Produksi dan Karakterisasi Enzim Arabinosa Isomerase dari Gen Bakteri Geobacillus stearothermophilus Lokal

(1)

ENZIM ARABINOSA ISOMERASE DARI GEN BAKTERI

PRODUKSI DAN KARAKTERISASI

ENZIM ARABINOSA ISOMERASE DARI GEN BAKTERI

Geobacillus stearothermophilus

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

SEKOLAH PASCASARJANA

ENZIM ARABINOSA ISOMERASE DARI GEN BAKTERI

YONI ATMA

BOGOR

2011

YONI ATMA

BOGOR

2011

ENZIM ARABINOSA ISOMERASE DARI GEN BAKTERI

LOKAL

(2)

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Produksi dan Karakterisasi Enzim Arabinosa Isomerase dari Gen Bakteri Geobacillus stearothermophilus Lokal adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan oleh penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka dibagian akhir tesis ini.

Bogor, Juli 2011

Yoni Atma

(3)

ABSTRACT

YONI ATMA. Production and Characterization of an Arabinose Isomerase from Gene of Geobacillus stearothermophilus Local Strain. Under direction of MAGGY T. SUHARTONO and BUDI SAKSONO.

Arabinose isomerase (AI) is an enzyme that catalyzes isomerization of galactose to tagatose. Besides being used as a low-calorie sweeteners, tagatose has been developed as a functional food because it provides many health benefits such as promoting of weight-loss, anti-halitosis, prebiotic, treating of obesity and reducing in symptoms associated with type 2 diabetes, hyperglycemia, anemia, and hemophilia. Thermostable AIs are potential for tagatose production. AI enzymes encoded by araA gene. The araA gene Geobacillus stearothermophilus

originated from Tanjung Api, Poso, Indonesia has been successfully cloned and exspressed at previously study in E. coli BL21 (DE3) pLysS. However expression level of AI still low by SDS-PAGE analysis. The E. coli BL21 was incubated in 37°C at 150 rpm. This research was conducted to optimize the araA gene expression. Result from this research showed that the medium tofu liquid waste consisting yeast extract 0.5% (TLW+YE) increased enzyme productivity. Optimation production was obtained by 16 hours induction. The purification was carried out with three steps of freeze-thaw at -70°C, heat treatment (60°C, 30 minutes) and DEAE ion exchange chromatography (elution buffer 0-1000 mM NaCl). The purified enzyme exhibited optimum activity at 60°C and pH 7. The AI activity in the presence of CaCl2 and MnCl2 was increased to 152% and 563% respectively. Heat stability of enzymes in the presence of CaCl2 and MnCl2 was increased. Half-life (t1/2) AI in the presence 1 mM of CaCl2 and MnCl2 was increased becomes 301 and 990 minutes respectively.

Keywords: arabinose isomerase, tagatose, araA gene, G. stearothermophilus,

(4)

RINGKASAN

YONI ATMA. Produksi dan Karakterisasi Enzim Arabinosa Isomerase dari Gen Bakteri Geobacillus stearothermophilus Lokal. Dibimbing oleh MAGGY T. SUHARTONO dan BUDI SAKSONO.

Enzim arabinosa isomerase (AI) dapat mengkatalisis secara revesible reaksi isomerisasi D-galaktosa menjadi D-tagatosa. Tagatosa telah digunakan sebagai pemanis rendah kalori (1,5 kkal/g) yang memiliki tingkat kemanisan 92% dibandingkan sukrosa. Tagatosa memberikan berbagai manfaat kesehatan diantaranya seperti menurunkan berat badan, prebiotik, anti-histolisis serta mereduksi sejumlah gejala yang berhubungan dengan diabetes tipe 2, hiperglikemia, obesitas, anemia dan hemophilia. Peran tagatosa sebagai antidiabetes akan bermanfaat sebagai gula alternatif di Indonesia, mengingat Indonesia menempati peringkat ke-4 dengan jumlah penderita diabetes terbesar di dunia.

Produksi tagatosa menggunakan katalis logam memiliki banyak kekurangan. Sedangkan penggunaan beberapa jenis enzim seperti sorbitol dehidrogenase, D-psicosa 3-epimerse, dan D-tagatosa 3-epimerase meskipun lebih ramah lingkungan dibandingkan katalis logam, akan tetapi 3 jenis enzim tersebut membutuhkan substrat yang sangat mahal. Oleh sebab itu, saat ini enzim paling banyak dicari untuk memproduksi tagatosa adalah enzim arabinosa isomerase (AI). Pembentukan tagatosa oleh enzim AI sangat efisien karena substrat yang dibutuhkan dan tahapan produksinya.

