkan energi melalui proses reduksi molekul O2menjadi H2O. Pada proses metabolisme normal, molekul-molekul oksigen reaktif yang tereduksi dihasilkan dalam jumah kecil sebagai produk sampingan respirasi mitokondrial. Molekul-molekul oksigen reaktif tereduksi ini dikenal sebagai spesies oksigen reaktif (reactive oxygen species,ROS) (Kumar, 2005).
Senyawa ROS ini berasal dari parenkim jaringan, endotel vaskular dan leukosit yang menginfiltrasi akibat respon inflamasi. Pemberian zat karsinogen dapat menginduksi terjadinya respon inflamasi melalui pelepasan mediator inflamasi oleh sel parenkim maupun endotel yang mengalami stres oksidatif (Kumar, 2005).
Stres oksidatif merupakan keadaan terjadinya ketidakseimbangan antara prooksidan dan antioksidan. Jika jumlah antioksidan yang diperlukan oleh tubuh saat mengalami stres oksidatif tidak mencukupi, maka prooksidan tersebut akan merusak membran sel, protein dan DNA (Deoxyribonucleid acid). Penumpukan hasil kerusakan oksidatif yang berulang dan dalam waktu yang lama akan menyebabkan sel atau jaringan kehilangan fungsi dan rusak/mati (Adewole dan Ojewole, 2008).
21
inhibisi terhadap enzim antioksidan yang diproduksi oleh tubuh sehingga menimbulkan kerusakan sel (Sugianto, 2011).
Antioksidan dapat didefinisikan sebagai senyawa yang mampu melawan proses oksidasi di dalam tubuh. Antioksidan dapat digolongkan berdasarkan komponen enzimatisnya menjadi 2, yaitu antioksidan nonenzimatis dan antioksidan enzimatis. Antioksidan nonenzimatis meliputi; vitamin C, E, karotenoid, flavonoid dan asam lipoat. Antioksidan enzimatis atau antioksidan biologis meliputi superoksida dismutase (SOD), katalase, glutation peroksidase (GPx) dan glutation (GSH). Antioksidan enzimatis merupakan sistem pertahanan tubuh intraseluler dalam sitoplasma dan mitokondria, yang bekerja dengan cara memecah senyawa radikal menjadi O2dan H2O. Senyawa ini dapat mencukupi kebutuhan tubuh apabila kondisi kesehatan baik dan suplai gizi terpenuhi (Lobo dkk., 2010).
22
Hasil oksidasi di dalam tubuh berupa komponen radikal bebas dan ROS. Radikal bebas dapat terbentuk di dalam sel maupun di luar sel, yang memicu terjadinya gangguan fisiologis dan biokimia. Beberapa penyakit degeneratif dapat disebabkan oleh aktivitas oksidasi, seperti kelainan kardiovaskuler, diabetes militus tipe II, penuaan dini bahkan kanker (Del Rio dkk., 2002; Lobo dkk., 2010).
Radikal bebas adalah suatu senyawa atau molekul yang mengandung satu atau lebih elektron tidak berpasangan pada orbit terluarnya. Molekul ini bersifat reaktif untuk mencari pasangan dengan cara mengikat elektron molekul yang ada di sekitarnya (Lobo dkk., 2010). Pembentukan radikal bebas di dalam tubuh tidak dapat dihindari karena senyawa ini terbentuk selama proses pembentukan energi dari oksidasi karbohidrat, lemak dan protein. Terutama terjadi akibat adanya kebocoran pada transfer elektron, yaitu radikal bebas dalam bentuk anion superoksida, hidroksil dan lain-lain (Lobo dkk., 2010).
23
Apabila ROS berikatan dengan DNA, maka akan menyebabkan terjadinya DNA adduct. Apabila DNA ini tidak dapat diperbaharui melalui mekanisme DNA repair, maka akan terjadi gangguan pada DNA. Apabila DNA yang sudah berikatan dengan senyawa radikal dan mengalami perubahan susunan basa nitrogen terekspresi pada proses transkripsi, maka akan terjadi perubahan susunan asam amino pada protein. Ini merupakan tahap awal terjadinya perubahan susunan asam amino pada protein tertentu dan dapat menimbulkan gangguan reaksi biokimia tubuh. Jika perubahan ini terjadi pada gen onkogen supresi pertumbuhan, maka akan terjadi pembelahan sel yang tidak terkendali oleh sistem saraf pusat. Ini merupakan tahap awal terjadinya tumor (Winarsi, 2011).
