Konstruksi Fusi Transkripsi Gen Kitinase dari Aeromonas caviae dan Ekspresinya pada Pseudomonas fluorescens

DISERTASI

KONSTRUKSI FUSI TRANSKRIPSI GEN KITINASE DARI

Aeromonas caviae

DAN EKSPRESINYA PADA

Pseudomonas fluoresceiti

Oleh

AMARLLA MALIK

PROGRAM

PASCASARJANA

DISERTASI

KONSTRUKSI FUSI TRANSKRIPSI GEN KITINASE DARI

Aerornonas caviae

DAN

EKSPRESINYA

PADA

Pseudomonas fluorescens

'

Oleh

AMARILA

MALIK

PROGRAM

PASCASAWANA

". .

.plXzli

meninggit&an orang yang

6eriman

di

antara

&mu

dan orang-oraw

yang di6eri

$mu

pengetahuan, 6e6erapa

derajat

. . .

"

@ l % ~ ~ ~ M d a h l i

: 1 I )

ABSTRACT

Chitinase gene (chi) fiom A e r o m o w m i a e WS%, which was cloned previously in pUC19 based plasmid vector, has been sequenced. Its completed

nuceleotide sequence was determined. The structural gene consists of 2.937 bp with an ORF encoding 865 amino acids. DNA sequence analysis indicated that the gene was cloned without its indigenous promoter. Comparison to other chitinase genes in database shows that the deduced amino acid sequence was nearly identical (97%) to

chiA from A. caviae isolated fiom Israel. In this study, chi was cloned either under a strong constitutive promoter, i.e. P K ~ ~ , as a transcriptional fusion, or under an inducible strong promoter, Pfac. To introduce the gene fision/s into Pseudomonas

fluorescemfPf), the constructs were cloned into broad host range plasmid vectors

such as pRK415, pBBRlMCS2, and pVSP61. Chitinolytic expression of ~ ~ m ~ - c h i fUsion on chitin agar plate as clear zones could only be demonstrated in a

recombinant plasmid based on pBBRlMCS2 replicon, designated as pAM340.

pBBRlMCS2, which has higher copy number than the either pRK415 or pVSP61,

was used as a vector for the construction of Ptac-chi, which was designated as pAM630. A P ~ r n ~ - c h i fision in a suicide vector, pWTmini-TnS SplSm, has been constructed as well, and was designated as pAM520. Construction of pAM520 was

performed to obtain the chi fision clone that integrated into Pf chromosome, and

that will be stably maintained as a single copy number. From the three

transcriptional fusion recombinants, only Escherichia wIi harboring pAM520 recombinant could not demonstrated chitinolytic activity. To mobilize the chi fusion recombinant into PC gene tranfer was performed employing bacterial conjugation.

Based on the time of incubation required to display transparent zone on chitin agar

plate, the chi gene expression in Pf demonstrated much higher activity than when the same construct was present in E. colz. Chitinase activities were determined speckrophotometricaIly using colloidal chitin azure as a specific substrate. The

influenced by plasmid w p y number as shown in E. coli (pWS506), which expressed intracellular chitinase activity (4.17 U/mg protein) several folds higher than that of medium copy plasmid in

E.

coZi (pAM630) (1.05 U/mg protein). Pf5 100 (pAM630) overnight culture accumulated chitinase in the intracellular fraction which is three

folds higher (2.53 Ulmg protein) than the control strain. There was no significant chitinase activity in the extracellular fraction of PfS100 (pAh.4630). From these results, it could be concluded that the expression of chi was influenced by gene copy number of constructed gene, as well as the nature of bacterial host used in this

AMi4RE.A h4AL.X. Konstmksi h s i translcripsi gen kitinase dari Aeromonas caviae

dan ekspresinya pada Psetcdomonas fIuorescens. Di bawah bimbingan ANTONIUS SUWANTO sebagai ketua, dan berturut-tumt BUD1 TJAHJONO, MAGGY T.

SUHARTONO, INDRAWAT1 GANDJAR d m ED1 GUHARDJA sebagai anggota

komisi

.

Penelitian tentang gen kitinase dan pemanfaatannya telah banyak dilakukan. Gen kitinase berpotensi antara lain untuk mengkonstruksi agens biokontrol terhadap ~ e n d a w a n patogen tanaman, selain untuk dimanfaatkan ddam stud1 regulasi dan

ekspresi gen, serta proses degradasi kitin. Gen kitinase yang diisolasi dari Aeromollas caviae rnasih belurn banyak dilaporkan jika dibandingkan dengan laporan tentang gen kitinase dari Serratia marcescens. Studi tentang kloning gen kitinase secara fisi transkripsi telah dilaporkan, namun sumber gen kitinase yang digunakan adalah gen kitinase dari S. marcescens. Di dalam penelitian ini gen kitinase (chi) dari A. cavzae isolat WS7b yang & i o n pada vektor berbasis pUC (pWS506) oleh peneliti sebelumnya, telah disekuens, dan sekuens nukleotida yang

diperoleh d i i a l i s i s dengan mernbandingkan dengan kitinase yang telah a& di ahtabase.

Konstruksi fisi transkripsi gen chi di daIam penelitian ini menggunakan vektor berspektmm inang has, yaitu pRK415, pBBRIMCS2, dm pVSP61. Ketiga vektor mempunyai karakter berbeda, yaitu dari jumlah kopi, penanda antibiotik,

ulcuran plasmid, situs endonuklease restriksi, dan kelompok inkompatibiiitas. Promotor untuk ekspresi gen chi yang digunakan di dalam penelitian ini adatah

promotor gen resistensi Kanamisin, P K ~ ~ , yang bersifat konstitutic yang diisolasi dari pUC4K, d m promotor hibrid trp-lac (Pfac) yang merupakan promotor kuat bersifat terinduksi, namun dalam keadaan tidak terinduksi bersifat konstitutif Konstruksi fbsi chi diintroduksi ke PseuCtOmo~s Jluorescem (Pf) gatur dan isolat biokontrol. Galur yang digunakan adalah B29, yaitu biokontrol balcteri patogen

Penelitian ini bertujuan untuk : (i) karakterisasi DNA gen chi dengan sekuensing, dan data sekuens yang diperoleh akan dibandingkan dengan kiti- kitinase yang sudah ada di &&base unntuk mempelajari kekerabatannya; (ii) mengkonstruksi gen chi sebagai fisi transkripsi di bawah prornotor ekspresi yang

konstitutie (iii) mengintroduksi k s i transkripsi chi ke P. fluorescens (Pf) isolat- isolat biokontrol ; (iv) menganalisis ekspresi gen chi pada isolat-isolat P f secara esei kualitatif dan esei kuantitatif.

Untuk mencapai tujuan tersebut telah dilalcukan serangkaian percobaan sebagai berikut, yaitu (i) sekuensing DNA gen chi dengan stmtegi subkloning d m

primer waiking. Data sekuens yang diperoleh dianalisis dengan program BLAST dari European Bioinformatics Institute, dan sekuens asam amino turunan diperoleh dengan program Swiss-Prot. Pembandingan dengan kitinase-kitinase yang sudah ada

dilakukan rnenggunakan program CIustaI-W, ((ii) konstruksi fbsi transkripsi P K ~ ~ - chi pa& vektor-vektor plasmid berspektrum inang luas, analisis ekspresi kitinolitik rekombinan-rekombinan di klon E. wi'i, dan intnwluksi rekombinan kitinolitik

(pAh.4340) ke isolat-isolat

Pf;

(iii) konstruksi

fusi

translcripsi pICmR-chi pada vektor

transposon mini, pUTmini-Tn5 Sp/Sm, menghasilkan pAMS20, analisis ekspresi kitinolitik rekombinan di klon E. d i , dao introduksi pAM520 ke isolat-isotat

serta analisis keberadaan gen chi dengan metode amplifikasi; (iv) konstruksi fusi transkripsi Pfac-chi pada vektor berspektnun inang luas pBBRlMCS2, menghasilkan pAM630, analisis ekspresi kitinolitik rekombinan di klon E colt,

dan

introduksi pAM630 ke Pf5100; (v) esei aktivitas kitinase secara spektrofotometxi

rnenggunakan substrat spesifik Chitin Arure, serta mengukur konsentrasi protein total dari finksi ekstraselular dan intraselular.

Dari hasil sekuensing diperoleh selcuens nukleotida gen chi sepanjang 2.937 pasang bssa yang m e n y a n d i i 865 asam amino lmumm yang menunjukkan kemiripan sekuens DNA sangat tinggi (98%) dan kemiripan sekeuns asam amino

AGGA terletak 9 nukleotida mendahului kodon inisiasi transkripsi ATG. Pada ujung

karboksil terdapat tiga buah sekuens ulangan terbalik yang potensial membentuk struktur hairpin-loop sebagai terminasi transkripsi yang didahului oleh kodon terminasi translasi TGA.

