KERAGAMAN GEN
CSN3
EKSON
4 PADA KAMBING
PERANAKAN ETAWAH DI BPTU KDI-HPT
PELAIHARI KALIMANTAN SELATAN
FREDY FENDER
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Keragaman Gen CSN3 Ekson 4 pada Kambing Peranakan Etawah di BPTU KDI-HPT Pelaihari Kalimantan Selatan adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Oktober 2014
ABSTRAK
FREDY FENDER. Keragaman Gen CSN3 Ekson 4 pada Kambing Peranakan Etawah di BPTU KDI-HPT Pelaihari Kalimantan Selatan. Dibimbing oleh RINI HERLINA MULYONO dan JAKARIA.
Kambing PE sebagai sumber daya genetik ternak lokal Indonesia memiliki keunggulan, salah satunya produksi susu yang tinggi. Gen CSN3 merupakan anggota dari fragmen kasein yang berkaitan dengan protein dan kasein susu. Tujuan penelitian ini mengidentifikasi keragaman gen CSN3 ekson 4 pada kambing PE di BPTU KDI-HPT Pelaihari Kalimantan Selatan, menggunakan metode PCR-RFLP. Keragaman gen CSN3 dideteksi dari 115 sampel darah kambing PE menggunakan enzim restriksi PstI yang memotong fragmen CTGCA|G. Amplifikasi gen CSN3 menghasilkan 1 fragmen dengan panjang 407 pb yang terletak pada ekson 4 dengan suhu annealing 60 °C selama 20 detik. Hasil analisis PCR-RFLP menunjukkan gen CSN3 kambing PE yang dianalisis memiliki alel monomorfik F adalah 100%.
Kata kunci: gen CSN3, kambing PE, PCR-RFLP
ABSTRACT
FREDY FENDER. Polymorphism of Exon 4 CSN3 of Etawah Grade Goats in BPTU KDI-HPT Pelaihari South Kalimantan. Supervised by RINI HERLINA MULYONO and JAKARIA.
Etawah grade goat as one of Indonesian local animal genetic resources has advantages, one of which is its high milk yield. CSN3 gene is a member of casein fragment related to protein and casein contents. The aim of this study was to identify polymorphisms of CSN3 in Etawah grade goat from BPTU KDI-HPT Pelaihari, South Kalimantan using the PCR-RFLP method. Polymorphisms of CSN3 gene were identified of 115 blood samples using PstI restriction enzyme that cuts the fragment of CTGCA|G. CSN3 amplification resulted 407 bp which is located at exon 4 was performed with annealing temperature 60 °C for 20 seconds. The results of PCR-RFLP analysis indicated that the analyzed CSN3 gene of Etawah grade goat which have monomorphic F allele was 100%.
KERAGAMAN GEN
CSN3
EKSON
4 PADA KAMBING
PERANAKAN ETAWAH DI BPTU KDI-HPT
PELAIHARI KALIMANTAN SELATAN
FREDY FENDER
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Peternakan
pada
Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR
9
Judul Skripsi : Keragaman Gen CSN3 Ekson 4 pada Kambing Peranakan Etawah di BPTU KDI-HPT Pelaihari Kalimantan Selatan
Nama : Fredy Fender
NIM : D14100011
Disetujui oleh
Ir Rini Herlina Mulyono, MSi Pembimbing I
Dr Jakaria, SPt MSi Pembimbing II
Diketahui oleh
Prof Dr Ir Muladno, MSA Ketua Departemen
PRAKATA
Puji dan syukur Penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala penguasa dan sumber segala ilmu, karena berkat segala karunia-Nya skripsi ini berhasil diselesaikan. Sholawat dan salam semoga senantiasa tercurahkan kepada Nabi Muhammad sollallahu ’alaihi wasallam, keluarganya, sahabatnya, serta umatnya yang beriman hingga akhir zaman. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan pada Desember 2013 sampai April 2014 adalah kambing lokal Indonesia dengan judul Keragaman Gen CSN3 Ekson 4 pada Kambing Peranakan Etawah di BPTU KDI-HPT Pelaihari Kalimantan Selatan.
Perbaikan mutu genetik kambing PE masih dilakukan secara konvensional. Selain itu, upaya dalam memperbaiki mutu genetik kambing PE perlu didukung data yang lebih akurat, yaitu dilakukan seleksi dengan identifikasi keragaman pada tingkat DNA termasuk gen CSN3 yang berperan pada kualitas susu. Hasil penelitian ini diharapkan memberikan informasi khususnya kepada breeder kambing perah dan peternak ternak perah secara umum sehingga dapat ditentukan gen yang menjadi marker assisted selection dalam program pemuliaan.