Tumor terjadi sebagai akibat perubahan sel sehingga sel dapat melepaskan diri dari mekanisme pengaturan pertumbuhan normal. Perubahan sel ini disebut dengan istilah transformasi. Dasar transformasi adalah kelainan di dalam genom dari sel yang mengalami transformasi. Kebanyakan tumor terjadi karena faktor lingkungan seperti zat kimia, radiasi atau virus dan sebagian kecil karena adanya kelainan yang diwariskan di dalam sel germinatuvum (Kumar, 2005).
24
terjadinya mutasi luas pada genom dan tranformasi neoplastik. Setiap gen kanker memiliki fungsi spesifik, yang disregulasinya ikut berperan dalam perkembangan kanker (Kumar, 2005).
Gambar 11. Skema Dasar Molekuler Tumorigenesis (Kumar, 2005)
25
F. Kerangka Penelitian
1. Kerangka Teori
Sel kanker adalah akumulasi sejumlah perubahan genetik yang berperan terhadap kejadian tumorigenesis, tumor progression dan resistensi terhadap kemoterapi (Abdulmuthalib dan Adiwijoyono. 2009).
Tanaman sirsak (Annona muricata L.) memiliki kandungan seperti
26
benang-benang spindle pada fase mitosis sehingga proses mitosis sel tumor dapat terhambat (Bishayee dkk., 2011).
Senyawa DMBA memiliki efek stresor oksidatif yang bersifat genotoksik juga imunosupresif. Stres oksidatif oleh karena radikal bebas atau prooksidan intrasel berlebihan bisa terjadi pada sel yang terpapar metabolit DMBA (Androutsopoulos, 2009).
27
Gambar 12. Kerangka Teori Ekstrak Etanol Daun
Sirsak
(Annona muricata L.) DMBA
Senyawa aktif:
Acetogenins,flavonoid, saponin, Tanin, polifenol, fitosterol dan triterpenoid
Antitumor dan antioksidan
Stres oksidatif dan kerusakan sel
Tumorigenesis
Peningkatan kadar glutation
28
2. Kerangka Konsep
Berikut ini adalah diagram kerangka konsep ekstrak etanol daun sirsak dan kadar glutation.
Gambar 13. Kerangka Konsep
G. Hipotesis
Terdapat pengaruh pemberian ekstrak etanol daun sirsak (Annona muricata L.) terhadap peningkatan kadar glutation (GSH) pada jaringan hepar tikus yang diinduksi oleh7,12 dimethylbenz(a)anthracene(DMBA).
Kadar glutation pada hepar tikus yang diinduksi
DMBA
Ekstrak Etanol daun sirsak 40mg/kgBB
Ekstrak Etanol daun sirsak 20mg/kgBB
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis Penelitian
Penelitian ini merupakan lanjutan dari penelitian yang dilakukan oleh dr. Tiwuk Susantiningsih, M.Biomed mengenai pengaruh pemberian ekstrak etanol daun sirsak terhadap tumorgenesis hepar tikus putih betina yang diinduksi oleh DMBA. Penelitian tersebut merupakan penelitian eksperimental laboratorik dengan desain penelitian Rancangan Acak Lengkap (RAL) dan metode case control study. Tikus yang telah diberikan perlakuan kemudian diambil heparnya untuk dilakukan pengukuran kadar glutation.
B. Tempat dan Waktu Penelitian
✁
C. Populasi dan Sampel
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini merupakan sampel dari penelitian yang dilakukan oleh dr. Tiwuk Susantiningsih, M.Biomed. Sampel yang digunakan adalah organ hepar yang telah diisolasi dari tikus putih betina galurSprague Dawleysetelah diinduksi DMBA dan pemberian ekstrak etanol daun sirsak dengan dosis dan kurun waktu tertentu.