E. coli yang membawa konstruksi fisi transkripsi pECmR-chi di pRK415 (p-30) dan pVSP61 (pAM430) tidak menunjukkan ekspresi kitinolitik medium agar-agar kitin yang diamati sampai 7 hari inkubasi, sedangkan fisi di pBBRlMCS2 fpAM330 dan pAM340f dapat mendegradasi kitin, namun tidak sekuat di inang

asalnya. Dari faktor jumlah kopi gen, pBBRlMCS2 mempunyai jumlah kopi lebih tinggi daripada pRK415 dan pVSP61. Introduksi pAM340 ke Pf B29 tidak berhasil memperoleh ekskonjugan yang kitinolitik. Introduksi pAM340 ke Pf 5200 berhasil

memperoleh ekskonjugan yang menunjukkan ekspresi kitinolitik yang &p lcuat

berupa wna bening setelah diinkubasi selama 9 hari. Hasil analisis ampiifikasi menunjukkan Pf B29 tidak membawa gen chi, sedangkan Pf 5100 membawa gen chi.

E. coli yang membawa h s i transkripsi ~ ~ m ~ - c h i di pUTmini-TnS Sp/Sm (pAM520) tidak menunjukkan ekspresi kitinolitik sampai 10 hari inkubasi.

Introduksi pAM520 ke Pf B29, Pf 5024 dan Pf 5100 dianalisis dengan asnplifikasi

gen chi menunjukkan bahwa gen chi tidak ada di dalam Pf B29, namun terbukti ada

di dalam Pf 5024 dan 5100. Ekspresi gen chi di Pf 5024 dan 5100 tidak terlihat sampai 10 hari inkubasi pa& medium agar-agar kitin.

E. coli yang membawa konstruksi fisi transhipsi Ptac-chi di pBBRlMCS2,

yaitu pAM630, menunjukkan ekspresi kitinolitiik setelah d i i b a s i selama 11 hari, namun zona bening yang dihasilkan lemah. Introduksi pAM630 ke Pf 5100 berhasil

memperoleh ekskonjugan kitinolitik yang culcup kuat dari munadnya zona bening setelah diinkubasi selama 7 hari.

Hasil esei aktivitas kitinase menunjukkan bahwa ekspresi fbsi chi di E c d i dipengaruhi oleh jumlah kopi plasmid sebagaimana yang ditunjukkan oleh E. cdi

KONSTRUKSI FUSI TRANSKRIPSI GEN KITINASE DAM

Aeromonas caviae DAN

EKSPRESINYA PADA

Pseudomonas fluorescens

Oleh

Disertasi

Sebagai saiah satu syarat untuk memperoleh gelar DOKTOR

pada Program Studi Biologi Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor

PROGRAM PASCASARTANA

INSTITUT PERTANLAN

BOGOR

JUDUL DISERTASI : KONSTRUKSI FUSI TRAlYSKRlPSI GEN KITINASE DARI Aeromunm &c DAN EBPRESINYA PADA

13eudomonmfZlcmescens

NAMA MAI-IASISWA : AlMARILA MALIK

NOMOR MAHASISWA: 95575

PROGRAM STUD1 : BIOLOGI

1. Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Antonius Suwanto M Sc.

Ketua

no

Prof. Dr. Prof. Dr. Edi Guhardja

-~nggota Anggota

2. Ketua Program Studi Biologi ram Pas- Sa j a n a

A

Dr. Ir. Dedi Setiadi. MS

Penulis adalah anak kedua dari empat bersaudara putra-putri dari ayah Amir

Malik dan ibu Martha Amir, dilahirkan di Jakarta pada tanggal 3 Oktober 1964. Telah dikaruniai seorang putri Rizka h4aulida dan seorang putra Radhian Amandito dari suami

Rusli Yunus.

Penulis lulus pendidikan Sekolah Dasar (SD) di SD Adik Irma Suryani, Jakarta, bulan Desember tahun 1976, Iulus pendidikan Sekolah Menengah tingkat Pertama (SMP) di S M P Negeri I, Jakarta bulan Juni tahun 1980, dan lulus pendidikan Sekolah

Menengah tingkat Atas (SMA) di SMA Negeri 4, Jakarta bulan Juni tahun 1983. Pada tahun yang sama melanjutkan pendidikan ke Jurusan Farmasi, Fakultas Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam (FhlIPA), Universitas Indonesia

0

melalui Proyek Perintis I.

Lulus sarjana Farmasi pada bulan September tahun 1988, melanjutkan ke pendidikan

profesi Program Apoteker di Jurusan yang sama hingga iulus bulan Desember 1989.

Penulis melanjutkan pendidikan ke jenjang S2 pada tahun akademik 1991/1992 hingga lulus bulan Oktober tahun 1993 di Program Studi Farrnasi Pascasarjana fnstitut Teknologi Bandung dengan sponsor dari Tim Manajemen Program Doktor (TMF'D), Direktorat Pendidikan Tinggi (Dikti). Pada tahun akademik 1995/1996 penulis melanjutkan p e n d i d i i ke jenjang 53 di Program Studi Biologi Prognun Pascasajana Institut Pertanian Bogor dengan sponsor dari Beasiswa Unggulan (URGE) dari Bank

Dunia melalui Dikti. Sejak bulan Maret 1990 hingga sekarang menjadi s t a f pengajar

di

UCAPAN TERIMA KASIH

Syukur AlhamduliUah penulis ucapkan atas segala rahmat dan hidayah dari

Allah SWT atas s e l d y a pelaksanaan penelitii dan penulisan d i i

ini,

dan semoga m w a e t bagi pengembangan ilmu pengetahuan dan teknologi, khususnya di bidang Biologi.

Dalam mehksanakan penelitian dan penulisan disertasi penulis telah mendapat bantuan dari berbagai pihak, baik bempa saran, kritik, dana, maupun bantuan moril dan d o a Pada kesemptan ini perkenankan penulis mengucapkan terima kasih yang tulus dan sebesar-besarnya kepada semua pihak yang telah memberikan bantuan

Kepada Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc., sebagai ketua komisi pembimbing yang telah ~nemberikan biibimgan, saran

dan

arahan mulai dari pemilihan mata

ajaran, penyusunan usulan penelitian, pelaksanaan penelitian sampai penulisan disertasi. Penghargaan yang tinggi penulis haturkan atas dorongan beliau yang

memotivasi penulis untuk rnenge- kemampuan bersikap mandiri, tekun, dan percaya diri dalam meneliti. Tidak lupa rasa terima kasih p u g besar atas kesempatan yang diperoleh

unNc

melakukan sebagian pekejaan penelitian ini di Scottish Agricultural College, The University of Edinburgh, dari Higher Education

LINK

Project, berjudd

"Sustainable

crop protection to improve food production:

tra~ " ' g technology h m m f ito practice'' dari DFID, The British Council,

dimanabeliau adalah salah seorang koordinator.

Kepada Dr. Ir. Budi Tjahjono, M-Agr., sebagai anggota komisi pembiiing yang telah membmhn b i i h g a n dan saran, serta kesempatan bergabung dalarn kelornpok peneliii H h h Tim (URGE) Project Grant

029/HTPP/WURGE/l996

"Construction of Biowntrol for B a c t d Disease in

Plants:

Genome Analysii

Pathogenesis, and Molecular Ecology of Xanthomonas campestris pv. gZycines",

sehingga mendapat bantuan dam yang b e r h g a untuk dapat mehksamkm dan

anggota komisi pemb'img yang telah rnemberhn birnbingan dan saran, serta

kesempatan melakukan sebagii pekerjaan peffilitian di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia, Pusat Antar Universitas-Bioteknologi, IPB yang beliau kepalai. Kepada Prof. Dr. Indrawati Gadjar, sebagai anggota kornisi p e m b i i b ' i atas

bib'mgan dan saran, serta dukungan m o d yang kuat sebagai intelektual dan Guru

3esar FMIPA, Universitas Indonesia, tempat penulis bekeja sebagai staf pengajar. Kepada Prof. Dr. Edi Guhardja, sebagai anggota komisis pembimbing atas bimbmgan dan saran, serta kearifan dalam memberikan pandangan dan masukan

yang berguna bagi kesempurnaan suaiu disertasi.