Studi produksi dan pencarian enzim AI termostabil lebih difokuskan, sebab konversi D-galaktosa menjadi D-tagatosa meningkat dengan peningkatan suhu (> 50ºC). Selain itu, enzim-enzim pangan yang bersifat termostabil juga menjadi semakin penting dalam dunia industri. Hal ini berkaitan dengan keuntungan yang akan diperoleh bila proses produksi dilakukan pada suhu tinggi. Produksi enzim AI pada bakteri dilakukan dengan menggunakan inang E. coli. Gen araA yang mengkode AI dikloning melalui plasmid ke bakteri E. coli BL21. E. coli

kemudian akan mengekspresikan atau menghasilkan AI setelah diberi senyawa penginduksi. Diantara beberapa bakteri temofilik yang telah diteliti, AI yang berasal dari bakteri G. stearothermophilus memiliki kemampuan tertinggi dalam menghasilkan tagatosa dan telah mendekati skala produksi komersial.

Kloning dan ekspresi gen araA dari G. stearothermophilus lokal asal Tanjung Api, Poso, Indonesia menggunakan inang E. coli BL21 pLysS pET21b telah dilakukan pada studi sebelumnya. Namun analisis dengan Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) menunjukkan tingkat ekspresi gen araA pada media ekspresi (fermentasi) Luria Bertani (LB) masih rendah. Ekspresi gen araA ini perlu ditingkatkan sehingga jumlah enzim AI yang dihasilkan optimal. Selain untuk meningkatkan produksi enzim, penelitian ini juga dilakukan untuk memurnikan enzim yang telah diperoleh dan menganalisis karakteristik enzim AI dari G. stearothermophilus lokal.

(5)

limbah cair tahu yang ditambahkan dengan 0.5% ekstrak khamir (m/v) (LCT+YE) dan diatur pH media LCT+YE tersebut sama dengan pH Luria Bertani (LB). Tingkat ekspresi enzim pada media LCT+YE dibandingkan dengan LB. Selanjutnya dilakukan optimasi produksi dengan lama waktu induksi pada medium ekspresi terpilih. Hasil yang optimal dikonfirmasi dengan SDS-PAGE (melalui ketebalan pita) dan aktivitas enzim. Hasil produksi yang paling optimal kemudian dipurifikasi dan dikarakterisasi.

Purifikasi dilakukan melalui 3 langkah secara kontinu, antara lain: 1) freeze-thaw dengan cara memasukkannya total suspensi sel pada freezer bersuhu -700C sampai membeku selama ± 30 menit dan mencairkannya kembali (freeze-thaw

dilakukan dengan 3 kali pengulangan), 2) heat treatment pada suhu 600C selama 30 menit, dan 3) kromatografi penukar ion dengan resin dietil amino etil (DEAE). Larutan NaCl dengan konsentrasi 0, 100, 300, 400, 500 dan 1000 mM digunakan sebagai garam pengelusi ketika purifikasi menggunakan kolom kromatografi dilakukan. Enzim murni yang diperoleh kemudian dikarakterisasi yang meliputi penentuan suhu dan pH optimum, logam aktivator, stabilitas panas serta waktu paruh enzim.

Analisis keberadaan enzim target dilakukan menggunakan SDS-PAGE. Metode Bradford digunakan untuk analisis protein atau enzim secara kuantitatif.

Bovine serum albumin (BSA) digunakan sebagai standar protein saat analisis dengan larutan Bradford. Enzim yang telah direaksikan dengan larutan Bradford dibiarkan selama 2-5 menit pada suhu 370C, kemudian absorbansinya diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm. Aktivitas enzim diukur dengan metode larutan pewarna sisten karbazol asam sulfat. Substrat galaktosa direaksikan dengan enzim, kemudian diinkubasi pada suhu 600C selama 60 menit. Setelah reaksi enzimatis dihentikan, kemudian diberi larutan pewarna sisten karbazol asam sulfat dan diinkubasi kembali pada suhu 600C selama 30 menit. Absorbansi warna diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 560 nm. Pada pengukuran aktivitas enzim, fruktosa digunakan sebagai standar produk yang telah terbentuk.