Setiap perlakuan menggunakan pengulangan dengan rumus Federer (1977) untuk desain penelitian eksperimen laboratorik rancangan acak lengkap yaitu:
t (n-1)≥ 15
keterangan:
(t) = kelompok perlakuan
(n) = jumlah sampel perkelompok perlakuan
t (n-1)≥ 15
✂ ✄
D. Bahan dan Alat Penelitian
1. Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian adalah : a. Organ hepar tikus yang telah diberi perlakuan
b. Phosphat Buffer Saline(PBS) 0,1 M pH 7,0, 7,4 dan 8,0 c. Pereaksi untuk pengukuran kadar glutation (GSH):
- GSH standar
- TCA (asam trikloroasetat) 5% - DTNB (ditio bisnitro benzoat)
2. Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian adalah : 1. Neraca analitik
2. Testube2 mL
3. Freezer suhu -4 ºC dan -80 ºC
4. Alat-alat laboratorium (gelas-gelas kimia, sendok, labu ukur, batang pengaduk, tabung reaksi, botol penyimpan larutan dll)
5. Spektrofotometer UV-visible lambda3 B-Perkins Elmerdan tabung kuvet
☎ ✆
E. Prosedur Penelitian
1. Penyimpanan Organ
Berat hati masing-masing tikus ditimbang dan dicatat kemudian hati ditempatkan ke dalam wadah steril pada suhu -4ºC selama 1 hari. Setelah itu, suhu diturunkan hingga mencapai -80ºC. Organ hepar tikus disimpan di dalamfreezersampai dilakukan pembuatan homogenat.
Sebelum dilakukan prosedur pembuatan homogenat, pertama-tama naikkan suhu freezer berisi organ hepar yang akan diteliti dari suhu -80ºC sampai dengan suhu -4ºC selama 1 hari. Setelah itu, timbang kembali organ hepar tersebut.
2. Pembuatan Homogenat Jaringan Hepar
Sebanyak 100 mg jaringan hepar ditambahkan dengan larutan PBS 0,1 M pH 7,4 sebanyak 0,5 mL, haluskan dengan mesin vortex dan micropestle.
✝✝
3. Pembuatan larutan standar pengukuran kadar GSH
Pembuatan larutan standar untuk pengukuran kadar glutation jaringan hepar menggunakan DTNB (Ditio bisnitro benzoate). Prinsip pengukuran yaitu reaksi antara DTNB dengan GSH menghasilkan senyawa tionitro benzoat yang berwarna kuning.
Sebanyak 4 mg standar glutation dilarutkan dalam 2 mL PBS 0,1 M pH 8,0, kemudian dibuat dalam 2mg/mL. Dari larutan tersebut dibuat larutan glutation dengan berbagai kandungan (0 µL, 1 µL, 2 µL, 4 µL, 5 µL dan 10 µL). Tambahkan 200 µL TCA 5% ke dalam masing-masing tabung, kocok sampai homogen. Tambahkan larutan PBS 0,1 M pH 8,0 ke dalam masing-masing tabung hingga volume mencapai 1.800 µL, campur hingga homogen. Kemudian ambil 800 µL larutan ke tabung lain untuk dicampurkan dengan 25 µL DTNB, inkubasi selama 1 jam pada ruang gelap. Larutan DTNB dibuat dari 39,6 mg DTNB yang dilarutkan dalam 10 mL PBS 0,1 M pH 7,0 dibuat dalam 3,96 mg/ml. Sisa larutan di dalam tabung (1200 µL) dijadikan sebagai blanko. Selanjutnya diukur serapan absorban standar terhadap blanko dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 412 nm.
✞ ✟
4. Pengukuran kadar Glutation (GSH) Metode Ellman
Ke dalam 50 µL sampel homogenat jaringan hepar ditambahkan 200 µL TCA 5% dan 1.750 µL PBS pH 7,0, kocok sampai homogen. Kemudian larutan disentrifugasi pada 3500 rpm selama 10 menit. Dari larutan tersebut diambil 800 µL supernatan dan tambahkan 25 µL DTNB, diamkan selama 1 jam pada ruang gelap. Sisa larutan supernatan digunakan sebagai blanko. Selanjutnya diukur serapan absorban sampel dan terhadap blanko dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 412 nm.