Kepada Dr. Endang Purwantini, staf pengajar FMIPA Institut Teknologi Bandung, dan Dr. Anja Meryandini, staf pengajar FMIPA Institut Pertanian Bogor, sebagai penguji luar komisis, atas saran clan kritik yang menjadi masukan yang

IJ~rInanfaat agar disertasi ini menjadi kbih sempuma lagi

Kepada Direktur Program Pascasajana dan Ketua Program Studi Biologi, Institut Pertanian Bogor. beserta staf yang telah memberikan kesempatan untuk pendidikan S3 dengan Beasiswa Unggulan URGE (Universify Research for Graduate Education) Batch

III

tahun 1996/1997. Kepada Rektor Universitas

Indonesia, Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia, dan Ketua Jurusan Farmasi FMIPA

UI

yang telah memberikan kesempatan untuk pendidiken S3 di Institut Peaanian Bogor.

Kepada Direktur SEAMEO BIO'JXOP (South Easf Asia Regional Centre for Tropical Biology) Pro£ Dr. Sitanala Arsyad rcmg telah memberikan kesempatan clan

. .

_{melakukan penelitii di Laboratorium Molecular Biology. Kepada para}

peneliti dan -wan S M O BIOTROP atas kesempatan mengguaakan

hilitas, terutama kepada Pro€ Dr- Irene M U m b o h sebagai kepala Divisi

Biofechnology

and

Tree Breeding (ETB), beserta stafdan telcnisi yang dengan penuh kesabaran dan pengertian dalam

suasana

kekeluargaan

dsn

pmddxkm yang tulus

Kepada Dr. Rob Harling, koordinator Higher Education LINK Project be judul "Sustainable crop protection to improve f w d production: transferring technology porn research to practice" dari DFID, The British Council, atas b i i a n , saran, dan arahan yang &bedcan selama rnehkukan sebagii penelitian ini di Scottish Agricultural College, Univemity of Edinburgh, Scotland, UK

Kepada rekan-rekan mahasiswa, para staf dan karyawan Pascasarjana IPB,

para teknisi PAU-Bioteknologi IPB dan Laboratorium Molecular Biology SEAMEO BIOTROP, yang selama ini telah membantu dau bekejasama dengan baik.

Kepada yang tercinta keluarga pen&, ibu, ayah, suami, anak-anakku, nenek, kakak, ad&-ad&, dan ibu mertua, yang selalu memberikan dukungan moril dan

kekuatan do'a, serta toleransi yang talc terhingga berupa rasa pengertian dan sangat memaklurni sejak awd hingga selesainya pendidilcan S3 ini.

Kepada semua pihak yang belum disebutkan, penulis ucapkan banyak terima kasih.

KATA PENGANTAR

Berkat rahmat Allah SWT, penelitian dan penulisan disertasi yang berjudul "Konstruksi f i s i transkripsi gen kitinase dari Aeromonas caviae clan ekspresinya pa& Pseuabmo~sfluorescen.3' dapat diselesaikan. Dalam penelitian ini ditalcukan

konstruksi penyisipan gen chi di bawah promotor konstitutif dan terinduksi , d m

diklon pada vektor berspekttum inang luas dan vektor transposon, sehingga ekspresi

gen chr akan dikendalikan secara konstitutif di inang Pseudomonas fluorescens isolat-isolat biokontrol. Melalui penelitian dan penulisan ini penulis ingin

menyumbangkan informasi tentang karakteristik gen chi dari A. cuviae asal

Indonesia, serta kemungkinan pemanfkatannya sebagai sumber gen chi yang berpotensi dalam mengkoastruksi biokontrol d w a a patogen tanaman.

Berdasarkan konstruksi fUsi transkripsi yang dihasilkan di dalam penelitian

ini maka ekspresi kitinase di biok-1 akan bersifat konstitutif tanpa induksi, yang

sangat sesuai untuk diimplikasikan sebagai biokontrol pencegah serangan ceadawan patogen alternatif. Dengan demikian, penggunaan firagisida kimia yang selama ini telah terbukti dapat memberikaa dam& bumk pada liagkungan, dan membahayakan mahluk hidup serta m i k m o ~ s m e non target hinaya, dapat

dihindari.

Penulis mengharaplcaa adanya sumbang saran dan kritikan dari pembaca sekalian untuk meajadikan hasil penelitian &sertasi temtaag konstruksi &si transkripsi gen chi di biokontrol

P.

fr~orescens ini berpotensi untuk dikembangkan dalam pencegahaa cendawan patogea altematifhagisida kimia.

Bogor, Agustus 2000

DAFTAR IS1 ...

DAFTAR GAMBAR ... DAFTAR TABEL ...

f . PENDAHULUAN ...

A . Latar Belakang ...

. .

B . Tujuan Penelitran ...

C . Tahap Pengerj aan ...

D . Manfaat Penelitian ...

I1 . TIN JAUAN PUSTAKA ... xiv xvii xix 1 1 6 6 7 8

.

.

A . Enzim IOt~nase ... 8

B

.

Gen Kitinase bakteri yang telah dilaporkan

...

11 C . Pseudornonc~sfluorescens ...

D

.

Teknologi DNA rekombinan

...

E

.

Regulasi ekspresi gen dan fbsi transkripsi

...

F

.

Transfer gen pada Bakteri

...

G

.

Sekuensing DNA

...

III

.

BAHAN

DAN METODE

...

A

.

Tempat Penelitian

...

B

.

Bahan

...

C . Prosedur Umum dan Peralatan

...

.

...

D Metode

E

.

Sekuensing DNA gen kitinase

...

F

.

Konstruksi gen chi di bawah promotor gen dan introduksi ke

P

.

ji'uorescens

...

F

.

1

.

Penyisipan gen penanda resistensi antibiotik

...

5 9

...

F.2. Penyisipan gen KmR pada plasmid vektor berspektrum inang luas 5 9

...

F.3. Pembuatan fragmen gen chi bemjung tumpul dengan teknikfiCI-in 61

... F.4. Penyisipan -men tumpul gen chi pa& vektor perantara 6 2

R

F.5. Penyisipan gen chi di bawah PKm ... 62

...

F.6. Penyisipan gen penyandi CimR sebagai penanda seleksi 63

F.7. Introduksi konstruksi fusi transkripsi ~ ~ r n ~ - c h i pada vektor

berspektrum inang luas ke Pf ... 63

G

.

Rekonstruksi fusi transkripsi pKmR-chi menggunakan vektor

integrasi dan introduksi ke P.fIuorescens ... 64

G

.

1 . Konstruksi sisipan fragmen gen chi dengan penanda C+mR ... 6 4

G.2. Penyisipan fkagmen chi-GmR di bawah PKmR pada pUC4K ... 66

G.3. Penyisipan m e n fhsi PKmR-chi-GmR pada vektor perantara

pUC 18NotI ... 66

G.4 Konstruksi h i PKrnR-chi-GmR pada vektor integrasi pUTmini

...

67

G.5. Introduksi konstnrksi fusi pI€mR-chi pada pUTmini ke Pf ... 67

H

.

Konstruksi Fusi Transkripsi gen chi di bawah Ptac dan introduksi ke Pf

..

67 H

.

1

.

Pengambilan Ptac dari pKK223-3 dm penyisipan pada vektor plasmid 68 H.2. Fusi transkripsi m e ngen chi-GmR di bawah kontrol Ptac

...

68 H.3. Introduksi konstruksi fusi Pfac-chi ke Pf

...

69

.

IV

HASIL DAN PEMBAHAS

AN

...

71 A. Sekuens

DNA

gen kitinase

...

71

B

.

Konstruksi gen chi di bawah pKrnR dan introduksi ke ~f

...

80

C

.

Rekonstruski fisi tramkripsi pKrnR-chi menggunakan velctor transposon

dan inhoduksi ke Pf

...

92

E. Esei enzimatik kitinase dengan substrat spesifik

.

. .

. . .

. . .

. . . .

. .

. . . .

. .

. . . .

.

.

104

DAFTAR GAMBAR

Halaman

. .

2.1 Struktur h t l n ... 9

2.2 Lintasan degradasi kitin ... 10

2.3 Alur informasi dan fakto-faktor regulasi ekspresi gen ... 26

2.4 Fusi gen terhadap suatu gen penyandi ... 28

3.1 Strategi sekuensing gen chi dengan subkloning danprimer walking

...

55

3.2 Skerna konstruksi fisi transkripsi ~ ~ m ~ - c h i pada vektor berspektrum inang luas ... 60

3.3 Plasmid p34S-Grn ... 63

3.4 Skema konstruksi k s i transkripsi pICmR-chi-~mR pada vektor integrasi PUT mini-Tn5 Sp/Sm ... 65

3.5 Skema konstruksi h s i transkripsi ~fac-chiGrnR pada vektor berspektrum ... inang luas 70 4.1 Sekuens nukleotida fragmen 2.9 kb gen chi beserta sekuens asam amino 4.2 Pembandingan sekuens asam amino turunan dari kitinasekitinase yang berkerabat dekat

...