Dari analisis dengan SDS-PAGE disimpulkan bahwa medium ekpresi yang lebih baik untuk produksi enzim AI adalah LCT + YE. Media cair LB juga dapat digunakan sebagai medium ekspesi, akan tetapi pita enzim target yang dihasilkan sangat tipis dibandingkan dengan medium LCT + YE. Optimasi produksi enzim AI dengan mekanisme ekspresi terinduksi yang paling optimum adalah dengan lama waktu induksi 16 jam. Aktivitas total suspensi sel tertinggi terdapat pada lama waktu induksi 16 jam dan 20 jam. Tetapi induksi selama 16 jam memiliki aktivitas enzim pada bagian supernatant ke-2 yang lebih tinggi (±2000 U/ml) dibandingkan induksi jam ke-20 (±1500 U/ml). Bagian supernatan ke-2 merupakan bagian enzim pada sitosol yang larut dan memiliki aktivitas tinggi.

(6)

fraksi 50, 51 dan 52 antara lain secara berurutan adalah 345, 282 dan 364 U/mg. Kuantifikasi protein dengan metode Bradford juga mengkonfirmasikan bahwa protein hasil elusi kromatografi penukar ion lebih tinggi pada fraksi 50, 51 dan 52 dibandingkan fraksi lainnya.

Enzim AI murni memiliki aktivitas optimal pada suhu 600C dan pH 7. Enzim AI membutuhkan logam kalsium (Ca) dan mangan (Mn) untuk meningkatkan aktivitas dan stabilitas panasnya. Penambahan CaCl2 meningkatkan aktivitas relatif enzim AI dari G. stearothermophilus lokal hingga menjadi 154% pada konsentrasi 1 mM dan 130% pada konsentrasi 5 mM. Dan penambahan MnCl2 meningkatkan aktivitas relatif enzim hingga menjadi 525% pada konsentrasi 1 mM dan 560% pada konsentrasi 5 mM. Inkubasi pada suhu 65 0C selama 150 menit menurunkan aktivitas enzim AI murni tanpa penambahan logam hingga tersisa 43%. Sedangkan dengan penambahan 1 mM logam CaCl2 dan MnCl2, aktivitas enzim AI masih tersisa masing-masing 70% dan 91%. Pendugaan waktu paruh (t1/2) enzim AI hasil pemurnian dilakukan dengan penentuan nilai konstanta deaktivasi enzim (k) terlebih dahulu. t1/2 enzim tanpa logam pada suhu 65 0C adalah 136 menit. Dan dengan penambahan 1 mM CaCl2

dan MnCl2, t1/2 AI meningkat menjadi masing-masing 301 dan 990 menit.

Enzim AI dari beberapa bakteri termofilik yang telah diteliti tidak ada yang menunjukkan karakteristik yang 100% sama, meskipun enzim AI dihasilkan oleh gen yang sama (gen araA), namun genus, spesies, strain ataupun tempat isolasi bakteri yang berbeda dapat memberikan karakteristik yang berbeda pula. Waktu paruh enzim AI lokal pada suhu 65 0C dengan penambahan 1 mM MnCl2 jauh lebih lama dibandingkan beberapa enzim AI termostabil yang telah ada. Salah satu strategi peningkatan produksi tagatosa menggunakan enzim AI adalah mencari enzim dengan waktu paruh yang lama. Dari hasil penelitian ini juga dapat disimpulkan bahwa enzim AI dari G. stearothermophilus lokal dapat langsung diaplikasikan pada industri. Suhu yang direkomendasikan untuk aplikasi industri produksi tagatosa menggunakan enzim AI adalah 60-65ºC, karena pada suhu yang lebih tinggi akan menyebabkan terjadinya reaksi pengcoklatan.

Kata kunci: enzim arabinosa isomerase, tagatosa, gen araA,

(7)

© Hak cipta milik IPB, tahun 2011

Hak cipta dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB

(8)

Geobacillus stearothermophilus LOKAL

YONI ATMA

Tesis

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada

Program Studi Ilmu Pangan

(9)

(10)

HALAMAN PENGESAHAN

Judul Tesis : Produksi dan Karakterisasi Enzim Arabinosa Isomerase

dari Gen Bakteri Geobacillus stearothermophilus Lokal Nama Mahasiswa : Yoni Atma

NRP : F251090131

Program Mayor : Ilmu Pangan

Disetujui,

Komisi Pembimbing

Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono

Budi Saksono, M.Sc Ketua Anggota

Diketahui,

Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana Ilmu Pangan

Dr. Ir. Ratih Dewanti-Hariyadi, M.Sc Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Agr.Sc

(11)

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat

dan karunia-Nya sehingga penulisan tesis ini dapat diselesaikan. Judul tesis ini

adalah ”Produksi dan Karakterisasi Enzim Arabinosa Isomerase dari Gen Bakteri

Geobacillus stearothermophilus Lokal”

Terima kasih penulis ucapkan kepada para Orang Tua dan keluarga penulis

atas jasa-jasanya yang tidak akan pernah penulis lupakan. Kepada Prof Dr. Ir.