Seluruh sampel diukur dengan prinsip duplo (dua kali pengukuran) untuk menghindari kesalahan dalam penghitungan. Diagram pembuatan homogenat dan pengukuran GSH terlampir (lampiran II dan III).
F. Identifikasi Variabel dan Definisi Operasional Variabel
1. Identifikasi Variabel
a. Variabel Independen
Variabel independen adalah dosis ekstrak etanol daun sirsak (Annona muricata L.)
b. Variabel Dependen
✠ ✡
2. Definisi Operasional Variabel
Untuk memudahkan penelitian agar penelitian tidak menjadi terlalu luas, maka dibuat definisi operasional pada Tabel 2 sebagai berikut:
Tabel 2. Definisi Operasional Variabel
Variabel Kelompok Skala
Ekstrak etanol daun sirsak
Terdapat 4 kelompok dengan perlakuan berbeda • Sampel dengan perlakuan negatif sebagai
kelompok kontrol. Tidak diinduksi DMBA, hanya aquadest 1 mL per hari selama 4 minggu
• Sampel dengan perlakuan positif yang telah diinduksi DMBA 20 mg/kgBB 2 kali dalam seminggu selama 4 minggu
• Sampel dengan perlakuan positif yang telah diinduksi DMBA 20 mg/kgBB 2 kali dalam seminggu selama 4 minggu dan ekstrak etanol daun sirsak dosis 20mg/kgBB 1 kali sehari selama 4 minggu
• Sampel dengan perlakuan positif dengan yang telah diinduksi DMBA 20 mg/kgBB 2 kali dalam seminggu selama 4 minggu dan ekstrak etanol daun sirsak dosis 40 mg/kgBB 1 kali sehari selama 4 minggu
Kategorik (nominal)
Kadar Glutation (GSH)
Kadar glutation dapat menggambarkan tingkat kerusakan sel hepar akibat induksi zat yang menyebabkan terjadinya stres oksidatif. Kadar GSH dinilai dengan mengamati adanya
☛6
Tabel 2 (lanjutan)
perubahan yang signifikan antarkelompok perlakuan. Semakin tinggi kadar GSH antarkelompok perlakuan, maka semakin baik efek protektif ekstrak etanol daun sirsak terhadap zat karsinogen (Riani, 2004).
G. Pengolahan dan Analisis Data
Data yang diperoleh dari hasil pengukuran kadar GSH merupakan data numerik. Data tersebut dianalisis menggunakan aplikasi statistik.
1. Uji Normalitas dan Homogenitas (p>0,05)
Hasil penelitian dianalisis apakah data terdistribusi normal atau tidak secara statistik dengan menggunakan uji normalitas Shapiro-Wilk. Uji ini digunakan untuk menguji data yang berjumlah≤50. Kemudian dilakukan uji Levene untuk mengetahui apakah dua atau lebih kelompok data memiliki varians yang sama atau tidak. Jika varians data berdistribusi normal dan homogen, dilanjutkan dengan metode uji parametrik.
2. Uji Parametrik
☞ ✌
3. UjiPost-hoc
Hipotesis dianggap bermakna bila nilai p<0,05. Jika pada uji parametrik
one way ANOVA atau uji nonparametrik Kruskal-Wallis menghasilkan nilai p<0,05, maka dapat dilanjutkan dengan melakukan analisis Post-Hoc LSD untuk melihat perbedaan antarkelompok perlakuan lebih terinci. Analisis Post-hoc untuk uji Kruskal-Walis adalah dengan uji
Mann-Whitney.
H. Diagram Alir Penelitian
Pada penelitian sebelumnya telah diberikan beberapa perlakuan pada beberapa kelompok hewan coba. Sampel terbagi ke dalam 4 (empat) kelompok, yaitu kelompok N sebagai kelompok kontrol negatif, kelompok P sebagai kelompok kontrol positif dan 2 kelompok perlakuan (kelompok P20 dan P40).
