PEN ERAPAN TEKN I K- TEKN I K KLON I N G GEN D ALAM KEH I D UPAN M AN USI A
M I ZAW ARTI ,S.SI
Pr ogr a m St u di Biologi
Fa k u lt a s M a t e m a t ik a D a n I lm u Pe n ge t a h u a n Ala m Un ive r sit a s Su m a t e r a Ut a r a
I . Pe n da h u lu a n
1 .1 La h ir n y a Klon in g Ge n
Kira- k ira sat u abat y ang lalu Gregor Mandel t elah m erum usk an at uran- at uran unt uk m enerangk an pew arisan sifat - sifat biologis. Sifat - sifat organism e y ang dapat diw ariskan diat ur oleh suat u fak t or y ang disebut gen, y ait u suat u part ikel y ang berada di suat u di dalam sel t epat ny a di dalam k rom osom .
Gen m enj adi dasar dalam pengem bangan penelit ian genet ika m eliput i pem et aan gen, m enganalisis posisi gen pada k rom osom .
Hasil penelit ian t elah berkem bang baik dik et ahuiny a DNA sebagai m at erial genet ik besert a st ruk t urny a, k ode- k ode genet ik sert a proses t ranskripsi dan t ranslasi dapat dij abarkan.
Suat u penelit ian yang m erupakan revolusi dalam Biologi m edern adalah set elah m unculnya m et ode t eknologi DNA rekom binasi at au rekayasa genet ika yang int i prosesnya adalah kloning gen yait u suat u prosedur unt uk m em peroleh replika y ang dapat sam a dari sel at au organism e t unggal.
I I . La n gk a h - la n gk a h da sa r Klon in g Ge n
Ada beberapa langk ah dasar dalam Kloning Gen y ait u sebagai berik ut :
1. Suat u frakm en DNA yang m engandung gen yang akan diklon diinsersikan pada m olekul DNA sirkular yang di sebut sekt or unt uk m enghasilkan chim oera at au m olek ul DNA rek om biner.
2. Vek t or bert indak sebagai w ahana y ang m em baw a gen m asuk k edalam sel t uan rum ah ( host ) y ang biasany a berupa bak t eri, w alaaupun sel- sel j enis lain dapat di gunak an.
3. Didalam sel host , vekt or m engadakan replikasi m enghasilkan banyak kopi at au t urunan yang ident ik, baik vekt ornya sendiri m aupun gen yang dibaw any a.
4. Ket ik a sel host m em belah, k opi m olek ul DNA rek om binasi diw ariskan pada progeni dan t erj adi replikasi vekt or selanj ut nya.
5. Set elah t erj adi sej um lah besar pem belahan sel, m ak a dihasilkan k oloni at au klonsel host yang ident ik
Tiap- t iap sel dalam klon m engandung sat u kopi at au lebih m olekul DNA rek om binasi dengan dem ik ian dik at ak an bahw a gen y ang dibaw a oleh m olek ul rekom binasi t elah diklon.
I I I . W a h a n a da n k e t r a m pila n da sa r u n t u k Klon in g Ge n
sel t uan rum ah sert a dapat m engadak an replikasi unt uk m enghasilkan k opi dalam j um lah besar.
Dua j enis m olekul DNA alam iah yang m em enuhi persyarat an t ersebut adalah :
1. Plasm id, m erupak an m olek ul DNA sirkuler y ang t erdapat dalam bak t eri dan berbagai organism e lain. Plasm id dapat m elak uk an replikasi dengan t idak t ergant ung pada k rom osom sel t uan rum ah.
2. Krim osom virus, t erut am a bakt eriofog, yait u virus yang harus m enginfeksi bakt eri pada w akt u infeksi m olekul DNA bakt eriofog diinfeksikan ke dalam sel t uan rum ah, dan kem udian DNA ini m engalam i replikasi.