Maggy T. Suhartono selaku ketua komisi pembimbing yang telah memberikan

bimbingan, arahan, dukungan, semangat serta pelajaran tentang berbagai macam

hal sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis ini. Terima kasih juga

disampaikan kepada Budi Saksono, M.Sc selaku anggota komisi pembimbing atas

saran dan dana penelitiannya. Kepada Dr. Ir. Budiatman Setiawihardja, M.Sc

selaku dosen penguji dari Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, atas panduan

ilmu dan saran-sarannya.

Selain itu, terima kasih tidak lupa penulis sampaikan kepada staf peneliti

laboratorium CBRG dan Puslit Bioteknologi LIPI atas kerjasama dan diskusi yang

pernah diberikan. Juga pada rekan-rekan Ilmu Pangan (IPN) dan laboratorium

Mikrobiologi Biokimia PAU IPB.

Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari kesempurnaan. Oleh

karena itu, penulis mengharapkan saran dan kritik demi penyempurnaan pada

masa yang akan datang.

Akhirnya, semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

(12)

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jambi pada tanggal 17 Maret 1986 dari ayah Saibunnur (Almarhum) dan ibu Zaimon Lafmi. Penulis merupakan anak ke dua dari tiga bersaudara.

Tahun 2003 penulis lulus dari SMA Negeri 11 Kota Jambi dan pada tahun yang sama penulis diterima di Universitas Jambi melalui jalur PKPM (Pencarian Khusus Pemandu Minat). Penulis memilih program studi Teknologi Hasil Pertanian, Fakultas Pertanian. Pada tahun 2008 penulis memperoleh gelar Sarjana Teknologi Pertanian (S.TP) dari Universitas Jambi.

Tahun 2009 penulis melanjutkan kuliah di Sekolah Pascasarjana IPB. Penulis memilih mayor Ilmu Pangan (IPN). Penulis pernah menjadi Guru Les pada lembaga bimbingan belajar Ganesha Operation cabang Depok tahun 2009 dan Nurul Ilmi cabang Dramaga tahun 2010. Sebagai syarat untuk memperoleh gelar Master of Science (M.Si), penulis menyelesaikan tesisnya dengan judul ”Produksi dan Karakterisasi Enzim Arabinosa Isomerase dari Gen Bakteri

(13)

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR ISI……...………...……….... i

DAFTAR TABEL………...………... iii

DAFTAR GAMBAR…….……… iv

DAFTAR LAMPIRAN………….………. v

PENDAHULUAN Latar Belakang………... 1

Tujuan Penelitian………... 4

Manfaat Penelitian………. 4

TINJAUAN PUSTAKA Enzim Arabinosa Isomerase………... 5

Tagatosa………... 7

Konsep DNA Rekombinan……… 10

Purifikasi dan Karakterisasi Enzim………... 14

Sodium Dedosil Sulfat Poliakrilamid Gel Elektroforesis (SDS-PAGE)….. 18

Pengukuran Konsentrasi Protein………... 19

METODOLOGI PENELITIAN Bahan dan Alat………... 21

Metode Penelitian………... 21

1. Produksi enzim……….………...………... 22

2. Purifikasi enzim………... 23

3. Karakterisasi enzim……….………... 24

Metode Analisis………. 27

1. Pengukuran absorbansi pada 600 nm……… 27

2. Elektroforesis SDS-PAGE………. 27

3. Pengukuran aktivitas enzim………. 28

4. Penentuan kadar protein (Bradford) ………... 29

5. Perhitungan aktivitas spesifik enzim……… 30

6. Penentuan waktu paruh enzim………. 30

(14)

Produksi Enzim Arabinosa Isomerase……… 32

Optimasi Produksi Enzim Dengan Lama Waktu Induksi………... 36

Purifikasi………. 40

Karakterisasi……… 46

1. Suhu optimum……….. 47

2. pH optimum………. 48

3. Pengaruh logam……… 50

4. Stabilitas panas………. 53

5. Pendugaan waktu paruh enzim.………... 55

KESIMPULAN DAN SARAN

DAFTAR PUSTAKA

LAMPIRAN

(15)

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1 Karakteristik fisik dan kimia tagatosa... 8

Tabel 2 Manfaat kesehatan dan aplikasi tagatosa pada produk pangan...