✍8
✎9
Gambar 14. Diagram Alir Penelitian Pembuatan homogenat jaringan
hepar
Pengukuran kadar GSH jaringan hepar
Hasil pengukuran kadar GSH jaringan hepar (Abs)
Kurva standar pengukuran GSH jaringan hepar
Kadar GSH jaringan hepar
Pengolahan dan analisis data Pengeluaran sampel dari
deep freezing preservation
Sampel disimpan dalam suhu -4ºC selama 1 hari
N P P20 P40
Sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 10 menit
Larutan standar GSH
✏ ✑
I. Etika Penelitian
BAB V
SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
Terdapat perbedaan pengaruh pemberian ekstrak etanol daun sirsak (Annona muricata L.) antara dosis 20 mg/kgBB dan 40 mg/kgBB terhadap peningkatan kadar glutation jaringan hepar tikus putih (Rattus norvegicus L.) yang telah diinduksi 7,12dimethylbenz(a)anthracene(DMBA).
B. Saran
1. Peneliti lain disarankan untuk menguji lebih lanjut terkait toksisitas dan efektivitas ekstrak etanol daun sirsak
2. Peneliti lain disarankan untuk meneliti lebih lanjut terkait penggunaan ekstrak etanol daun sirsak dalam jangka waktu yang lebih lama terhadap peningkatan kadar glutation jaringan hepar tikus.
DAFTAR PUSTAKA
Abdulmuthalib, Adiwijoyono. 2009. Onkologi Medik. Dalam: Sudoyo AW, Setyohadi B, Alwi I, Simadibrata MK, Setiati S. (penyunting). Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam Edisi ke-V. Jakarta: Interna Publishing 1407-1519 Adewole SO, Ojewole JAO. 2008. Protective effects of Annona muricata L.
(annonaceae) leaf aqueous extract on serum lipid profiles & oxidative stress in hepatocytes of streptozotocintreated diabetic rats. African Journal of Traditional, Complementary and Alternative Medicines. 6(1):30-41. Aller MA, Arias N, Prieto I, Agudo S, Gilsanz C, Lorente L, Arias JL, Arias J.
2012. A half century (1961-2011) of applying microsurgery experimental liver research. World J Hepatol 2012 July 27; 4(7): 199-208. Available from: http://www.wjgnet.com/1948-5182office. Diakses pada tanggal 27 September 2014.
Alwan A, MacLean DR, Riley LM, d’Espaignet ET, Mathers CD, Stevens GA, Bettcher D. 2010. Monitoring and surveillance of chronic noncommunicable disease: progress and capacity in high-burden countries. The Lancet, 376: 1861-1868
Amelia F, Angelin E, Wahyu K. 2012. Tablet Salut Enterik Etanol Daun Sirsak (Annona muricata L.) Sebagai Anti Kanker Kolon yang Potensial. Yogyakarta: Fakultas Kedokteran Universitas Gajah Mada.
Androutsopoulos VP, Tsatsakis AM, Spandidos DA. 2009. Cytokrom P450 CYP1A1: wider roles in cancer progression and prevention 9:187. BMC Cancer.
Ballatori N, Krance SM, Notenboom S, Shi S, Tieu K, Hammond CL. 2009. Glutathione dysregulation and the etiology and progression of human diseases. Biol Chem 390(3): 191–214. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2756154/. Diakses pada tanggal 8 Oktober 2014.
Baskar R, Kumar TS, Rajeswari V. 2007. In vitro antioxidant studies in leaves of annona species. Indian J. Exp. Biol. 45(5):480-5.
61
Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3057757/. Diakses pada tanggal 30 September 2014.
Dahlan MS. 2013. Statistik untuk kedokteran dan kesehatan Edisi 5. Jakarta: Salemba Medika. 31-60; 87-128; 167-188.
Del Rio LA, Corpas FJ, Sandalio LM, Palma JM, Gomez M, Barroso JB. 2002. Reactiveoxygen species, antioxidant systems and nitric oxide in peroxisomes in: Antioxidants And Reactive Oxygen Species In Plants . J. Exp. Bot. 53 (372): 1255-1272. Available from http://www.jbiomedsci.com/content/17/1/67. Diakses pada tanggal 27 September 2014.