Molek ul DNA plasm id dan bak t eriofog m em puny ai sifat - sifat dasar y ang dit ent uk an sebagai w ahana k loning, nam un sifat ini t idak berguna t anpa adany a t ehnik- t ehnik eksperim en unt uk m anipulasi m olekul DNA di dalam laborat orium . Ket ram pilan dasar unt uk m elak uk an k loning secara sederhana adalah :
1. Preperasi sam pel DNA m urni 2. Pem ot ongan DNA m urni 3. Analisis ukuran fragm en DNA 4. Penggolongan m olekul DNA
5. Mem asuk an m olek ul DNA k e dalam sel t uan rum ah
6. I dent ifikasi sel yang m engandung m olekul DNA rekom binasi.
I V . Te h n ik - t e h n ik Klon in g Ge n
2 .1 . Pe n gk lon a n c D N A
Sebagian besar, m et ode- m et ode y ang digunak an oleh perusahaan-perusahaan pengklonan gen unt uk m em peroleh DNA rekom binan yang t erdiri dari gen yang diinginkan dalam vekt or ekspresi, adalah sam a yang digunakan dalam laborat orium - laborat orium penelit ian.
Karena banyak prot ein yang bernilai kom ersil hanya t erdapat dalam j um lah kecil dalam sel- sel dan j aringan hew an, dan karena ekspresi gen flon it u sangat pent ing, m ak a bany ak pek erj aan k om ersial it u t erpusat pada pengk lonan c DNA dari m RNA- m RNA yang t erdapat dalam j um lah sangat kecil didalam sel. Pendekat an lain yang digunakan unt uk m em peroleh insulin m anusia, adalah sint esis kim ia dari suat u gen.
Ham pir set iap m olek ul m RNA euk ariot pada uj ung 3’- ny a m em puny ai rangkaian resedu nukleot ida adenin yang disebut ekor poli- A. Apapun fungsinya, poli- A it u m em berikan j alan yang m udah unt uk m ensint esis suat u unt aian DNA yang k om plem ent er t erhadap m RNA- ny a. JI Ka rant ai- rant ai pendek dari oligo –dT dicam pur dengan m RNA, rant ai t ersebut berhibridasiasi ke ekor poli- A unt uk m em berikan suat u prim er unt uk aksinya enzim t ransfript ase balik. Enzim ini, yang disolasik an dari v irus- v irus t um or RNA t ert ent u dapat m enggunak an RNA sebagai cet akan unt uk m ensint esis suat u unt aian DNA. Hasil reaksinya adalah suat u hibrida RNA- DNA, unt aian DNA yang baru it u m em punyai lingkaran t usuk konde pada uj ungny a, t am pak ny a sebagai hasil dari enzim “ m em ut ari sudut “ dan m ulai m engkopi dirinya sendiri. Lingkaran t usuk konde it u m ungkin m erupakan suat u art efak ( sesuat u y ang buat an ) ‘in v it ro’ t et api ia m em ang m em berikan suat u prim er yang sangat m udah unt uk pem buat an unt aian DNA yang kedua. cDNA ( DNA k om plem ent er ) berant aian ganda y ang dihasilkan m em puny ai lingk aran t usuk konde yang ut uh ini dapat dibelah oleh S1 nuklease, yait u suat u nuklease spesifik yang berunt aian t unggal.
t erm inal t ransferase at au dengan m enam bahk an t em pat - t em pat enzim rest rik si buat an pada uj ung- uj ung cDNA- nya.
Tem pat - t em pat rest rik si ini y ang k it a sebut ‘peny am bung” ( “ link er” ) adalah oligunek loit ida- oligunek loit ida dari 8 sam pai 10 pasangan basa y ang dibuat secara kim ia.Penyam bung- penyam bung it u dit am bahkan pada cDNA berunt aian ganda dengan m enggunakan DNA ligase, lalu penyam bung- penyam bung it u digunt ing hingga t erbuka dengan enzim rest riksi, dan cDNA- nya, yang sekarang m engandung uj ung- uj ung lek at y ang dihasilkan oleh enzim t adi, dim asuk k an k e dalam pBR 322 y ang t elah di belah dengan enzim y ang sam a. Kem udian plasm id rek om binan y ang m engandung cDNA yang di hasilkan it u, dim asukkan ke dalam st rain “ E. coli “ yang sesuai dan dik em bangbiak k an.