Terima kasih kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi RI atas bantuan Beasiswa Bidikmisi selama masa perkuliahan S1. Terima kasih kepada Ir Rini Herlina Mulyono, MSi yang mendanai penelitian sekaligus sebagai pembimbing skripsi bersama Dr Jakaria, SPt MSi. Terima kasih kepada Dr Ir Afton Atabany, MSi selaku penguji skripsi atas masukan dan sarannya. Penghargaan Penulis sampaikan kepada Fuad Hasan, SPt MSi dan Pipih S Effendi, SPt yang membantu pengumpulan bahan penelitian di BPTU KDI-HPT Pelaihari Kalimantan Selatan.
Ungkapan terima kasih Penulis sampaikan kepada Ayahanda Edi Kusmayadi, Ibunda Nurlela, kakak Retno Valentino, dan adik Edo Fernando, beserta seluruh keluarga besar atas do’a dan kasih sayangnya. Terima kasih kepada M Jafar Sidiq dan Angga BP Suparman sebagai tim penelitian genetika molekuler kambing PE, atas kerja sama, kekompakkan, dan bantuan selama penelitian. Terima kasih kepada Laras Shafa Fauziah, Novita S Thamren, Leonardus KD Bidara, Hafidz I Albana, dan M Faisal Nurhuda yang mendukung Penulis dalam penulisan skripsi. Tak lupa terima kasih kepada Eryk Andreas, SPt MSi; Annisa O Rini, SPt MSi; Isyana Khaerunnisa, SPt; Ahmad Furqon, SPt; Komang Alit Paramitasari, SPt MSi; Shelvi, SSi; dan teman-teman ABGSCi (Animal Breeding and Genetic Student Community) atas banyak masukan dan arahannya. Terima kasih kepada teman-teman D’Ransum Percussion atas semangat dan dukungannya. Terima kasih juga kepada keluarga besar IPTP angkatan 47 atas semua dukungannya. Semoga hasil penelitian ini bermanfaat bagi semua pihak yang membutuhkan.
Bogor, Oktober 2014
11
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR viii
DAFTAR LAMPIRAN viii
PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Tujuan Penelitan 1
Ruang Lingkup Penelitian 2
METODE 2
Lokasi dan Waktu Penelitian 2
Bahan 2
Alat 2
Prosedur 3
Ekstraksi DNA Total 3
Amplifikasi 3
Genotyping 4
Analisis Data 4
Frekuensi Alel dan Genotipe 4
HASIL DAN PEMBAHASAN 5
Amplifikasi Gen CSN3 5
Genotyping Gen CSN3 5
Frekuensi Alel Gen CSN3 dan Pendugaan Kandungan Kasein Susu Kambing PE Penelitian Berdasarkan Asosiasi antara Gen CSN3 dengan Kandungan Kasein Susu Kambing pada Penelitian Lain 7
SIMPULAN DAN SARAN 8
Simpulan 8
Saran 8
DAFTAR PUSTAKA 9
LAMPIRAN 11
DAFTAR GAMBAR
1 Posisi penempelan primer dan situs restriksi PstI pada fragmen gen
CSN3 ekson 4 3
2 Amplikon gen CSN3 ekson 4 pada gel agarosa 1.5% 5
3 Genotipe gen CSN3 ekson 4 pada gel agarosa 2% 6
4 Lokasi mutasi situs restriksi PstI dan perbandingan sekuen fragmen gen CSN3 ekson 4 pada kambing di berbagai wilayah 7
DAFTAR LAMPIRAN
1 Melting temperature (Tm) primer forward (F) dan reverse (R) gen CSN3
ekson 4 11
2 Sekuen mRNA gen CSN3 yang diakses di GenBank kode aksesi X60763 11 3 Sekuen gen CSN3 ekson 4 alel F yang diakses di GenBank kode aksesi
AY090466 13
4 Sekuen gen CSN3 ekson 4 alel M yang diakses di GenBank kode aksesi
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kambing Peranakan Etawah (PE) berpotensi sebagai salah satu sumber daya genetik ternak yang dapat dikembangkan lebih luas untuk memenuhi kebutuhan masyarakat. Kambing PE merupakan galur hasil persilangan antara kambing Etawah dan kambing Kacang dengan kadar genetik lebih tinggi pada kambing Etawah karena telah melalui program up grading (kawin tatar). Kambing PE memiliki kemampuan adaptasi yang cukup tinggi dan memiliki fungsi sebagai penghasil daging dan susu (dwiguna) (Atabany 2013).
Populasi kambing di Indonesia pada tahun 2012 mencapai 17.91 juta ekor yang sebagian besar menyebar di Jawa Tengah, Jawa Timur, dan Jawa Barat (Ditjennak 2013). Finesco (2013) menyatakan bahwa lima juta ekor dari populasi kambing di Indonesia adalah kambing PE. Produksi susu kambing PE mampu mencapai 3 L ekor-1 hari-1 (Menteri Pertanian RI 2013). Kualitas susu kambing PE belum banyak diperhatikan, seperti kandungan kasein dalam protein susu. Kasein dalam protein susu berperan memperbaiki struktur yogurt (Buckle et al. 2010), selain itu dapat diolah menjadi keju lunak atau keju keras (Atabany 2013).