Farkas O, Jakus J, Héberger K. 2004. Quantitative structure-antioxidant activity relationships of flavonoid compounds. 9(12):1079-88. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18007505. Diakses pada tanggal 11 April 2014.
Federer WT. 1977. Experimental Design Theory And Application. Third Edition. New Delhi Bombay Calcuta: Oxford and IBH Publishing Co.
Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM. 2010. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. Int. J: Cancer, 127: 2893-2917
Guyton AC, Hall JE. 2008. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Edisi 11. Jakarta: EGC. 791-807
Hakkak. 2005. Obesity promotes 7,12-dimethylbenz(a)anthracene-induced mammary tumor development in female zucker rats. Breast Canc Res 7: 627-633.
Hamizah H, Roslida AH, Fezah O. 2012. Chemopreventive Potential Of Annona muricata L. Leaves On Chemically-Induced Skin Papillomagenesis In Mice. Asian Pacific J Cancer Prev. 13: 2533-2539. Available from: http://dx.doi.org/10.7314/APJCP.2012.13.6.2533. Diakses pada tanggal 18 Maret 2014.
Hartono IA, Indra MR, Rahayu P. 2013. Pengaruh pemberian ekstrak metanol daun kelor (Moringa oleifera) terhadap jumlah CSCs (cancer stem cells) pada tikus (Rattus norvegicus) yang diinduksi DMBA (7,12 dimetilbenz[α]anthrancene). [Skripsi]. Malang: Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.
Hassanpour S, Sis NM, Eshratkhah B, Mehmandar FB. 2011. Plants and Secondary Metabolites (Tannins): A Review. Available from http://www.ijfse.com/index.php/IJFSE/article/view/IJFSEVol%201%281 %29-2011-8. Diakses pada tanggal 28 Mei 2014
62
Kementrian Kesehatan Republik Indonesia. 2011. Formularium obat herbal asli Indonesia Vol. 1. Jakarta: DIPA Satker Direktorat Bina Pelayanan Kesehatan Tradisional, Alternatif, dan Komplementer: 176-178
Khopkar S. 2007. Konsep Dasar kimia Analitik. Jakarta : UI Press.
Komàrek V. 2000. Gross Anatomy Chapter 13. Prague, Czech Republic: Agricultural University :253-275
Kumar V, Cotran RS, Robbins SL. 2007. Buku Ajar Patologi 7th ed, Vol. 2. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta. 860-1.
Lazarus SA, Schmitz HH. 2000. Dietary flavonoids may promote health, prevent heart disease. California Agriculture 54(5):33-39. Available from: http://californiaagriculture.ucanr.edu/landingpage.cfm?article=ca.v054n05 p33&fulltext=yes. Diakses pada 30 September 2014.
Lobo V, Patil A, Phatak A, Chandra N. 2010. Free radicals, antioxidants and functional foods: Impact on human health. 4(8): 118–126. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3249911/. Diakses pada tanggal 26 September 2014.
Luna JDS, Carvalho JM, Lima MRF, Bieber W, Bento, Edson S, Franck X, Sant’ana AEG. 2006. Acetogenins in Annona muricata L. (Annonaceae) Leaves are Potent Molluscicides. Natural Product Research 20(3): 253-57. Marl M, Morales A, Colell A. Garcia-Ruiz C, Fernandez-Checa JC. 2009.
Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant. 11(11): 2685-2700. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2821140/. Diakses pada tanggal 8 Oktober 2014.
Mclaughlin. 2006. Paw-paw and Cancer Annonaceous Acetogenin from discovery to Comercial Products. Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology. School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. Purdue University 71(7):1311–1321
Meiyanto E, Susilowati S, Tasminatun S, Murwanti R, Sugiyanto. 2007. Efek kemopreventif ekstrak etanolik Gynura procumbens (Lour), merr pada karsinogenesis kanker payudara tikus. Majalah Farmasi Indonesia. 18(3): 154 -161.