2 .2 Ge n pe n gk lon a n : D N A r e k om bin a n
Bakt eri m erupakan m esin- m esin efesien unt uk unt uk m encipt akan t urunuan ident ik DNA bact erifogdalam j um lah. Begit u m asuk dalam sel im angny a. DNA fag t ersebut berlipat ganda berkali- k ali, t urunan dik em as k edalam part ikel- part ik el berday a t ulang, baru dilepas dari sel inangny a sehingga siap m engulangi daur infeksit er sebut . Jika kit a adapat m enem pelkan gen eukar iot ik kepada m olekul DNA fag sepert i it u, m ak a dapat direflikasi dengan cara y ang sam a sek ali lagi endonukliase rest riksi m em ungkinkan m usliaht it u. Ekori adalah endonuklease rest t riksi yang dihasilkan oleh “ E. koli” . enzim ini m em belah DNA hanya dit em pat yang m eliput i rangkaiannya.
Set iap ut usan pilihan ganda it u dipot ong diant ara buangin dan adenin. Set iap kali hal ini t erj adi uj ung- uj ung belahan film an ganda it u m em baaw a panj ang t am bahan em apt nukleot ida. DNA yang berpasangan ( berhelai t unggal) , yang dinam ai uj ung “ lengket ” karena m apu berpasangan basa dengan m olekul DNA yang m anapun m engandung uj ung lengket pelengkap. Gagasannya adalah m em perlak uk an k edua DNA euk ariot ik dan DNA bak t eriopag dengan endonuk lease ret riksi y ang sam a sehingga t ercipt a uj ung- uj ung pelengk ap pada m asing- m asing. Dalam keadan yang sesusai, secara bercam pur m olekul- m olekul DNA eukariot ik akan m enem pel pada m olekul- m olekul DNA dengan uj ung- uj ung lengket nya m asing-m asing. Keasing-m udian DNA ligase dapat dipak ai unt uk asing-m engait k an secara k ov alen m olekul- m olekul it u bersam a. Beberapa dari hibrid at au m olekul- m olekul rek om binan ini ak an t et ap berday a infek si pada inang bak t eriofogny a ( ek oli) sebagaim ana bak t eriofog y ang norm al. Hal ini dapat didet ek si dengan m em biarkan ekoli t erbuka bagi cam puran m olekul DNA rekom binan dan selanj ut nya m enabur sel-sel pada caw an fet ri berisi agar. Sel- sel-sel bakt eri it u m ulai berkem bang biak, m em bent uk selaput sel- sel diperm uk aan agar. Ak an t et api, set iap sel y ang secara berhasil diinfeksi oelh m olekul- m oleku DNA rekom binan akan m em bent uk banyak t urunan baru DNA rekom binan t ersebut sebelum dibunuh dan dilisis.
Molekul- m olekul yang infekt if dilepas, m enginfeksi sel- sel t erdekat , dan proses it u diulang. Ak ibat ny a segara nam pak pada m at a dengan m at a t elanj ang sebagai zona at au plak sik ular y ang j ernih pada “ padang” sel- sel . set iap plak m erupak an suat u “ flon” m olek ul- m olek ul DNA dan dapat diriak k an secara t ak t erbat as dengan m eninfeksi lebih banyak sel ekoli.
Kini m asalahny a adalah salah sat u t em uan dari sat u at au lebih plag ( m ungk in dari beberapa ribu ) y ang m engandung gen eduk ariot ik y ang m enarik perhat ian k it a. Unt uk ini diperlukan suat u “ t olok” . Misalnya kit ya m encari DNA kelinci yang m enj adikan lant ai- lant ai hem oklobinnya. Sebagaim ana kit a ket ahui, RNA pesuruh unt uk rant ai- rant ai ini dapat diisolasi dari prekursor sel- sel darah m erah kelinci. Pesuruh- pesurh ini dapat diisolasi dari prekursor dan dapat diberi label isot op radio akt if dan digunakan unt uk m encari plak- plak yang m engandung rangkaian DNA pelengkap, yait u rangkaian DNA yang dari pada pesuruh- pesuruh hem oglobin ini dit ranskripsi. I nilah prosedurny a, sehelai k ert as saring y ang dibuat dari nit ro selulosa secara perlahan dit ek an pada perm uk aan lem pengan agar y ang berplak . Beberapa dari DNA pada set iap plak diserap oleh k ert as saring t adi. DNA y ang t erserat it u k em udian diubah sifat ny a m enj adi pelay an t unggal, dan k ert as saring yang dicelupkan kedalm kedalam larut an yang berisikan m olekul- m olekul DNA rek om binan y ang m eny at ak an rangk aianny a y ang dicari it u. Karena plak - plak asal t idak m enj adi rusak karena prosedur ini, m aka m olekul- m olekul t am bahan sam pel khusus DNA rekom bianan it u dapat dibiakkan dalam sel- sel “ koli” t am bahan unt uk m em produksi sebanyak t urunan sam pelnya yang diinginkan.