Struktur dan stabilitas misel kasein protein susu dikontrol oleh gen κ-kasein (CSN3) yang terletak pada kromosom nomor 6q31 dengan panjang 13 kb dan terdiri atas 5 ekson dan 4 intron (Threadgill dan Womack 1990). Keragaman gen CSN3 berpengaruh pada kandungan protein dan lemak susu pada sapi Czech Fleckvieh (Kucerova et al. 2006) dan kandungan protein susu pada sapi FH (Sumantri et al. 2004). Chiatti et al. (2005) melaporkan keragaman gen CSN3 pada kambing berhubungan dengan protein dan kasein susu. Hingga saat ini sudah ditemukan 20 macam alel gen CSN3 pada kambing (Coll et al. 1993; Yahyaoui et al. 2001; Angiolillo et al. 2002; Yahyaoui et al. 2003; Chessa et al. 2003; Jann et al. 2004; Prinzenberg et al. 2005; Kiplagat et al. 2010). Keragaman gen CSN3 pada kambing PE diharapkan dapat digunakan dalam program seleksi untuk meningkatkan produksi kasein susu.
Perkembangan bioteknologi bidang genetika molekuler memungkinkan penggunaan penanda molekuler untuk mengukur status keragaman genetik melalui pemanfaatan marker assisted selection (MAS). Keragaman gen CSN3 diharapkan dapat dijadikan MAS dalam program seleksi kambing PE. Teknik polymorphism chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) merupakan salah satu metode yang mudah dilakukan untuk mendeteksi keragaman genetik yang berhubungan dengan sifat-sifat pertumbuhan. Penelitian mengenai keragaman gen CSN3 kambing sudah banyak dilakukan, tetapi pada kambing PE di Balai Pembibitan Ternak Unggul Kambing Domba Itik Hijauan Pakan Ternak (BPTU KDI-HPT) Pelaihari Kalimantan Selatan belum dilakukan.
Tujuan Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini meliputi analisis pada 115 sampel darah kambing PE (8 ekor jantan dan 107 ekor betina) yang terdapat di BPTU KDI-HPT Pelaihari Kalimanatan Selatan. Keragaman gen CSN3 ekson 4 dianalisis menggunakan metode PCR-RFLP dengan enzim restriksi PstI (CTGCA|G).
METODE
Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, Bagian Pemuliaan dan Genetika, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian berlangsung dari Desember 2013 sampai April 2014.
Bahan
Sampel darah yang digunakan berasal dari 115 ekor darah kambing PE (8 ekor jantan dan 107 ekor betina) yang berasal dari BPTU KDI-HPT Pelaihari, Kalimantan Selatan yang telah diawetkan dalam EtOH 70% dengan perbandingan 1:1 atau dalam serbuk EDTA. Bahan-bahan yang digunakan untuk ekstraksi DNA diantaranya sampel darah, NaCl 0.2% (untuk sampel darah yang diawetkan dalam EDTA), DW (untuk sampel darah yang diawetkan dalam EtOH 70%), SDS (sodium dodecylsulphate) 10%, proteinase-K (5 mg mL-1), 1×STE (sodium tris-EDTA), phenol solution, CIAA (chloroform isoamylalcohol), NaCl 5M, dan TE (tris-EDTA) 80%. Bahan-bahan yang digunakan untuk prosedur amplifikasi (PCR), elektroforesis, dan analisis RFLP diantaranya isolat DNA, DreamTaq Buffer, MgCl2, dNTPs (deoxyribonucleotide triphosphate), pasangan primer forward dan primer reverese, DreamTaq polymerase (fermentas), produk PCR (amplikon), serbuk agarosa, 0.5×TBE (tris borat-EDTA), EtBr (etidium bromida), loading dye (0.01% xylene cyanol, 0.01% bromthymol blue, dan 50% gliserol), DNA marker dengan jarak 100 pb (pasang basa), enzim restriksi PstI (CTGCA|G), dan Buffer O.
Alat
3
Prosedur
Ekstraksi DNA Total
Ekstraksi DNA dilakukan berdasarkan metode Sambrook et al. (1989). Darah dalam EtOH diambil sebanyak 200 μL, lalu ditambahkan 1 000 μL DW dalam tabung eppendorf 1.5 mL, kemudian divortex dan didiamkan selama 5 menit. Darah dalam EDTA diambil sebanyak 50 μL, lalu ditambahkan 1 000 μL NaCl 0.2%, kemudian divortex dan didiamkan selama 5 menit. Sampel disentrifius pada kecepatan 8 000 rpm selama 5 menit dan supernatan yang terbentuk dibuang. Endapan ditambahkan 40 μL SDS 10%, 10 μL proteinase-K (5 mg mL-1), dan 1×STE sampai 400 μL, kemudian diinkubasi pada suhu 55 °C selama 2 jam sambil digoyang secara perlahan menggunakan nutating mixer. Degradasi bahan organik dilakukan dengan menambahkan 400 μL phenol solution, 400 μL CIAA, dan 40 μl NaCl 5M, kemudian digoyang selama 1 jam pada suhu ruang.