10

Tabel 3 Komposisi separating dan konsentrat (stacking) gel untuk SDS-PAGE ...

27

Tabel 4 Bahan-bahan untuk uji aktivitas enzim……… 28

Tabel 5 Larutan uji aktivitas………. 28

Tabel 6 Cara perhitungan aktivitas spesifik enzim……… 30

Tabel 7 Perhitungan konsentrasi protein (metode Bradford) dan aktivitas spesifik yang diberikan………..

46

Tabel 8 Karakteristik suhu dan pH optimum enzim AI dari beberapa bakteri termofilik………..

50

(16)

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1 Ilustrasi produksi tagatosa dari laktosa menggunakan katalis kalsium...

2

Gambar 2 Reaksi isomerisasi yang dikatalisis oleh enzim AI... 5

Gambar 3 Model molekul AI ketika mengikat galaktosa……… 6

Gambar 4 Perbandingan struktur molekul tagatosa dan fruktosa……… 7

Gambar 5 Salah satu mekanisme tagatosa sebagai produk antidiabetes dan hiperglikemia……….. 8

Gambar 6 Perbandingan respon glikemik tagatosa dengan beberapa pemanis………... 9

Gambar 7 Plasmid sebagai vektor ekspresi………. 11

Gambar 8 Peta plasmid pET-21b(+) secara garis besar……….. 12

Gambar 9 Mekanisme ekspresi gen target pada E. coli BL21 pLysS pET…… ……… 14

Gambar 10 Skema alur penelitian………. 26

Gambar 11 Perbandingan ekpresi enzim AI pada 2 jenis medium ekpresi berbeda……… 32

Gambar 12 Mekanisme ekspresi terinduksi IPTG pada inang E. coli BL21(DE3) dengan sistem pET……… 34

Gambar 13 Grafik optical density (kerapatan sel) dan aktivitas enzim yang dikoleksi dari kultur serta setelah induksi……….. 37

Gambar 14 SDS-PAGE hasil optimasi produksi enzim dengan lama waktu induksi……… 37

Gambar 15 Pengukuran kadar protein pada 280 nm terhadap enzim AI hasil kromatografi ion exchange dengan resin DEAE... 42

Gambar 16 SDS-PAGE enzim AI ekstrak kasar dan hasil purifikasi………... 43

Gambar 17 Pengukuran aktivitas terhadap enzim ekstrak kasar dan fraksi hasil kromatografi………... 44

Gambar 18 Pengukuran konsentrasi protein dengan metode Bradford terhadap enzim ekstrak kasar dan fraksi hasil purifikasi………… 45

Gambar 19 Suhu optimum enzim AI dari G. stearothermophilus lokal……... 47

Gambar 20 pH optimum enzim AI dari G. stearothermophilus lokal………... 49

Gambar 21 Pengaruh penambahan ion logam terhadap aktivitas enzim AI…. 52

Gambar 22 Stabilitas enzim AI pada suhu 65 0C tanpa dan dengan keberadaan logam………... 54

Gambar 23 Hubungan ln aktivitas enzim tanpa logam terhadap waktu inkubasi pada suhu 65 0C……… 55

Gambar 24 Hubungan ln aktivitas enzim dengan penambahan logam Ca terhadap waktu inkubasi pada suhu 65 0C ……… 56

(17)

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1 Data Optical Density (OD) pada 600 nm dari kultur bakteri pada saat kultur dilakukan dan induksi dimulai………..

66

Lampiran 2 Data pengukuran aktivitas enzim pada saat optimasi produksi 67

Lampiran 3 Data pengukuran protein terelusi hasil purifikasi dengan kolom penukar ion………. 70

Lampiran 4 Pengukuran aktivitas enzim hasil purifikasi……….. 71

Lampiran 5 Data perhitungan konsentrasi protein dengan metode Bradford 78

Lampiran 6 Data penentuan dan perhitungan suhu optimum ………... 82

Lampiran 7 Data penentuan dan perhitungan pH optimum ……….. 83

Lampiran 8 Data pengaruh penambahan logam………. 88

Lampiran 9 Data stabilitas panas enzim………. 92

(18)

PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG

Enzim arabinosa isomerase (AI) dapat mengkatalisis secara revesible reaksi isomerisasi D-galaktosa menjadi D-tagatosa (Lee et al 2004). Tagatosa telah

digunakan sebagai pemanis rendah kalori (1,5 kkal/g) (Levin 2002). Tagatosa

memiliki tingkat kemanisan 92% dibandingkan sukrosa (Lee et al 2004).