Maka inilah sat u cara ( nam un bukan sat u- sat unya cara) unt uk m encapai t uj uan t erdekat nya yait u sam pel m urni suat u gen eukariot ik. Prosesnya m ungkin t anpak rum it , t et api sungguh sangat langsung dan ak hirny a t uj uan dapat diacapai. 2.3. Pengklonan I ndividu Krom osom
karena sekarang t erdapat kem ungkinan unt uk m enyort ir krom osom -krom osom m anusia secara fisik kedalam klas- klas ukurang yang t erpisah dengan suat u prosedur yang dikenal sebagai sort asi sel yang t erakt ifasi fluoresens ( FACS : fluoresende- act iva- t ed celsort ing) . Maka t erbukt i kem ungkinan unt uk m engkon DNA dari individu krom osom . Misalnya, m ulai dengan suat u galur sel m anusia dengan kariot ip yang abnorm al ( em pat krom osom X) t erdapat kem ungkinan m ensort ir cukup bany ak k rom osom X m anusia y ang bebas dari aut osom unt uk dapat m em buat suat u perpust ak aan fag X dari DNA k rom osom X it u. Bersam a- sam a, pag- pag rek om binan dalam perpust ak aan it u m em puny ai sebagian besar, j ik a t idak dapat dik at ak an sem ua, DNA krom osom X.
Maka dari it u sem ua t ehnik yang t elah dilukiskan dari it u sem ua t ehnik yang diluk iskan sebelum ny a dapat digunak an unt uk m enganalisis DNA k rom osom X, m em et akan t em pat - t em pat rest riksi, m engident ifikasi rangkaian- rangkaian alu yang berulang, dan m ancari gen- gen y ang dik et ahui ak an t erbaw a pada k rom osom X t ersebut . Sat u t ugas y ang sek arang dapat dilak uk an adalah m encari polim orpism e t em pat rest riksi unt uk m enent ukan adakah yang t erapuaut erat dengan salah sat u pem y ak it genet ik y ang t erpet a k adar k rom os X. j ik a, m isalny a dapat dit unj uk k an bahw a suat u pola t ert ent u dari t em pat - t em pat enzim rest rik si t erpaut erat pada dist ropi ot ot Duchenne dan t idak t erdapat pada indiv idu- individu norm al, m ak a da kem ungkinan besar unt uk m endiagnosis penyakit , genet ik yang um um dan let al ini, bahk an sebelum k it a m enget ahui gent erm ut asi dim ana y ang bert anggung j aw ab unt uk hal it u.
2 .4 . Pe n gk lon a n On k oge n M a n u sia
( paru- paru) t erbuk t i lebih suk ar m encapai, k arena ia t eralu besar unt uk dik lon dalam sepot ong fag. 35 m acam fag, yang m asing- m asing m engandung rangkaian-rangkaian varsail yang t um pang t indih, m ula- m ula diisolasi lalu dianalisis dengan m enggunakan t ehnik- t ehnik penyaring Alu dan hom ologi pada rangkaian gen ras v irus sarcom a Kirst en, prosedur gen ini berkem bang y ang k em udian digunak an unt uk m enent ukan st rukt ur gen 45 kb.
Meskipun variasi ukurannya besar, nam un gen- gen kanker kandung kem ih, neuroblast om a, dan kanker kolon ( paru- paru ) m em punyai susunan dasar exonint ron yang sam a, dengan em pat exon yang digunakan unt uk m engklode prot ein y ang serupa t et api berlainan dengan berat m olek ul m asing- m asing sek it ar 21.000 ( p21) . Prot ein- prot ein p21 it u dit em uk an t erik at dalam j um lah k ecil pada m em bran plsm a luar sel- sel kanker, dan m ereka secara hom olog erat dengan produk dari gen- gen k ank er y ang dit em uk an sebelum ny a pada ret rovirus onk ogen. Gen kanker kandung kem ih m anusia sangat serupa dengan ras onkogen virus sarkom a Harvey, sedangkan gen kanker paru- paru sangat m irip dengan ras onkogen virus sarkom i Kirst en. Sepert i onkogen- onkogen ret ro virus, gen- gen kanker m anusia ini m em punyai ekuivalen sel norm al m ereka, m em ang gen- gen kanker it u diduga berasal dari ekuivalen- ekuivalen sel norm al m ereka m elalui m ut asi yang dengan cara t ert ent u m em baw a onk ogen y ang pot ensial k epada produk - produk prot einny a.