Molekul DNA dipisahkan dari fenol dengan cara disentrifius pada kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit sehingga terbentuk fase DNA (bening). Fase DNA sebanyak 400 μL dipindahkan ke tabung baru ditambahkan 800 μL EtOH abssolute 70% dan 40 μL NaCl 5M, kemudian freezing (overnight). Molekul DNA disentrifius pada kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit untuk memisahkan EtOH absolute. Supernatan yang terbentuk dibuang. Endapan didiamkan hingga kering untuk disuspensikan dalam 100 μL TE 80%. Sampel DNA disimpan dalam refrigerator. Sampel DNA dielektoforesis dalam gel agarosa 1% untuk memastikan keberhasilan ekstraksi.
Amplifikasi
Fragmen DNA diamplifikasi dengan teknik PCR. Sampel DNA hasil ekstraksi sebanyak 1 μL dimasukkan ke dalam tabung 0.2 mL, lalu ditambahkan 14 μL larutan premix. Premix tersusun atas 10.8 μL DW, 1.5 μL 10×DreamTaq Buffer, 1 μL MgCl2, 0.2 μL dNTPs, 0.2 μL primer forward dan 0.2 μL primer reverse, serta 0.2 μL DreamTaq polymerase (fermentas). Premix dihomogenkan dengan vortex lalu spin down agar premix berada di dasar tabung. Campuran premix dan sampel DNA diinkubasi dalam thermalcycler untuk diamplifikasi. Posisi penempelan primer menurut Prinzenberg et al. (2005) dapat dilihat pada Gambar 1 (GenBank dengan kode aksesi AY428577).
Keterangan: primer forward; primer reverse; situs restriksi PstI
Kondisi mesin thermalcycler hasil optimasi yaitu pradenaturasi 95 °C selama 5 menit dan siklus yang terdiri atas denaturasi 95 °C selama 10 detik, penempelan primer pada suhu 60 °C selama 20 detik, dan ekstensi 72 °C selama 30 detik berlangsung selama 35 siklus, selanjutnya ekstensi akhir pada suhu 72 °C selama 5 menit. Amplikon dielektroforesis dalam gel agarosa 1.5%.
Genotyping
Genotyping dilakukan dengan teknik RFLP dan elektroforesis produk restriksi dalam agarose gel 2%. Sebanyak 5 μL amplikon ditambah 1.1 μL DW, 0.7 μL Buffer O, dan 0.2 μL PstI kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37 °C selama 16 jam (overnight). Produk restriksi dielektroforesis dalam gel agarosa 2%. Gel dibuat dengan melarutkan 0.6 g serbuk agarosa dalam 30 mL 0.5×TBE, kemudian dipanaskan dalam microwave selama 5 menit suhu medium-high, lalu dikocok menggunakan magnetic stirrer dan ditambahkan 2.5 μL EtBr. Larutan agarosa dituangkan ke dalam pencetak gel, kemudian sisir ditempatkan di dekat tepian gel hingga gel mengeras dan membentuk sumur-sumur. Gel yang sudah mengeras ditempatkan pada gel tray elektroforesis yang berisi larutan Buffer 0.5×TBE. Sebanyak 5 μL produk restriksi ditambahkan 1 μL loading dye dan dilakukan spin down, kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel. Selanjutnya DNA marker 100 pb ditaruh pada sumur paling kiri sebagai penanda. Gel dialiri listrik pada tegangan 100 V selama 35-45 menit. Molekul DNA yang bermuatan negatif (katode) pada pH netral akan bergerak ke arah positif (anode). Panjang fragmen setelah selesai proses elektroforesis diamati di bawah sinar UV.
Panjang dan jumlah fragmen DNA yang muncul dibandingkan dengan DNA marker untuk ditentukan genotipe fragmen gen CSN3. Genotyping dilakukan berdasarkan penentuan alel menurut Prinzenberg et al. (2005). Alel F tidak memiliki titik potong PstI dan hanya menunjukkan 1 fragmen yang memiliki panjang sama dengan amplikon yaitu 407 pb. Alel M memiliki titik potong PstI dan menunjukkan dua fragmen dengan panjang masing-masing 73 pb dan 334 pb.