Tagatosa memberikan berbagai manfaat kesehatan diantaranya seperti

menurunkan berat badan, prebiotik, anti-histolisis (Oh 2007) serta mereduksi

sejumlah gejala yang berhubungan dengan diabetes tipe 2, hiperglikemia,

obesitas, anemia dan hemophilia (Levin 2002; Lu et al 2007). Peran tagatosa

sebagai antidiabetes akan bermanfaat sebagai gula alternatif di Indonesia,

mengingat Indonesia menempati peringkat ke-4 dengan jumlah penderita diabetes

terbesar di dunia (Wild et al 2004).

Produksi tagatosa dalam bentuk bulk sweeteners telah dilakukan pada skala industri secara kimiawi menggunakan katalis kalsium (Beadle et al 1991).

Tahapan-tahapan dan proses purifikasi yang kompleks, limbah kimia, serta

produk akhir lainnya yang dihasilkan yang bukan tagatosa (by-product) menyebabkan penggunaan katalis kimia mulai ditinggalkan. Alternatif yang saat

ini banyak digunakan adalah menggunakan katalis biologis seperti enzim. Sorbitol

dehidrogenase dari sejumlah mikroorganisme awalnya dipelajari untuk

memproduksi D-tagatosa dari galaktitol. D-psicosa 3-epimerse dari

Agrobacterium tumefaciens dan D-tagatosa 3-epimerase dari Pseudomonas cichorii ternyata diketahui dapat membentuk tagatosa dari D-sorbosa. Namun substrat galaktitol ataupun D-sorbosa yang mahal menyebabkan pengembangan

enzim ini tidak efisien (Oh 2007).

Enzim yang saat ini paling banyak dicari untuk memproduksi tagatosa

adalah enzim arabinosa isomerase (AI). Pembentukan tagatosa dari galaktosa ini

sangat efisien karena substrat yang dibutuhkan dan tahapan produksinya. Studi

produksi dan pencarian enzim AI termostabil lebih difokuskan, sebab konversi

D-galaktosa menjadi D-tagatosa meningkat dengan peningkatan suhu (> 50ºC)

(19)

menjadi semakin penting dalam dunia industri. Hal ini berkaitan dengan

keuntungan yang akan diperoleh bila proses produksi dilakukan pada suhu tinggi,

diantaranya adalah mengurangi kontaminasi, meningkatkan kecepatan reaksi

sehingga menghemat waktu, tenaga dan biaya, serta menurunkan viskositas

larutan fermentasi sehingga memudahkan proses produksi. Suhu yang

direkomendasikan untuk aplikasi industri produksi tagatosa menggunakan enzim

AI adalah 60-65ºC, karena pada suhu yang lebih tinggi akan menyebabkan

terjadinya reaksi pengcoklatan (Cheng et al 2009).

Sejumlah bakteri termofilik penghasil enzim AI telah dilaporkan. Beberapa

diantaranya adalah Thermotoga neapolitana (Kim et al 2002), Thermus sp. (Kim et al 2003b), Thermoanaerobacter mathranii (Jorgensen et al 2004), Thermotoga maritima (Lee et al 2004), Geobacillus stearothermophilus T6 (Lee et al 2005a),

Alicyclobacillus acidocaldarius (Lee et al 2005b), Bacillus stearothermophilus

US100 (Rhimi & Bejar 2006), G. thermodenitrificans (Kim & Oh 2005), dan B. stearothermophilus IAM11001 (Cheng et al 2009). Produksi enzim AI yang berasal dari bakteri-bakteri termofilik tersebut diatas dilakukan dengan

menggunakan inang E. coli. Gen araA yang mengkode arabinosa isomerase (AI) dikloning melalui plasmid ke bakteri E. coli BL21. E. coli kemudian akan

(20)

mengekspresikan atau menghasilkan enzim AI setelah diberi senyawa

penginduksi. E. coli merupakan salah satu mikroorganisme yang banyak digunakan untuk produksi protein rekombinan karena alasan-alasan berikut: 1) E. coli dapat tumbuh dengan cepat, 2) suhu dan medium pertumbuhan lebih sederhana untuk mencapai massa sel yang tinggi, 3) karakteristik genetikanya

telah diketahui dengan baik, dan 4) E. coli memiliki vektor kloning yang lebih banyak (Baneyx 1999).