Langkah ber ikut nya yang m asuk akal adalah m er angkai onkogen- onkogen m anusia m aupun ekuivalen- ekuivalen norm al m ereka.Hasil pert am a sem acam it u m enunj ukkan bahw a gen kanker pada sel- sel t arsinom a kandung kem ih m anusia berbeda dari im banganny a dalam sel- sel norm al dalam sat u m ut asi t it ik t unggal. Mut asi it u m engubah sisa glesin pada posisi 12 dalam produk prot ein norm al ( prot ein p12) m enj adi paling dalam prot ein sel- sel carcinom a t ersebut . Ak an t et api, pada saat ini belum ada buk t i bahw a perubahan sederhana ini m erupak an sat u- sat uny a penyebab carcinom a kandung kem ih, dan kit a j uga t idak m enget ahui peranan prot ein p12 it u dalam k eadaan norm al m aupun k eadaan m ut asi.
2 .5 Pe n gk lon a n h e w a n
Klon- klon yang dit angani oleh para ahli biologi m olekular, biasanya klon- klon dari bakt eri at au organism e lain, sel- sel dalam kult ur j aringan dan akhir- akhir ini m olekul- m olekul DNA. Para ahli t am an dan pem ulia t anam an sebaiknya, secara t erat ur m enangani dan m em produk si organism e- organism e t inggat lebih t inggi y ang diklon, t anam an- t anam an yang m ereka biakkan dengan pem angkasan, ent en, pem belahan um bi dan rhizom a ( ak ar rim ang) dan sebagainy a.
Tum buhan t inggi m em beri kem ungkinan unt uk reproduksi aseksual dan klon; unt uk bany ak spesies liar, pem biak an aseksual lebih pent ing daripada pem biak an seksual. Sebaiknya hew an- hew an t ingkat alam i t idak bereproduksi secara aseksual. Unt uk m engklon seekor binat ang perlu unt uk m engam bil nukleus dalam t elur yang t elah dibuahi, baik m elalui pem bedahan, m aupun m enonakt ifkannya secara t ot al dengan radiasi dan m enggant ikanny a dengan nuk leus y ang diam bil dari indiv idu lain. I ni m em erlukan t ransplankasi suat u nukleus ut uh yang t idak rusak dan m am pu unt uk berkem bang.
Dem ikianlah, nukleus- nukleus yang dicangkokkan dari sel- sel em brio kat ak y ang sangat m uda, y ang m asih t ot ipot en, dapat m elahirkan k at ak - k at ak dew asa. Sebaliknya, nukleus- nukleus yang dit ransplant asi dari kat ak ‘dew asa’ sam pai kini sekian j auh belum pernah m am pu m eningkat kan perkem bangan hew an dew asa ; proses perkem banganny a selalu gagal pada t ahap em brional at au larva t ert ent u.
m em anipulasi t elur- t elur m am alia t anpa m erusaknya. Pada t ahun 1981, serangkaian percobaan sem acam it u dengan t ik us, t elah dilaporkan, t et api belum diulangi dan diperbuat secara bebas. Sebelum m et ode- m et ode it u dapat direproduk si, m erek a t idak ak an m em beri sum bangan y ang berart i pada pengert ian k it a t ent ang perkem bangan m am alia.
Dalam m asa dekat hanya t erdapat kem ungkinan kecil bahw a t ransplant asi nukleus dicoba pada spesies m am alia lain. Jika efisiensi dan reproduksibilit asnya dapat dit ingk at k an, m ak a m ungk in m et ode it u ak an m endapat t em pat di bidang penangk aran hew an. Dalam t eori ia dapat dicoba pada t elur- t elur sel em brio m anusia, t et api unt uk alasan apa? Tidak ada penerapan prak t is. Dan perlu dit ekankan bahw a belum t erbukt i ada kem ungkinan bahw a dengan kat ak sekalipun unt uk m enghasilkan suat u individu dew asa yang diklon m elalui pencangkokan nuk leus sel dew asa k e dalam sebuah t elur. Kom plot an j ut aw an t ua golongan got hik yang m em buj uk para dokt er unt uk m engklon beberapa kopi dari dirinya sendiri dengan pencangkokan nukleus- nukleus selnya kedalam t elur- t elur yang dibuahi dan kem udian m enanam kannya pada w anit a, t et api m erupakan fant asi m urni, unt uk k at ak t ua sek ali pun, hal it u t idak dapat dilak uk an.