Analisis Data
Frekuensi Alel dan Genotipe
Frekuensi alel dihitung menggunakan rumus menurut Nei dan Kumar (2000) sebagai berikut:
( ∑ )
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi Gen CSN3
Fragmen DNA target (DNA template) gen κ-kasein (CSN3) ekson 4 berhasil digandakan (diamplifikasi) pada suhu optimasi mesin thermalcycler dan komposisi pereaksi. Fragmen gen CSN3 ekson 4 berhasil diamplifikasi menggunakan primer spesifik pada suhu optimasi annealing 60 °C selama 20 detik, dengan panjang amplikon yaitu 407 pb (Gambar 2). Sebanyak 115 sampel darah kambing PE berhasil diamplifikasi pada gen CSN3 ekson 4 dengan tingkat keberhasilan 100%. Suhu annealing hasil penelitian lebih tinggi dan lama proses lebih cepat dari yang disarankan Chessa et al. (2003) pada suhu 59 °C selama 40 detik dan Zurriyati et al. (2011) pada suhu 55 °C selama 45 detik.
Gambar 2 Amplikon gen CSN3 ekson 4 pada gel agarosa 1.5%
Keterangan: M = marker DNA 100 pb, 1-16 = sampel kambing PE Pelaihari
Suhu Tm (melting tempeature) adalah suhu penempelan primer yang dihitung berdasarkan komposisi susunan basa nukleotida primer tersebut. Suhu annealing hasil optimasi juga jauh lebih rendah dibandingkan dengan suhu Tm primer forward (64 °C) maupun reverse (64 °C) (Lampiran 1). Hal ini disebabkan perbedaan kondisi mesin thermalcycler dan komposisi pereaksi amplifikasi. Pelt-Verkuil et al. (2008) menyatakan bahwa lama waktu annealing bergantung pada kapasitas pemanasan mesin thermalcycler, konsentrasi primer dan gen target, serta volume pereaksi.
Genotyping Gen CSN3
Gambar 3 Genotipe gen CSN3 ekson 4 pada gel agarosa 2%
Keterangan: M = marker DNA 100 pb, 1-16 = sampel darah kambing PE Pelaihari
Penelitian Zurriyati et al. (2011) dengan teknik PCR-RFLP dengan primer dan enzim restriksi yang sama memberikan hasil yang tidak berbeda, yaitu gen CSN3 ekson 4 hanya memiliki 1 alel (monomorfik) dengan alel F. Single nucleotide polymorphism (SNP) atau keragaman nukelotida tunggal digunakan sebagai penciri genetik untuk program seleksi pada tingkat molekuler. Gen CSN3 yang monomorfik menunjukkan tidak ditemukannya titik SNP. Hasil sekuen pada gen CSN3 ekson 4 kambing PE yang monomorfik pada penelitian Zurriyati et al. (2011) menyatakan bahwa mutasi substitusi tipe transisi ditemukan pada situs restriksi PstI. Mutasi (CT) menyebabkan perubahan asam amino dari Alanin (Ala) menjadi Valin (Val) yang menentukan alel F. Kemungkinan pada sampel darah kambing penelitian terjadi mutasi yang sama yaitu substitusi tipe transisi pada gen CSN3 ekson 4.
Coll et al. (1993) melakukan sekuen nukleotida cDNA untuk gen CSN3 ekson 4 yang pertama kali dari kelenjar susu kambing periode laktasi. Berdasarkan sekuen gen CSN3 yang diakses di GenBank dengan kode aksesi X60763 tidak ditemukan situs restriksi PstI. Hal itu tejadi pada situs restriksi PstI yaitu basa nukleotida ke 550 yang juga ditemukan pada kambing asal Italia (teramana, girgentana, dan sarda) dan kambing asal Spanyol (wild goat) yang seharusnya C berubah menjadi T (Yahyaoui et al. 2003). Hal yang tidak berbeda juga ditemukan pada kambing PE, saanen, dan PESA yang dilaporkan oleh Zurriyati et al. (2011). Sementara itu, pada kambing asal Kamerun (Red Sokoto), Kenya (Small-East Africa), dan Somalia (Long-Eared Somali) basa nukleotida pada posisi 550 adalah basa C, dikenali sebagai sekuen yang memiliki situs restriksi enzim PstI (CTGCA|G) yang menentukan alel M (Prinzenberg et al. 2005; Kiplagat et al. 2010).
7
menyebabkan perubahan asam amino Valin (Val) menjadi Alanin (Ala). Hasil sekuensing menunjukkan bahwa mutasi terjadi pada basa nukleotida posisi 550 (TC). Hasil sekuensing tersebut dikonfirmasi kembali dengan teknik PCR-RFLP dengan menggunakan enzim restriksi PstI. Genotyping memperlihatkan bahwa PstI mengenali fragmen situs restriksi (CTGCA|G) pada gen CSN3 (Prinzenberg et al. 2005).
Berdasarkan urutan sekuen enzim PstI (CTGCA|G), lokasi mutasi terdapat pada basa nukleotida di posisi 4 (CT) (Zurriyati et al. 2011) atau posisi nukleotida 550 dari cDNA (GenBank kode aksesi X60763). Hal ini menunjukkan pada semua kambing PE Pelaihari kemungkinan terjadi mutasi fragmen gen CSN3 di situs restriksi enzim PstI di posisi 4 (CT), sehingga situs restriksi menjadi tidak dikenali enzim restriksi (CTGTA|G). Mutasi yang terjadi pada situs restriksi juga memungkinkan terjadinya perubahan asam amino. Gambar 4 menunjukkan lokasi mutasi sekuen fragmen gen CSN3 ekson 4 pada berbagai kambing di berbagai wilayah.