Diantara beberapa bakteri termofilik yang diteliti, saat ini enzim AI yang

berasal dari G. stearothermophilus (Gali152) memiliki kemampuan tertinggi dalam menghasilkan tagatosa dan produktivitasnya telah mendekati kriteria

produksi untuk skala komersial (Oh 2007). Kim et al (2003a) melaporkan bahwa

teknik imobilisasi enzim AI dari G. stearothermophilus (Gali152) dapat menghasilkan 230 g/liter tagatosa dari 500 gram/liter galaktosa dengan

produktivitas 319 g/liter per hari pada sistem batch. Sedangkan fermentasi dengan sistem kontinu menghasilkan 145 g/liter tagatosa dari 300 g/liter galaktosa dengan

produktivitas 1,296 g/liter per hari (Ryu et al 2003).

Fitriani dan Saksono (2010) telah melakukan kloning dan ekspresi gen araA dari strain lokal G. stearothermophilus asal Tanjung Api, Poso, Indonesia. Analisis DNA homologi yang telah dilakukan menunjukkan bahwa AI dari G. stearothermophilus lokal memiliki nilai kemiripan 98% dengan G. stearothermophilus T6, 97% dengan B. stearothermophilus US100 dan A.

acidocaldarius, 96% dengan Thermus sp., 95% dengan B. stearothermophilus

IAM11001, dan G. thermodentrificans. Namun analisis dengan Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) menunjukkan level ekspresi enzim AI tersebut pada media ekspresi (fermentasi) Luria Bertani (LB)

masih rendah. Ekspresi gen araA ini perlu ditingkatkan sehingga jumlah enzim AI yang dihasilkan optimal.

Meskipun penggunaan E. coli sebagai inang untuk memproduksi arabinosa isomerase memiliki keunggulan, akan tetapi tidak menjamin bahwa protein

rekombinan yang ditargetkan terekpresikan dalam jumlah tinggi dan aktif.

Apalagi suhu optimum bakteri asal berbeda dengan inang yang akan

(21)

protein ataupun enzim. Kesalahan dalam pelipatan protein dapat menyebabkan

peningkatan ekspresi protein rekombinan yang tidak larut (insoluble). Protein rekombinan yang tidak larut biasanya memiliki aktivitas yang rendah.

Peningkatan ekspresi protein rekombinan pada E.coli dapat dilakukan dengan modifikasi komponen medium ekspresi dan ini merupakan teknik yang paling

efisien (Blommel et al 2007). Lama waktu induksi juga mempengaruhi tingginya

ekpresi protein rekombinan pada bakteri E. coli (Donovan et al 1996; Azaman et al 2010). Penelitian yang telah dilakukan Putri (2010) menunjukkan bahwa

limbah cair tahu yang ditambahkan ekstrak khamir dapat digunakan sebagai

medium pertumbuhan E.coli rekombinan dan ekspresi protein rekombinannya. Penggunaan limbah cari tahu sebagai medium ekspresi mempermudah tahapan

pemisahan protein aktif dengan inclusion body (insoluble protein).

Selain untuk meningkatkan produksi enzim, penelitian ini juga dilakukan

untuk memurnikan enzim yang telah diperoleh dan mengetahui karakteristik

enzim AI dari G. stearothermophilus lokal. Karakteristik AI yang ingin diketahui mencakup suhu dan pH optimum, logam aktivator dan stabilitas panas. Penelitian

ini diharapkan dapat memperoleh enzim AI dari isolat lokal atau sumber daya

alam Indonesia yang telah terkarakterisasi. Enzim yang dihasilkan dapat

digunakan untuk memproduksi tagatosa. Karakteristik enzim AI dari strain lokal

ini dapat menjadi acuan untuk dibandingkan dengan enzim AI yang telah ada.

Serta apakah enzim bisa langsung diterapkan pada skala industri atau diperlukan

teknik lainnya untuk meningkatkan karakteristik enzim.

B. TUJUAN

Tujuan dilakukannya penelitian ini adalah untuk:

1. Optimasi produksi enzim AI yang berasal dari gen araA bakteri G. stearothermophilus asal Tanjung Api, Poso, Indonesia.

2. Purifikasi dan karakterisasi enzim AI yang telah dihasilkan.

C. MANFAAT

Manfaat jangka panjang yang diharapkan dari penelitian ini adalah

industrialisasi enzim AI. Selain itu, juga industrialisasi D-tagatosa sehingga bisa

(22)

TINJAUAN PUSTAKA

A. ENZIM ARABINOSA ISOMERASE

L-Arabinosa isomerase (AI) merupakan enzim intraseluler yang berdasarkan

klasifikasi enzim secara internasional atas reaksi yang dikatalisisnya diberi nomor

kode EC 5.3.1.4. Enzim AI dapat mengkatalisis secara revesible reaksi isomerisasi L-arabinosa menjadi L-ribulosa dan D-galaktosa menjadi D-tagatosa. Perubahan

L-arabinosa menjadi L-ribulosa terjadi secara in vivo, sedangkan perubahan D-galaktosa menjadi D-tagatosa dapat terjadi secara in vitro (Lee et al 2004).