77

4.3 Analisa perbandingan ujung karboksil gen chi WS7b

...

80

4.4 ~ e n y i s i ~ a n gen T~~ di bagian hilir gen chi p ~ ~ 5 0 6

...

81

4.5 Vektor-vektor berspektmm inang luas yang digunakan

...

83

4.6 ~ e n y i s i ~ a n &agmen

chi-^^^

plasmid p ~ ~ 3 8 5

...

84

4.7 Verifikas'l orientasi pAM201 dengan enzim restriksi pada gel agaros

...

86

4.8 Fragmen

chi-^^^

disisipkan di vektor-vektor pembawa gen ICmR

...

87

4.9 Verifikasi orientasi rekombinan fbsi transkripsi pAM330

...

88

4.10 Peta restriksi plasmid pAM330

...

89

4.1 1 Ekspresi kitinolitik gen chi pada klon E

.

coli dan P

.

fluorescem 5 100

...

pembawa pAM340 91 4.12 Peta restriksi plasmid pernbawa sisipan fragmen chi-GnR, pAM202

...

93

...

4.14 Verifikasi rekombinan pAMSOO. p a 5 0 3 dan pAh4520 ... 95

4.15 Esei aktivitas kitinolitik E

.

coZi (pAM500)

...

96

4.16 Anaiisis keberadaan gen chi dengan teknik amplifikasi ... 97

4.17 Konstruksi Ptac pada pBBRlMCS2 dalam dua orientasi ... 99

4.18 Hasil elektroforesis pengambilan h g m e n Pfac dari pKK223-3 dan verifikasi pAM601 clan pAM630 ... 101

4.19 Peta plasmid rekombinan pAM630 ... 102

4.20 Esei aktivitas kitinolitik bakteri pembawa fUsi transkripsi Ptac-chi ... 103

4.2 1 Kurva pengukuran waktu inkubasi optimum dan lcurva standar ... 106

4.22 Aktivitas kitinase A

.

cavim WS7b pada dua suhu inkubasi ... 107

4.23 Esei kuantitatif aktivitas kitinase gen chi di E

.

colz dan P

.

fluorescens terhadap substrat Chitin Azure ... 109

DAFTAR TABEL

Halaman

3.1 Galur bakteri yang digunakan ...

3.2 Plasmid yang digunakan ...

4.1 Ukuran £'ragmen DNA hasit verifikasi pAh4201 ... 4 . 2 Ukuran fragmen D N A hasil verifikasi pAM330 ... 4.3 Ukuran ftagmen DNA hasil verifikasi pAMSOO, pAMS03 dan pAM520 4.4 Ukuran fragmen DNA hasil verifikasi pAM601 dan pAM630 ...

4.5 Ekspresi kitinolitik gen chi pada reombinan plasmid ...

A. Latar Bdakang

Kitinase (EC3.2.1.14 = poly-PZ.4-(Zacetami&2-Cieoxy)-D-gZucosi&

g & m hydrolase) adalah enzim yang mempunyai kemampuan menghidrolisis kitin.

Senyawa kitin adalab polimer N-asetilglukosamin dengan ikatan P(14) yang banyak

terdapat di alam sebagai komponen utama kerangka luar arhopoda, mohska,

dinding sel cendawan dan askarida, serta dinding sel streptomises (Smucker & Kim, 1991).

Aeromonas caviae WS7b, yaitu suatu isolat bakteri tanah asal Pulau Bangka.

Propinsi Sumatera Selatan, yang diisolasi dari areal pertanian mengandung relatif

sedikit populasi nematoda patogen tumbuhan, menunjukkan aktivitas kitinolitik

yang h a t pada medium agar kitin. Gen kitinase dari galur ini telah diklon oleh Wenuganen (1997) pada vektor plasmid turunan pUC19 dinamai pWS506. Gen

kitinase tersebut dapat diekspresikan dengan baik pada Ekckriichia coli DHSa di

b a w d promotor gen penyandi enzim P-gdaktosidase ( C u d ) . Hasii penelitian

Wenuganen (1997) menunjukkan bahwa gen kitinase-tersebut diduga terklon tanpa

promotor aslinya.

Penelitian-penelitian pemanfaatan gen kitinase telah dilakukan baik dengan

mengkonstrue~ galur bakteri biokontrol maupun mengkonstruksi tanaman yang

membawa gen kitinase terhadap cendawan patogen (Boller et al., 1983; Hedrick ei

2

cendawan patogen, penelitian-penelitian tentang gen kitinase banyak dilakukan

untuk tujuan rnempelajari regulasi tahap degradasi dan pemanfiistan kitin,

rnengkadkerisasi gen-gen kitinase dan produk-produknya, serta model untuk

mempelajari regulasi ekspresi dan sekresi protein Wobbins et al., 1992; Fujii 62

Miyashita, 1993; Miyashita & Fujii, 1993; Brurberg et al., 1995, Watanabe et al., 1997)

Gen kitinase berpotensi untuk dimanfaatkan dalam mengkonstruksi galur-

gdur biokontrol potensial yang dapat mencegah timbulnya penyakit tumbuhan yang

disebabkan oleh cendawan. Biokontrol, berasal dari kata bioIogicaI controt, menjadi

komponen yang sangat penting &lam pertanian. Pestisida kimia telah menjadi suatu

substansi yang mencemaskan beberapa tahun terakhir hi, karena efek samping yang

dapat diiimbulkannya terhadap linglcungan yang rnembahayakan baik bagi

kesehatan manusia, maupun organisme nontarget lainnya, termasuk musuh alami

yang sebenarnya menguntungkan. Oleh karena itu dipandang penting

untuk

mengembangkan pengendali alternatif yang arnan dan layak lingkungan, terutama

dengan rnenggunakan organisme yang sudah ada

di

dalam

suatu

habitat alamiya.

Organisme-organisme ini mampu bertindak melindungi tanaman terhadap berbagai

macam cendawan patogen tanamaq tanpa m e n i m b u l b efek perusalcan terhadap sistem ekologis. Namun, sebelum biokontrol ini menjadi suatu komponen

dalam

penanganan penyakit tumbuhan, haruslah efektif, mampu bertahan, konsisten, dan

genetik untuk menarnbah ketangguhan atau memperluas spektrum aktivitas bioIogis

(Chet et al,, 1993).

Untuk rnemanipulasi dan mengintroduksi gen kitinase ke berbagai bakteri

selain E. coli dan kerabatnya, gen ini hams dikonstruksi pada plasmid vektor

berspektrum inang luas dan di bawah promotor yang sesuai agar dapat terekspresi,

sebagaimana yang dilalcukan dalam penelitian ini. Vektor plasmid yang berspektrum

inang luas yang sudah banyak digunakan anatara lain adalah pRK415, (JCeen et al.

1988). Selaim mengkonstruksi suatu gen di plasmid vektor berspektrum inang luas,

sebagian peneliti rnengkonstruksi gen yang diminati di dalam suatu transposon.

Beberapa penelitian m e r n b u k t i bahwa konstruksi suatu gen di dahm transposon, yang kemudian akan terintegrasi ke dalarn kromosom inang yang dituju sebagai

resipien, akan Iebih s a i l dibandingkan d m konstruksi pada vektor plasmid

yang dapat hilang karena adaptasi dan seieksi di alam (Koby et al, 1994; de

Lorenu, et d.,1990; Herrero ef al., 1990). Selain i t y lokasi penyisipan elemen

sisipan beserta gen yang dirninati di kromosom juga menjadi masalah yang harus

d iapakah penyisipan tersebut ~ ~

akan

mempengamhi kernampuan sel inang

dalam proses pertumbuhaq dan kernampuan m e u g k o l o n i s ~ serta kadcter-kamkkr

penting tainnya. Berdasarkan ha1 tersebut ~~i plasmid r e k o m b ' i fUsi

transkripsi pada penelitian ini diIakdcan pada beberapa vektor bexspektrum inang luas dan juga transposon Tn5 dengan menambahkan gen penanda antibiotik yang

sesuai untuk introduksi m e n fbsi transkripsi ke galur-gdur biokontrol

Ekspresi yang diharapkan dari suatu agens biokontrol antara lain adalah

ekspresi tanpa induksi, yaitu menghasilkan produk gen secara konstitutif dalam

tingkat konsentmsi tertentu, sehingga dapat berfimgsi sebagai pencegah serangan

patogen. Untuk tujuan tersebut dalam penelitian ini gen kitinase difusikan di bawah

promotor gen yang M i f a t konstitutif, yaitu promotor gen resistensi antibiotik Kanamisin (PICmR) clan promotor hibrid trp

dan

lac, Ptac. Promotor pICmR diambil

dari kaset gen resistensi Kanarnisin dari plasmid pUC4K yang berasal dari

transposon Tn903 (Oka et a1..1981). Promotor fac yang diambil dari plasmid

pKK223-3 (Pharmacia) adalah suatu promotor kuat dalam kondisi konstitutif

maupun terinduksi (Glick & Pastern& 1994). Koby et d (1994)

dan

Downing &

Thomson (2000), telah berhasil mengklon gen kitinase asal Sema murcecens dan

&ekspresikan di bawah promotor tat di dalam baik yang terkonstruksi di dalam

vektor plasmid maupun pada tmnsposon.