550 560 570 580 590 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| X60763a TGAACACTGT AGATAATCCA GAAGCTTCCT CAGAATCGAT TGCGAGTGCA AY090466(WG)b --- --- --- --- ---
Gambar 4 Lokasi mutasi situs restriksi PstI dan perbandingan sekuen fragmen gen CSN3 ekson 4 pada kambing di berbagai wilayah
Frekuensi Alel Gen CSN3 dan Pendugaan Kandungan Kasein Susu Kambing PE Penelitian Berdasarkan Asosiasi antara Gen CSN3 dengan Kandungan
Kasein Susu pada Penelitian Lain
Gen CSN3 ekson 4 kambing PE Pelaihari bersifat monomorfik karena hanya ditemukan 1 macam alel yaitu alel F pada semua individu. Gen tersebut telah terfiksasi pada alel F karena telah terjadi seleksi alam. Yahyaoui et al. (2001) melaporkan bahwa alel F pada gen CSN3 merupakan tipe liar (wild type) yang ditemukan pada kambing liar di Spanyol dengan frekuensi yang tinggi. Keragaman genetik adalah terdapatnya lebih dari 1 macam genotipe dalam populasi. Nei dan Kumar (2000) menjelaskan bahwa sumber keragaman genetik disebabkan pengulangan urutan sekuen, insersi, delesi, dan rekombinasi di dalam runutan DNA antar individu, kelompok atau suatu populasi.
KDI-HPT Pelaihari Kalimantan Selatan dan Cariu Bogor Jawa Barat. Hal yang sama juga ditemukan pada hasil silangan kambing PE dengan kambing saanen (PESA) serta pada kambing saanen. Sementara itu alel M tidak ditemukan pada kambing PE, PESA, maupun saanen. Tabel 1 menyajikan frekuensi alel gen CSN3 ekson 4 pada kambing PE penelitian, kambing PE, PESA, dan saanen di berbagai wilayah dengan sebaran geografis yang lain.
Tabel 1 Frekuensi alel gen CSN3 ekson 4 pada kambing PE dan beberapa bangsa kambing di berbagai wilayah
Kambing Frekuensi Alel Sumber
F M
PE-Pa 1.00 (115) 0.00 (0) Hasil penelitian
PE-Bb 1.00 (48) 0.00 (0) Zurriyati et al. (2011)
PESAc 1.00 (51) 0.00 (0)
Saanend 1.00 (51) 0.00 (0)
Keterangan: a kambing PE BPTU KDI-HPT Pelaihari Kalimantan Selatan; b kambing PE Ciapus dan Cariu Bogor; c kambing persilangan PE dan saanen asal Cijeruk, Cariu, dan Balitnak Ciawi Bogor; d kambing saanen Cijeruk dan Cariu Bogor
Gen CSN3 terfiksasi pada alel F di kambing PE Pelaihari. Sementara itu alel M tidak ditemukan pada semua kambing PE Pelaihari. Chiatti et al. (2005) menyatakan bahwa alel F pada gen CSN3 termasuk dalam kelompok alel yang memiliki kandungan protein (3.04%) dengan kasein (2.19%) susu yang lebih rendah dibandingkan dengan alel M yang termasuk dalam kelompok alel dengan kandungan protein (3.18%) dengan kasein (2.29%) susu yang lebih tinggi pada kambing Camosciata, Frisa, Orobica, dan Verzasca di Italia.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Gen CSN3 ekson 4 pada kambing PE Pelaihari diperoleh hanya 1 macam genotipe dan alel yaitu genotipe FF dan alel F (100%). Gen CSN3|PstI ekson 4 bersifat monomorfik (seragam).
Saran
9
DAFTAR PUSTAKA
Atabany A. 2013. Panduan Sukses Beternak Kambing Peranakan Etawah. Bogor (ID): IPB Pr.
Angiolillo A, Yahyaoui MH, Sanchez A, Pilla F, Folch JM. 2002. Short communication: characterization of a new genetic variant in the Caprine κ-casein gene. J Dairy Sci. 85:2679-2680.
Buckle KA, Edwards RA, Fleet GH, Wootton M. 2010. Ilmu Pangan. Purnomo H, Adiono, penerjemah. Jakarta (ID): UI Pr. Terjemahan dari: Food Science.
Chessa S, Budelli E, Gutscher K, Caroli A, Erhardt G. 2003. Short communication: simultaneous identification of five κ-casein (CSN3) alleles in domestic goat by polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism. J Dairy Sci. 86:3726-3729.