2 .6 Pe n gk lon a n H or m on Pe r t u m bu h a n M a n u sia
Produksi horm on pert um buhan m anusia dalam ‘E.coli’ m enarik perhat ian orang pada beberapa prilak u rek ay asa genet ik a. Horm on pert um buhan m anusia ( HGH= Hum an Grow t h Horm one) adalah suat u rant ai polipept ida t unggal y ang m em puny ai 191 asam am ino dan diproduk si dalam k elenj ar pit uit eria ( k elenj ar pada infundibulum ot ak) . Sepert i insulin, ia t idak t erglirosilasi. Horm on pert um buhan m engendalikan pert um buhan t ubuh k it a ; t ubuh k ecil orang k erdil disebabk an k arena kekurangan horm on pert um buhan.
Dengan m enggunakan kom binasi dari sint esis kim ia DNA dan sint esis enzim at ik cDNA, t elah diproduksi suat u rangkaian yang m engkode asam - asam am ino 1- 14 t elah disint esis secara k im ia.Langsung di depan k odon pert am a, dit am bahk an suat u t rio ( t riplet ) basa ( ATG) y ang m enspesifik asi asam am ino m et ionin.Bila perm ulaan dari gennya t elah disint esis secara kim ia unt uk m enj am in perm ulaan yang t epat dari prot einnya, m aka diperoleh suat u rangkaian DNA yang m engkode sisa dari rant ai polipept ida y ait u, residu asam am ino 25- 19,1 dengan m em buat k opi-k opi cDNA dari preparat - preparat nRNa darii sel- sel pit uit aria m anusia.
Kedua fragm en DNA ini k em udian dik onk an secara t erpisah. Fragm en-fragm en DNAnya dim urnikan kem bali dan disam bung m enj adi sat u unt uk m enghasilkan rangkaian DNA lengkap unt uk horm an pert um buhan m anusia m ulai dengan suat u prodon inisiat or y ait u m et ionin, diikut i oleh rangk aian unt uk 191 asam am ino dalam frot ein m asak, dan berakhai dengan sinyal unt uk m enghent ikan sint esisi frot ein. Kem udian “ gen” dim asukkan kedalam suat u fekt or ekspresi dan dim asukkan kedalam “ ekoli” diam an diarahkan unt uk m em baut pert um buhan m anusia.
V. PEN UTUP
Saat ini t elah dikem bangkan t ehnik- t ehnik m engisolasi gen t erpilih, yait u kloning dan m enenukan rangkaian neuklit idanya. Gen- gen enkariot ik dan j uga prikariot ik dapat dik lon dengan m eny isipk anny a dalam sepot ong DNA, y ang dapat di reflikasi dala inang bak t erinny a. Bak t eriopag dan flasm i m em bent uk “ DNA Rek om binan” y ait u dengan peleburan DANny a.
t ranslasi. Tehnik- t ehnik DNA rekom bianan ini sudah dieploit asi dalam pem buat an prot ein- prot ein m anusia yang berniai hanya oleh bakt eri dan kham ir. Ada j uga kem ungkinan bahw a t ehnik- t ehnik t ersebut pada akhirnya dapat m em ungkinkan unt uk m em perbaiki fungsi gen yang efekt if pada eukariot ik at au m em berikan fungsi-fungsi gen yang baru baginya.
D AFTAR PUSTAKA
1. Kim bal, John W. 1989. Biologi . Edisi k e lim a ce t a k a n k e du a . Penerbit Erlangga. Jak art a
2. Muham m ad, S.A. 1991. Pe n ga n t a r Klon in g Ge n a . Yay asan Esent ia Medica Yogy ak art a
3. Robert s, J.A. Fraser, Pam brey , Marcus E. 1995. Ge n e t ik a Ke dok t e r a n . Su a t u Pe n ga n t a r .Edisi k edelapan Cet ak an Pert am a Penerbit Buk u k edok eran ( EGC) Jakart a.