Galur biokontrol yang tengah d i m b a n g k a n terhadap patogen tanaman

kedelai Xbnakmtmm c a m p e m pathovarg2ycines adalah Psemhnonarfluorescem

B29 @ b a r h i , 1995; Suwanto et al, 1996, Manuella et al., 1997). Galur

Pf

B29

diisolasi dari daun tanaman kedelai yang terserang bakteri patogen tersebut. Peneliti-

penetiti terdahulu membulctikan bahwa @ur Pf B29 mampu m e n g e n d a t i bakteri

penyebab pushd pada kedelai seuua kompetitif (Nawangsih, 1997; Khaeruni, 1998).

Galur Pf B29 akan dikembangkan kemampuannya sebagai biokontrol terhadap

cendawan dengan mengkonstruksi galur B29 yang kitinolitik Dari studi

antibiotik Tetrasiklin (10 pg/ml), Kanamisin (25 pdrnl), Streptomisin dan

Spektinomisin (masing-masing 50

dd).

Untuk keperluan pemeliharaan dan

seleksi, h4ariani (1995), telah melakukan mutasi spontan pada Pf B29 sehingga

menjadi resisten terhadap antibiotik Rifampisin (100 pg/ml).

Gatur Pf lainnya yang juga sedang dikembangkan sebagai agens biokontrol

adalah isolat Pf5024 dan isolat PfS100, yang termasuk

Pf

kelompok Vb berdasarkan

pengelompolcan secara taksonomi yang diuraikan oleh Leltiott el a!. (1966). Isolat-

isolat tersebut merupakan galur-galur nonpatogen yang diisohsi dari pucuk brokoli

(Brassica oleracea var italics), dan telah dimanfaatkan sebagai biokontrol pada

pertanaman brokoli karena kemampuannya menghasilkan biosurfaktan (Campbell et

at., 1995). Isolat-isolat Pf tipe liar tersebut telah diiutasikan secara spontan

sehingga menjadi resisten terhadap antibiotik Rifampisin di dalam penelitian in<

untuk membantu proses seleksi balik (carnter-seZection) pada teknik introduksi gen

kitinase secara konjugasi bakterial.

Di d a b penelitian inii juga dilakukan sekuensing m e n

DNA

gen

penyandi kitinase (ch2 urrtuk memastikan struldur daerah promotor, selain

memperoleh infonnasi-informasi lain seperti hubungan karakternya dengan data

sekuens

DNA

yang sudah ada di database, sekuens asam-amino gen kitinase

dugaan, dan informasi tentang protein kitinase, berdasarkan data sekuens

DNA

yang

diperoleh Gen penyandi kitinase dari isolat bakteri tanah berasal dari Israel, Aeromonas caviae, telah diisolasi dan disekuens sepanjang 2.710 basa nukleotida

data pembanding bagi gen kitinase isolat asal Indonesa berdasarkan data sekuens

DNA yang diperoleh, dan akan merupakan suatu hat yang rnenarik, karena kedua

bakteri ini berasa1 dari daerah yang seuurr geografrs sangat berjauhan.

B. Tujuan Penelitian

Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan organisme

rekombinan, dalam ha1 ini

P.

fluorescens, yang memproduksi kitinase ekstraselular. Berdasarkan ha1 tersebut, maka penelitian ini dilakukan dengan suatu strategi yang meliputi beberapa tahapan, yaitu (i) mengkarakterisasi DNA gen kitinase (chi)

dengan sekuensing. Data sekuens DNA gen chi yang diperoleh dimanfaatkan dalarn

mempelajari d m meneliti kekerabatan gen chi ini dengan gen-gen kitinase lain yang

telah ada dengan m e m b a n d i a n n y a dengan data sekuens DNA di dblzbase. dan

membandingkan sekuens asarn amino turunannya; (ii) melakukan fusi gen chi di

bawah promotor konstitutif yang sesuai untuk ekspresi gen kitinase di inang selain

E.coli, sehingga produk kitinase &pat diekspresikan secara konstitutif; (ii)

mengintroduksi fbsi transkripsi gen chi ke galur-galur biokontrol P. jluorescew,

dan

(iv) menganalisis ekspresi gen chi pa& galur-galur bakteri biokontrol dengan esei

halitatif dan semikuantitatif aktivitas enzim kitinase.

C. Tahap Pengerjaan

Di &lam disertasi ini pekerjaan penelitian dibagi sebagai berikut, (i)

7

bersifrtt terhduks'i dan konstitutic pada vektor-vektor plasmid yang berspektrum

inang luas, d m pada vektor transposon, (iii) introduksi gen chi ke galur-galur bakteri

biokontrol P s e d m o n a s jluorescens, beserta esei ekspresinya pada media agar kitin

dan esei kuantitatif.

D. Manfaal: peneiitian

Di dalam rnengkonshuksi agens biokontrol, diharapkan suatu gen potensial

yang diklon dapat diekspresikan secara konstitutif. Dengan demikian produk gen

yang dihasilkan tidak b e r l e b i i sehingga tidak menyebabkan t o k s ' i d m inang klon gen tersebut, dalam ha1 ini agens biokontml. dapat mengadaptasi kondisi baru ini dengan baik, tanpa tejadi mutasi untuk mengatrtsi efek produk gen tersebut.

Ekspresi fusi transkripsi gen chi pada galur-galur biokontrol Pf akan sangat

A.Enzim kitinase

Kitinase adalah enzim yang mempunyai kemampuan mendegradasi kitin,

yaitu polisakarida yang &bangun oleh satuan N-asetilglukosamin dengan ikatan P(1-

4). Kitin (Garnbar 2.1) merupakan biopolimer yang paling metimpah di alam karena

merupakan komponen struktural dinding sel cendawan kecuali oomycetes, kerangka

luar artropod, kerangka luar molusca, cangkang luar cmstaceae dm nematod

(Adonreal 8t Reese, 1969; Cabib, 1987). Produk kitinase umum diproduksi di

berbagai organisme. Beberapa bakteri memproduksi kitinase untuk autilisis,

morfogenetis, maupun nutrisi yaitu memadaatkrtn kitin sebagai sumber karbon

(Gooday, 1990; Monreal 62 Reese, 1969; Roberts & Cabib, 1992; Watanabe et al., 1990). Prokariot yang banyak ditaporkan r n e m p r o d a i kit'mase adalah bakteri

luncur, Pseudomonad, Vibrio, Photobacterium, Enterobacteriaceae, Actinomycetes,

Bacillus dan Clostridium (Gooday, 1979; Jones et al., 1986, Watanabe et al., 1990; Bmrberg et al., 1995; Sitrit et al., 1995; Svitil el al., 1997). 1Mikroba-rnikroba

eukariot yang memiliki kemampuan m e n u d a d c m kitin sebagai sumber karbon dan

energi adatah Myxomycetes, Chytri4 Zygomycetes, Deutemmycetes, Ascomycetes dan Basidiomycetes, dengan memodifikasi konstituen struldur kitin (Ohtakara,

1961). Salah satu cendawan air tawar yang mempunyai kemampuan t d u t addah

Kmlingia asteraysfa yang bersifat kitofil obligat. Ditemukan pula arnuba tanah

tinggi juga dilaporkan produe1 enzim pengbidrolisis kitin tersebut (Powning &

Irzykiewcz, 1965; Abeles et al., 1970; Pegg & Vassey, 1973; Boller eta/-, 1983). Di alam terdapat beberapa bentuk kitin, yang tenrtama ditemukan adalah

bentuk a-kitin, berupa rantai yang terancang sebagai antiparalel, misalnya pada

kaliks hydrozoa, kulit telur nematoda, dm raduhe moluska. Bentuk kitin yang lain

adalah 0-kitin, terancang sebagai rantai yang paralel, umumnya terdapat pada

caugkang moluska. dan y-kitin yang me~pakat'b jenis kitin yang t e d i dari

campran antara kedua jenis kitin ( a clan P)yang disebut di atas (Svitil el d., 1997;

Gooday, 1990).