Chiatti F, Caroli A, Chessa S, Bolla P, Pagnacco G. 2005. Relationship between goat κ-casein (CSN3) polymorphism and milk composition. Proc The Role of Biotechnology; 5-7 Maret 2005; Turin, Italy. Turin (IT): Villa Gualino. hlm 163-164.
Coll A, Folch JM, Sanchez A. 1993. Nucleotide sequence of the goat kappa-casein cDNA. J Anim Sci. 71:2833
[Ditjennak] Direktorat Jenderal Peternakan. 2013. Statistik Peternakan dan Kesehatan Hewan 2013. Jakarta (ID): Direktorat Jenderal Peternakan RI. Finesco GM. 2013. Harga susu tinggi, kambing Etawa kian diminati. Mulyadi A,
editor. Kompas.com [Internet]. [diunduh 2013 Agustus 31]. Tersedia pada http://regional.kompas.com/read/2013/04/28/21122982/Harga.Susu.Tinggi. Kambing.Etawa.Kian.Diminati.
Jann OC, Prinzenberg EM, Luikart G, Caroli A, Erhardt G. 2004. High polymorphism in the Kappa-casein (CSN3) gene from wild and domestic caprine species revealed by DNA sequencing. J Dairy Res. 71:188-195. Kiplagat SK, Agaba M, Kosgey IS, Okeyo M, Indetie D, Hanotte O, Limo MK.
2010. Genetic polymorphism of kappa-casein gene in indigeneous Eastern Africa goat populations. Int J Gene Mol Biol. 2(1):001-005.
Kucerova J, Matejicek A, Jandurova OM, Sorensen P, Nemcova E, Stipkova M, Kott T, Bouska J, Frelich J. 2006. Milk protein genes CSN1S1, CSN2, CSN3, LGB and their relation to genetic values of milk production parameters in Czech Fleckvieh. Czech J Anim Sci. 51(6):241-247.
Menteri Pertanian RI. 2013. Keputusan Menteri Pertanian Nomor 695/ Kpts/ Aspects of PCR Amplification. Netherlands (NL): Springer.
Sambrook J, Fritsch EF, Medrano JF. 1989. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. New York (US): Cold Spring Harbor Laboratory Pr. Sumantri C, Anggraeni A, Maheswari RRA, Diwyanto K, Farajallah A,
Brahmantiyo B. 2004. Frekuensi gen kappa kasein (κ-kasein) pada sapi perah FH berdasarkan produksi susu di BPTU Baturraden. Pros. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner; 4-7 Agustus 2004; Bogor, Indonesia. Bogor (ID): Puslitbang Peternakan. hlm 175-182.
Threadgill DW, Womack JE. 1990. Genomic analysis of the major bovine milk protein genes. Nucleic Acids Research. 18(23):6935-6942.
Viljoen GJ, Nel LH, Crowther JR. 2005. Molecular Diagnosis PCR Handbook. Netherlands (NL): Springer.
Yahyaoui MH, Coll A, Sanchez A, Folch JM. 2001. Genetic polymorphism of the caprine kappa casein gene. J Dairy Res. 68:209-216.
Yahyaoui MH, Angiolillo A, Pilla F, Sanchez A, Folch JM. 2003. Characterization and genotyping of the caprine kappa casein variants. J Dairy Sci. 86:2715-2720.
11
LAMPIRAN
Lampiran 1 Melting temperature (Tm) primer forward (F) dan reverse (R) gen CSN3 ekson 4
Melting temperature dihitung menggunakan rumus berikut (Viljoen et al. 2005):
Keterangan: G = jumlah basa G (guanina) pada sekuen primer C = jumlah basa C (sitosina) pada sekuen primer A = jumlah basa A (adenina) pada sekuen primer T = jumlah basa T (timina) pada sekuen primer
Sekuen primer: Forward (F) 5’-GGTATCCTAGTTATGGACTCAAT-3’ Reverse (R) 5’-GTTGAAGTAACTTGGGCTGTGT-3’ Tm F = 4 ( 5 + 4 ) + 2 ( 6 + 8 )
= 64 °C
Tm R = 4 ( 8 + 2 ) + 2 ( 4 + 8 ) = 64 °C
Lampiran 2 Sekuen mRNA gen CSN3 yang diakses di GenBank kode aksesi X60763
GenBank: X60763.1
LOCUS X60763.1 826 bp mRNA linear MAM 27-FEB-1994 DEFINITION C.hircus mRNA for kappa casein.
ACCESSION X60763
VERSION X60763.1 GI:977 KEYWORDS casein; kappa-casein. SOURCE Capra hircus (goat) ORGANISM Capra hircus
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Laurasiatheria; Cetartiodactyla; Ruminantia; Pecora; Bovidae; Caprinae; Capra.
REFERENCE 1
AUTHORS Coll,A., Folch,J.M. and Sanchez,A.