Murray RK, Bender DA, Botham KM, Kennelly PJ, Rodwell VW, Weil PA. 2014. Biokimia Harper. Edisi 29. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. hlm. 137-148; 393-419; 562-582; 613-618; 766-814.
63
Pertiwi AS, Susantiningsih T, Fiana DN, Carolia N. 2014. The effect of giving soursop leaves (Annona Muricata L.) extract to lung histopathology appearance on female rats induced by carcinogen 7,12 dimethylbenz[α]anthrancene (DMBA). Lampung: Majority FK Unila
Podolak I, Galanty A, Sobolewska D. 2010. Saponins as cytotoxic agents: a review. 9(3): 425–474. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2928447/. Diakses pada tanggal 27 September 2014.
Ranasasmita R. 2008. Aktivitas antikanker ekstrak etanol daun Aglaia elliptica blume pada tikus betina yang diinduksi 7,12 dimetilbenz[α]antransena. [Skripsi]. Bogor: FMIPA IPB
Retnani V. 2011. Pengaruh suplementasi ekstrak daun Annona muricata terhadap kejadian displasia epitel kelenjar payudara tikus Sprague dawley yang di induksi 7,12 dimetilbenz[α]anthrancene. [Skripsi]. Semarang: Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro.
Riani T. 2004. Pengaruh pemberian tomat (Solanum lycopersicum) terhadap kadar glutation tereduksi, aktivitas katalase serta aktivita glutamat piruvat transaminase pada tikus yang diberi karbon tetraklorida. [Tesis]. Jakarta: Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia
Riskesdas. 2008. Riset Kesehatan Dasar dalam: Laporan Nasional 2007. Jakarta: Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Depkes RI
Sherwood L. 2011. Fisiologi Manusia dari Sel ke Sistem, Edisi 2. Jakarta: EGC. hlm. 537-587.
Sigma-Aldrich. 2007. 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene. Available from: http://www.sigmaaldrich.com. Diakses pada tanggal 27 September 2014. Stephensen CB, Marquis GS, Douglas SD, Kruzich LA, Wilson CM. 2007.
Glutathione, glutathione peroxidase and selenium status in HIV-positive and HIV-negative adolescents and young adults. American Society for Nutrition Am J Clin Nutr 85:173–81.
Susantiningsih T, Putri AM, Nuriah. 2013. Ekspresi gen vascular endothelial growth factor (VEGF) jaringan payudara tikus yang diinduksi karsinogen DMBA (7,12 dimethylbenz(a)anthracene) dengan pemberian ekstrak daun sirsak (Annona muricata L). Lampung: Hibah Penelitian PHK HPEQ FK Unila
Day JRRA dan Underwood AL. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif Edisi 6. Jakarta: Erlangga. hlm. 382-421.
64
Wijaya M. 2012. Ekstraksi annonaceous acetogenin dari daun sirsak, Annona muricata, sebagai senyawa bioaktif antikanker. [Skripsi]. Depok: FTUI Wijayanto H. 2010. Application of The Multimedia Equipments To Encourage
Students in Studying Veterinary Anatomy. Kongres South East Asia Veterinary School Association (SEAVSA). IPB Bogor.
Winarsi H. 2011. Antioksidan alami dan radikal bebas: potensi dan aplikasinya dalam kesehatan. Cetakan ke-5. Yogyakarta: Penerbit Kanisius. hlm. 100-105
World Health Organization. 2013. Preventing Chronic Disease a Vital Investment. (http://www.who.int/chp/chronic_disease_report/en/). Diakses tanggal 28 Agustus 2014.
Wongso H dan Iswahyudi. 2013. Induksi kanker pada tikus putih sprague dawley sebagai hewan model dalam penelitian radiofarmaka. Prosiding seminar nasional sains dan teknologi nuklir (PTNBR). Bandung: BATAN
Wu G, Fang YZ, Yang S, Lupton JR, Turner ND. 2004. glutathione metabolism and its implications for health. J. Nutr. 134: 489–492. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14988435. Diakses pada tanggal 8 Oktober 2014.