A0

\

CHI

Proses degradasi kitin dapat melalui dua lintasan (Gambar 2.2). Lintasan

pertama adalah hidrolisis ikatan P(1-4) yang disebut proses kitinolitik. Enzim yang

berperan dalarn proses tersebut adalah enzim kitinme. Proses kitinolitik melibatkan

dua jenis enzim kitinase, yaitu eksokitinase dan endoki*. Eksokitinase

memotong unit diasetilkitobiosa nonreduksi pada ujung rantai polimer, sedangkan

diasetilkitobiosa sebagai hasii utama

dan

triasetiikitotriosa, yang lambat laun a h

didegradasi menjadi disakarida dan monosakarida. Bentuk di- dan mono- akan

diangkut ke dalam sel mikroorganisme dan b e d b g s i sebagai sumber karbon dan

nitrogen. Di dalam sel, metabolisme N-asetilglukosamin dapat melalui fosforilasi

N-

asetilglukosamin-6-fosfat, ataupun melalui deasetilasi menjdi glukosamin, melalui

deaminasi, dan selanjutnya meialui hidrolisis menjadi glukosa oleh glukosaminidase

(Gooday, 1990).

Lintasan alternatif degradasi kitin adalah lintasan yang melibatkan deasetilasi

kitin menjadi kitosan. Proses ini penting untuk lingkungan yang memiliki

kandungan kitosan pada sedimen perairan. Enzim kitosanase dapat menghidrolisis

ikatan glikosida P(1-4) pada kitosan menghasilkan kitobiosa, kemudian kitobiosa

dihidrolisis oleh eN-asetilglukosaminidase menjadi N-asetilglukosamin (Gooday,

1990).

KAsetIl

1

Kitosanase

glukosarninidase

1

Kitobima

N-asetilglukosamin (Glukosaminil glukosaminida) GI kNAs

D d I A d k J I l n ! d a s e Glukoasamin

[image:32.563.40.463.21.511.2]

( G l W

B.

Gen kitinase bakteri yang telah dilaporkan

Kitinase baEderi, yaitu kitinase yang dihasilkan oleh bakteri, mempunyai

mekanisme aktivitas antikngi yang berbeda dari kitinase tanaman. Kitinase bakteri

berperanan penting dalam menjaga keseimbangan ekologis dengan mendegradasi

dan mengubah kitin menjadi bentuk biologis yang bermanfaat, disamping

memanfaatkan kitin sebagai sumber nutrisi (Roberts & Selitrennikoe 1988). Berdasarkan sekuens DNA, Ohno ef al. (1996) menyebutkan bahwa gen-gen kitinase dapat dikelompokkan menjadi dua firmili yaitu M l i 18 dan 19. Kitinase bakteri

sesungguhnya berada dalam satu kelompok famili 18 bersama kitinase dari cendawan, virus, hewan dan kelas

III

dan V kitinase tumbuhan. Kitinase yang

termasuk famili 19 adalah k e h I,

II

clan

IV

kitinase tumbuhan. Namun, Saito et d

(1999) melaporkan kini telah ada kitinase bakteri yang dapat dikelompokkan ke

&lam Eamili 19.

Berbagai gen kitinase bakteri telah dikion dan dikarakterisasi bersarna

dengan produk transLas'mya dari bakteri aerob mauputt anaerob. W i e dari

Serratia rnarcescens telah banyak diteliii serta gen-gen kitinasenya telah & i o n

dan disekuens.

Gen yang menyandikan kitinase utarna dari Serratia marcescecens, yaitu chitinase A

(chL4) telah diklon oleh Downing & Thomson (2000) di bawah kendali promotor

tac, baik disisipkan di suatu plasmid berspektrum inang luas, maupun di wtuvektor integrasi, dan diintroduksi ke P. frtlorescem. Galw Pf yang membawa tac-chiA baik

yang efektif terhadap cendawan patogen tanaman Rhizoctonia soIani. Struldur tiga dimensi enzim kitinase chiA dari S. marcescens galur QMB1466 telah

dikarakterisasi dan dilaporkan oleh Srurberg et al. (1996), serta pembandingan

sekuens-sekuens chitinuse A d m B telah dilakukan beserta lokalisasi seluIarnya di

klon E. coli. Suatu sistem transposon Tn7 yang membawa gen chiA telah dikonstruksi oleh Koby et al. (1994) dalam bentuk &si operon di bawah promotor

h c . K o n s t ~ u ~ ini telah diintroduksi ke dalam Pseudomona~ ji'uorescens dan

terintegrasi dengan stabil, serta mengekspresikan enzirn kitinase yang aktiE Galur

biokontrol tersebut telah diuji pula kernampuan melindungi kecambah biji kapas

terhadap Rhizoctonza s o h i . Sebelumnya Sundheim et al. (1988) telah behasil

mengklon dua macam kitinase dari Serratia mmcescens, kemudian mengintmduksi salah satu gen kitinase tersebut ke Pseuabmonm fluorescens. M ~ v i t a s kitinase

dapat terekspresi di

P.

Ji'uorescens, dan galur tersebut dapat menghambat pertumbuhan tabung kecambah dari F d u m o ~ ~ c u r n fsp. re&Zens, seserta

menurunkan smmga~~ penyakit

pada

lobak yang dibabkan oleh cendawan

tersebut.

EnteroZMcler aggiorneram juga merupakan bakteri sumber gen kitinase

bakteri yang betpotexmi. Chernin et al. (1997) telah mengklon dan mengkadcterisasi

sekuens gen penyandi endokitinase chiA dari E agglomerans. Selruens lengkap gen

chi4 telah dilaporkan, dan dari sekuens asam amino turunsnnya diperoleh i n f o m i

d a n y a suatu kerangka baca terbuka (open reading frame =

ORF)

yang

menyandikan 562 asam amino dari suatu protein prekuisor dengan berat molekd 61

13

karboksil. Chernin et al. (1995) telah berhasil mendeteksi empat macam enzim

kitinase, yaitu dua macarn N-asetil-j3-D-glukosaminidase dengan berat molekul 89

kDa dan 67 ma, satu endokitinase dengan berat molekul 59 kDa, serta suaiu

kitobiosidase dengan berat molekul 50 kDa. Kuantifikasi enzim-enzirn kitinase

tersebut dilakukan menggunakan substrat kromogenik analog p-nitrofenil disakarida,

trisakarida dan tetrasakarida turunan N-asetifglukosarnin

Isolat kitinolitik dari Aerornonas m l a e yang diisolasi dari akar tanaman

buncis yang sehat yang tumbuh di tanah yang mengandung Sclerotium rolfsii

dilaporkan bahwa secara artifisid dapat mengendalikan Rhizoctonia s o h i dan

F w i w n oxyqmrwn fsp. vainfeeturn dikapas dan S. rolfsii di buncis di dalam kondisi rumah kaca. Inbar & Chet (1991) telah mengkadcterisasi produk kitinase yang dihasilkan. Ekspresi gen k i t i i s e dari A. d u e

di

Ecoli telah dianalisis oleh

Sitrit et al(1995) dan menunjukkan produk kitinase yang aktif. Selruens nukleotida

gen tersebut telah dikar%kterisasi, dan dilaporkiui mempunyai kerninpan ti@

dengan gen chi4 dari S. marcescens. Produk kitinase dari suatu isolat Aeromonas sp telah dikarakterisasi oleh Ueda et al. (1992) dan Utda et al. (1998), dan dilaporkan

ada delapan macam kitinase. Salah satu gen kitinase tersebut telah diklon dan di

karakterisasi &ens nukleotidanya

BacilZus sp adalah kelompok bakteri yang termasuk berpotensi memproduksi

14

(Watanabe ei al., 1990; Watanabe et a/., 1992; Watanabe et al., 1994; Alam et al.,

1995; Alam et al., 1996)

Suatu penelitian enzim kitinase bakteri pada Vibrio harveyz (Svitil et al.,

1997) menunjukkan bahwa keragaman jenis enzim kitinolitik yang dihasilkan oleh

setiap rnikroorganisme disebabkan perbedaan jenis substrat kitin yang didegradasi, dan jenis turunan kitin. Enzim-enzim kitinase yang dihasilkan menunjukkan

perbedaan berdasarkan pola restriksi DNA data imunologi, dan aktivitas enzim Streptomyces adalah bakteri tanah bersifat saprofit yang merupakan salah

satu penghasii kitinase utama di dalam lingkungan tanah. Telah banyak gen-gen

kitinase yang diklon dari kelompok ini, yang sumbernya berasal dari S. plicatus (Robbins et al., 1992), S. Iiviabw (Fujii & Miyashita, 1992; Miyashita & Fujii, 1992), S. gri~ars (Ohno et al., 1996), d m S. coelicolor (Saito el al., 1999).