TITLE Nucleotide sequence of the goat kappa-casein cDNA JOURNAL J. Anim. Sci. 71 (10), 2833 (1993)
PUBMED 8226388
REFERENCE 2 (bases 1 to 826) AUTHORS Coll,A.
TITLE Direct Submission
Unitat de Genetica I Millora, Facultat de Veterinaria, 08193
13
541 tgaacactgt agataatcca gaagcttcct cagaatcgat tgcgagtgca tctgagacca 601 acacagccca agttacttca accgaggtct aaaaactcta aggagacatc aaagaggaca 661 acgcaggtct agctgaaacc aaatgactac ttcaaacttt cctttggcca gttgtctgcc 721 ttcagtgaac agagaatatg attttcacag atccagctcc tttctcatct cctcttacat 781 tttacattta tgccgcattt agttttttga ttcctgcata ataaag DEFINITION Capra hircus kappa casein gene, allele F, partial cds. ACCESSION AY090466 Mammalia; Eutheria; Laurasiatheria; Cetartiodactyla; Ruminantia; Pecora; Bovidae; Caprinae; Capra.
REFERENCE 1 (bases 1 to 494)
AUTHORS Yahyaoui,M.H., Angiolillo,A., Pilla,F., Sanchez,A. and Folch,J.M.
TITLE Characterization and genotyping of the caprine kappa-casein variants
mRNA <1..>494
15
421 gcttcctcag aatcgattgc gagtgcacct gagaccaaca cagcccaagt tacttcaacc 481 gaggtctaaa aact
DEFINITION Capra hircus casein kappa (CSN3) gene, CSN3-M allele, exon 4 and partial cds. Mammalia; Eutheria; Laurasiatheria; Cetartiodactyla; Ruminantia; Pecora; Bovidae; Caprinae; Capra.
REFERENCE 1 (bases 1 to 527)
AUTHORS Prinzenberg,E.M., Gutscher,K., Chessa,S., Caroli,A. and Erhardt,G.
AUTHORS Chessa,S., Prinzenberg,E.-M. and Gutscher,K. TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (06-OCT-2003) Institute for Animal Breeding and Genetics, Justus-Liebig-Universitaet Giessen, Ludwigsstr. 21b, Giessen 35390, Germany
/gene="CSN3"
1 tgcagtgctg tgagaaagat gaaagattct tcgatgacaa aatagccaaa tatatcccaa 61 ttcagtatgt gctgagtagg tatcctagtt atggactcaa ttactaccaa cagagaccag
121 ttgcactaat taataatcaa tttctgccat acccatatta tgcaaagcca gttgcagtta 181 ggtcacctgc ccaaactctt caatggcaag ttttgccaaa tactgtgcct gccaagtcct 241 gccaaaacca gccaactacc ctggcacgtc acccacaccc acatttatca tttatggcca 301 ttccaccaaa gaaagatcag gataaaacag aaatccctgc catcaatacc attgctagtg 361 ctgagcctac agtacacagt acacctacca ccgaagcaat agtgaacact gcagataatc 421 cagaagcttc ctcagaatcg attgcgagtg cacctgagac caacacagcc caagttactt 481 caaccgaggt ctaaaaactc taaggagaca tcaaagaaga caaccac
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan pada tanggal 15 Mei 1992 di Bogor, Jawa Barat. Penulis adalah anak kedua dari 3 bersaudara pasangan Bapak Edi Kusmayadi dan Ibu Nurlela. Pada tahun 1998 Penulis mengawali pendidikan di SD Negeri Sukamanah 4. Penulis melanjutkan sekolah di SMP Negeri 1 Jasinga tahun 2004 dan SMA Negeri 1 Jasinga tahun 2007. Penulis diterima sebagai mahasiswa di Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan IPB pada tahun 2010 melalui jalur USMI IPB dan menjadi salah satu penerima Beasiswa Bidikmisi angkatan pertama yang didanai oleh Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi RI selama masa kuliah S1 di IPB.
17
ketua komunitas Himpunan Mahasiswa Jasinga (Himajasi) IPB tahun 2012-2013. Selain itu Penulis adalah salah satu pemain inti di D’Ransum Percussion Fakultas Peternakan tahun 2011-2013.
Penulis pernah menjadi penaggung jawab kegiatan magang mahasiswa Fakultas Peternakan tahun 2011, staf PDD dalam FGW 2011, staf PDD dalam LKMM LK Fakultas Peternakan 2011, staf Biro Livestockphoria FGW 2012, ketua divisi 3D MPF 2012, staf divisi 3D Livestockvaganza 2012, staf divisi lomba story telling dalam Festival Anak Sholeh tahun 2012. Dalam bidang seni dan olahraga Penulis pernah menjadi juara dalam lomba band FST 2011, lomba perkusi IAC 2012 dan IAC 2013, lomba aerobik Dekan Cup 2012; Dekan Cup 2013; dan Dekan Cup 2014, serta lomba akustik CST 2014.