Enzim kitinase yang terdapat pada tumbuhan tidak satupun yang

menunjukkan homologi dengan enzim kitinase yang dihasilkan mikroba,

sebagaimana diutarakan oleh Oppenheim 62 Chet (1992). Roberts & Selitrennikoff

(1988) membandingkan aktivitas anti- kitinase tumbuhan dari biji gandum

terhadap kitinase bakteri dari Serratia m~llcescens, Stmptornyces dan

Pseudomoms stutzeri. Uji dil- berdasarkan penghambatan pemanjaagan hifa

cendawan uji Trichoderma reesei d m Phyumycxs bIakzsleearzus. Disebutkan

bahwa perbedaan aktivitas antifungi kedua jenis kitinase berkaitan dengan perbedaan

mekanisme dari dua kelas enzim kitinase. Kitinase tumbuhan merupakan

Pseudomoms fluorescens tennasuk datam genus Pseudornonas pada

kelompok Pseudomonad. Kelompok ini merupakan kelompok kemoorganotrofik

aerob yang tidak menunjukkan metabolisme fermentatit respirasi bersifat obligat,

mempunyai kemarnpuan denitrifikasi, berupa Gram negatic bersel tunggal,

berbentuk batang lurus atau bengkok, berukuran 0.5 - 1.0 pn x 1.5 - 4.0 pm,

dengan flagella polar, tunggal afaupun majemuk. Bakteri-bakteri Pseudomonad hanya membutuhkan nutrien yang sederhana untuk pertumbuhannya, serta hidup

pada kicisaran pH netral dan suhu mesofilik (Madigan e f al., 1997). Namun, beberapa

bakteri kelompok ini dapat pula dijumpai bertahan hidup pada kondisi suhu, pH, dan

faktor-faktoc fisik dan kimia yang ekstrim (Lindow. 1992).

Secara

filogenetis

anggota kelompok ini tersebar di dalam kelornpok bakteri ungu di dalam kingdom

Balderi. Spesies-spesies genus P&monas dapat dibedakan berdasarkrrn berbagai

karakter fisiologis dan genetiknya. Berdasarkan analisis 16s r R N q P. fluorescens

dikelornpokkan ke dalam bakteri ungu hlompok gamma, bersama

P.

a e ~ ~ m s a .

P.

putiab, dan P. syrhgue yang disebut subkelompok Fluoresens. Persen (%) mol GC

DNA bakteri subkelompok ini berkisar antara 58 sampai 67 %, dimana P.

fluorescens mempunyai % mol

GC

59-61. Berdasarkm fisiologinya, P. fluorescens

dibedakan berdasarkan adanya flagella polar yang majemuk, dan berdasarkan

Spesies-spesies Pseudomonas yang betfluoresens adalah kelompok bakteri

yang berperan penting dalam melindungi tumbuhan dari serangan mikroorganisme

patogen Bakteri-bakteri tersebut rnenghasilkan sejumlah besar -or antagonis

terhadap patogen, berupa siderofor yang berwarna kuning kehijauan dan

berfluoresens yang merupakan ciri khasnya. Produk selcunder lainnya yang juga

berperan penting daIam kemampuan bakteri-bakteri ini sebagai biokontrol terhadap

patogen adalah kemampuannya menghasilkan hidrogen sianida dan mensintesis

antibiotik-antibiotik, seperti phenazines dan phlorogluczonol (Lindow, 1992).

B e r d m k a n ha1 tersebut, selain kemampuannya tumbuh pada kondisi nutrien yang

minim, maka bakteri kelompok ini mampu mengkolonisasi tempat hidup yang

seperti di tumbuhan, baik dilinglolngan

akar

maupun 61 permukaan

daun, dan berkompetisi dengan mikroorganisme lainya.

D. Teknologi

DNA

rekombinan

Telcnologi DNA r e k o m b i i sering pula disebut kloning gen ataupun kloning rnolekuIer, adalafi sejumlah eksperimen tertentu yang bertujuan mentransfer

inforrnasi genetik (DNA) dari satu organisme ke organisme lain.

Eksperimen DNA rekombinan secara umum meliputj (i) pengekstraksi

DNA dari organisme donor, baik itu DNA klon, DNA sisipan, DNA target, maupun DNA asing; (ii) pernotongan secara enzimatis, dan penyambungan ke DNA vektor

untuk membentuk rnolekul DNA rekombinasi baru; (iii) transfer hasil konstruksi

dan (v) identifikasi sel-sel inang yang menangkap dan membawa konstruksi

D N A

(sel tertransform, transforman). dan seleksi dari yang bukan transforman (Glick &

Pastemak, 1994).

Pada dasarnya

D N A

diekstraksi dari sel berdasarkan prinsip sebagai berikut,

(i) penghancuran dinding sel, baik secara mekanis maupun enzirnatk sebagai

contoh penggunaan lisozim; (ii) pelisisan set, dapat dilalcukan dengan penambahan

deterjen seperti

SDS

(sodium dodecyl sulphate); (ui) pembersihan debris sel,

dilalarkan dengan sentrifugasi, serta memisahkan protein dari lisat dengan ekstraksi

menggunakan pelarut organik &no1 bersama dengan kloroform dan isoarnil alkohol; (iv) pengendapan

D N A

dari lisat jernih dengan menarnbahkan etanol dan garam

natrium, atau dapat pula dengan sentdkgasi gradien menggunakan Cesium klorida

(CsCIz), yang dapat memisahkan

D N A

plasmid dari

D N A

kromosom (Old &

Primrose, 1985).

Pada kloning molekular,

DNA

sisipam atau

D N A

target, serta

D N A

vektor

hams dipotong menjadi -en linier, ulrtuk saling disambuagkan. Penmtongan

D N A

merupakan kerja dari suatu enzim yang diproduksi oleh beberapa bakteri, yang

disebut endonuklease restriksi tipe 11 atau disebut puIa enzim restiksi. Enzim ini

bersifat spesifik mengenali s e h e n s pasangan basa dalam bekerja memotong

D N A

utas ganda, sehingga menghasilkan

D N A

dengan patongan yang unik. Enzim ini

bekerja memotong

D N A

dengan mengenali sehens spesifk yang pendek secara

oleh enzim pereparasi sel inang. Hasil pemotongan DNA dapat bempa molekul

berujung mencuat atau lengket yaitu berujung 5'-fosfat dan berujung 3'-OH, serta

berujung tumpul, yaitu kedua utas terpotong pada situs yang sama. Fragmen DNA

yang diperoleh saling disambungkan dengan bantuan enzim ligase D N A Enzim ini bekerja menyambungkan setiap bagian terputus di dalam molekul DNA yang

mempunyai ujung 5'-fosfat dengan 3'-OH. Di dafam sel, enzim ini mempunyai

tugas sebagai perangkat reparasi bersama dengan polimerase DNA I dalam proses replikasi DNA (Madigan et al., 1997; Gtick & Pastemak, 1994).

Untuk membawa sisipan DNA yang disambungkan diperlukan suatu vektor kloning. Vektor kloning adalah rnolekul DNA yang telah terkmakterisasi dengan baik, yang memungkinkan introduksi molekul DNA rekomb'inan ke sel inang yang

&

serta memungkinkan bertahan secara stabil di sel inang. Hal-ha1 yang

merupakan kngsi dasar suatu vektor adalah, (i) replikon, terdiri dari suatu origin of

replicutz-on dan gen-gen lain yang memungkinkan m o l e h l

ini

untuk b e r e p b i

sebagai elemen ekstrakromosornal, tidak tergantung

dari

pengendalian kromosomal;

(ii)

memiliki penanda seleksi biasanya merupakan gen-gen penyandi resistensi

terhadap senyawa toksik, seperti antibiotik, atau gen-gen yang merupakan

komplemen dari s f i t aubotmfi bakteri inang; dan (ui) t d k n y a situssitus endonuklease restriksi unik sebagai situs kloning sisipan DNA Wagdasarian &

Bagdasarian, 1994; Madigan et al., 1997).

Banyak vektor yang dilengkapi dengan kernanfaatan lain untuk

ekspresi klon gen, introduksi ke b d a g a i inang bakteri, atau seleksi fungsi spesifik,

misalnya promotor atau terminator. Vektor yang umum digunakan adalah plasmid,

bakteriofaga h, phagemid,

dan

wsmid (Bagdasarian & Bagdasarian, 1994).

Plasmid perlu mempunyai sifat-sifat yang menjadikannya suatu vektor

kloning berkualitas tinggi, selain sifat-sifat vektor yang telah disebutkan di atas,

antara lain, (i) berukuran kecil, sehingga molekul DNA mudah diisolasi dan dimanipulasi Efisiensi transfer DNA s i n g ke datam E. coli menurun secara nyata dengan bertambahnya ukuran plasmid di atas 15 kilopasangbasa. Selain itu, (ii)

berbentuk sirkular, sehingga molelcul DNA stabil selama proses isolasi secara

kimiawi;

dan

(iii) jumlah kopi

berganda,

sehingga dapat berada dalam sel dalam

jumlah banyak, clan memungkinkan arnplif& molekul DNA (Madigan et al., 1997; Glick & Pastemak, 1994).

Berdasarkan ha1 tersebut, biasanya plasmid untuk velctor kloning merupakan molekul DNA hasil rekayasa gen-. Plasmid sebagai vektor kloning dengan

sistem inang E. coli

dan

kerabatnya telah banyak dikembangkan

dan

digunakan.

Namun, ada beberapa ket- dahm penggunaan sistem inang E. cdi, yaitu (i)

k e b a n y k plasmid vektor yang digunakan, yang berulruran kecil dan berjumlah

kopi tinggi seperti disebutkm di atas, berspektmm inang sempit, sehingga tidak matnpu ditransfer ke dan b e r e p l i i i di inang spesies lain; (ii) sinyal trauskripsi dan

translasi spesies lain

tidak

dikenali dengan baik oleh inang E. coli, sehingga ekspresi

gen-gen heterologus di E: cdi l e d ,

(ii)

sulit mempelajari fbngsi gen-gen dengan

hidrokarbon, deklorinasi, fiksasi nitrogen; dan (iv) kemungkinan toksisitas dari

produk-produk gen-gen heterologus terhadap sel E. coli (Bagdasarian & Bagdasarian, 1994).

Plasmid dengan replikon berspektrum inang luas seperti replikon dari

turunan IncPl dm IncQ sangat berguna untuk mengkonstruksi suatu plasmid rekombinan serta mengadisis ekspresi gen yang terkonstruksi di dalam vektor

plasmid ke dalam inang s e k n E. coli dan kerabatnya, namun umumnya berukuran relatif besar dan berjumlah kopi rendah. Sebagai contoh, pRK4 15 (Keen et al., 1988)

merupakan turunan plasmid RK2 dari kelompok inkompatibilitas

P-1

yang sangat

mirip dengan RPl. RP4 dan R68 @itta et al., 1985). Plasmid pRK415 memiliki

oriT, oriV, sebagian hngsi transfer

(m

clan DNA penyandi resistensi tehadap

tetrasiklin.

DNA murni yang sudah d i n g tersambungkan sntara vektor dan sisipan,

kemudian di transfer ke sel inang melalui proses yang d i i b u t transformasi.

Karakteristik yang ideal untuk surrtu inang kloning gen adalah (i) pertumbuhan cepat

dan baik, mampu tumbuh pada medium murah;

(-5)

tidak berbahaya dan

nonpatogenik; (iii) mampu menangkap/mengambil molekul DNA,

dan

stabil dalam

kultur, (iv) m e m i l i enzim yang sesuai untuk r e p l i i i vektor rekombinan; (v)

mempunyai informasi genetis yang selengkap mungkiw, dan (vi) mempunyai

Mutasi-mutasi tertentu terhadap galur-galur sel inang telah dilakukan untuk

memenuhi kriteria tersebut di atas, dan untuk meningkatkan efisiensi stabilitas

plasmid rekombinan setelah tertransfornasi serta membantu analisis galur yang

tertransformsi. Untuk memastikan plasmid rekombinan tetap berada dalam bentuk

originalnya, sel inang dimutasi menjadi negatif rekombinasi (RecA-), uniuk

menghindari terjadinya rekombinasi dengan genom inang. Selain itu sel inang

dimutasi tidak memiliki gen-gen untuk enzirn-enzim endonuklease restriksi (Glick &

Pasternak, 1994).

Inang yang sering digunakan ddam kloning gen adalah E. coli, disamping

bakteri Gram-positif Baci1Iu.s subtilis, dan juga Saccharomyces cereviseae untuk

ekspresi gen-gen eukariot. Beberapa galur E. c d i sebagai inang proses transformi telah dieliminase e k s o ~ l k ~ ~ n u k l ~ y a , serta

ada

pula yang diiutasi kemampuan restriksiiya (hsdR) sehingga DNA rekombinan yang akan

ditransformasi dapat terhindar dari restriksi oleh enzim restciks'~ yang d W ioleh inang. Ada galur E. coli yang dimutasi pada bagian

CacZ

tertentu, misalnya

lacZAtvl15 pada galur DHSa, untuk d h m h & a n sebagai penselel& transforman.

J i i a galur ini d i f o r m a s i oleh plasmid yang membawa daerah regulator operon

lac, yaitu gen penyandi P-gahktosidase, dan suatu segmen pendek DNA penyandi

ujung amino terminal ZacZ, maka peptida hasil ekspresi bagian amino terminal ZacZ

yang disandikan plasmid tersebut b e r k o m b i i i dengan produk P-galalctosidase tidak

lengkap yang dihasilkan galur lacZAM15, menghasilkan P-galaktosidase yang

f b n g s i o d ini disebut kornplernentasia. P-Galaktosidase fingsional ini dapat

diinduksi oleh isopmpil-P-D-tiogalaktopiranosida (IPTG). Fenotipe ini dapat diamati

sebagai warna biru yang dihasilkan dari reaksi dengan substrat krornogenik 5-

brom&-~hZor~3-zndo~-~D-galacto~mrosid (x-GalR) yang ditambahkan ke

&lam medium. Suatu multiple cloning region atau disebut pula multiple cloning

sites (MCS), yaitu suatu daerah sempit seb& situs penyisipan suatu -men DNA, telah diiancang tepat di bagian hilir IacZ di beberapa plasmid vektor Honing. Jika

DNA terklon pada daerah tersebut, maka aktivitas hngsional

lacZ

di plasmid

terganggu, sehingga tidak menghasilkan P-galaktosidase yang fUngsional, dengan

demikian substrat tidak bereaksi menghasilkan warm b i i . Hal ini dimanfaatkan

untuk membedakan set transforman antara yang membawa plasmid rekombinan dengan yang membawa plasmid vektor tanpa DNA sisipan pada proses seleksi

dengan prinsip seleksi koloni biru putih (Provence & Curtiss

IE.,

1994).

Seleksi transfonnan yang membawa klon gen yang benar adalah tahap yang pent*. Seleksi antara inang yang merupakan transforman dengan yang bukan

transforrnan dapat memanfaatkan penginaldifan gen peoanda pada vektor plasmid,

dapat pula dengan seleksi koloni bii-putih. Untuk vektor asal virus, dapat dilakukan

dengan mengamati plaque yang terbentuk Namun, untuk membedakan antara

transforman yang tidak membawa klon gen dengan yang membawa klon gen yang

benar &pat dilakukan dengan m e f i i ekspresi klon gen dalam sel inang. OIeh

karena itu d d v i t a s protein procluk klon gen harus dapat diesei (Madigan et al.,

d i i n a k a n metode antigen antibodi. J i i tidak ada antibodi yang sesuai untuk

produk gen, maka digunakan probe asam nukleat. Dengan cara hibridisasi DNA menggunakan probe yang sesuai, akan dapat ditemukan transforman mana yang membawa klon gen (Midigan et at., 1997)

Pada kloning gen, dapat pula d h m f " t k a n suatu transposon sebagai vektor

integrasi, karena kemampuannya menyisip dan berintegrasi ke kromosom, sehingga

dapat digumkan sebagai pembawa gen yang akan diidroduksi ke suatu kromosom

bakteri, selain itu juga berguna pada keperluan ekspresi klon gen dalam jurnlah kopi tunggai (Madigan ef al., 1997, de Bruijn & Rossbach, 1994). Transposon adalafi suatu elemen loncat yang mampu berpindah dan menyisip dari suatu molekul DNA ke molekul DNA lain. Transposon membawa elemen IS dengan orientasi searah

maupun berlawanan pada kedua ujung elemen, membawa gen penyandi enzim transposase yaug terlibat pada proses transposisi, dan membawa suatu gen resistensi antibiotik, atau resistensi logam berat, 8tau gen penentu patogenisitas. d e Lorenzo et

d , 1990, clan Hemem et al, 1990, telah mengkonstmksi trausposon krdamm mini yang dirancang dengsn behagai penan