Pada awalnya enzim AI diketahui karena kemampuan beberapa

mikroorganisme menggunakan L-arabinosa sebagai sumber karbon. L-arabinosa

akan dirubah menjadi D-selulosa-5-posfat yang merupakan reaksi intermediet

dalam jalur pentosa fosfat. Reaksi tahap pertama pada jalur tersebut adalah

terjadinya perubahan arabinosa menjadi L-ribulosa oleh enzim arabinosa

isomerase (AI). Kemampuan AI dalam mengkatalisis reaksi isomerisasi galaktosa

menjadi tagatosa dikarenakan kemiripan struktur konfigurasi antara galaktosa

dengan L-arabinosa (Yoon et al 2003). Karena dapat mengkatalisis reaksi

isomerisasi pada D-galaktosa, enzim AI sering juga disebut sebagai galaktosa

isomerase (Zang et al 2010).

(23)

Enzim AI dapat dihasilkan oleh mikroorganisme mesofilik dan termofilik.

Aerobacter aerogenes, Lactobacillus plantarum, L. gayonii, L. pentosus,L. sakei, E. coli, Mycobacterium smegmatis, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis dan

B. halodurans merupakan mikroorganisme mesofilik penghasil enzim AI yang telah diteliti. Sedangkan mikroorganisme termofilik penghasil enzim AI yang

sampai saat ini telah dipelajari antara lain seperti Thermus sp.

Thermoanaerobacter mathranii, Alicyclobacillus acidocaldarius, Thermotoga neapolitana, Thermotoga maritima,, Geobacillus stearothermophilus, G. thermodenitrificans dan Acidothermus cellulolytics (Zhang et al 2007; Prabhu et al 2008; Rhimi et al 2010).

Enzim AI dikodekan oleh gen araA yang terletak pada kompleks gen L-arabinosa. Gen araA terdiri dari sekitar 1494 – 1535 pasang basa (bp). Jumlah pasang basa yang dimiliki gen araA tergantung mikroorganisme asalnya. Gen

araA G. stearothermophilus strain lokal memiliki 1512 pasang basa (Fitriani & Saksono 2010). B. stearothermophilus US 100, G. stearothermophilus, dan G. thermodenitrificans mengekspresikan enzim AI yang berukuran 56 kDa (Rhimi & Bejar 2006; Kim & Oh 2005). Sebagian besar AI terdiri dari 4 (tetramer) struktur sekunder yang berbentuk alfa-heliks. Kecuali AI dari E. coli yang berupa hexamer

(Wallace et al 1978). Asam amino yang berada pada sisi aktif enzim AI adalah

asam glutamat pada posisi 305 dan 330. Sisi aktif AI akan mengikat substrat

arabinosa ataupun galaktosa untuk dikatalisis menjadi produk. Struktur AI pada

saat mengikat substrat galaktosa dapat dilihat pada gambar 3 dibawah ini.

(24)

Enzim AI dari bakteri termofilik memiliki pH optimum 7.0-8.5, dengan pH

isoelektrik sekitar 5.0-5.8 dan suhu optimum antara 60-90ºC. Sebagian besar

enzim AI membutuhkan ion logam Mn2+

dan Co2+ sebagai kofaktor. Penggunaan

Co2+ sebagai kofaktor untuk menghasilkan bahan pangan tidak direkomendasikan

karena bahaya kesehatan yang ditimbulkannya (Jorgensen et al 2004). Aktivitas

katalisis dan stabilitas beberapa enzim AI juga ada yang meningkat dengan

keberadaan ion Fe2+, Mg2+, dan Ca2+ (Oh 2007; Kim & Oh 2005). Tidak adanya

ion logam sebagai kofaktor menyebabkan aktifitas enzim AI lebih rendah (Lee et

al 2005a).

B. TAGATOSA

Tagatosa adalah monosakarida dengan rumus empiris C6H12O6 dan berat

molekulnya (Mr) 180,6. Tagatosa termasuk hekso-ketosa alami, akan tetapi jarang terdapat di alam. Tagatosa hanya ditemukan dalam jumlah sedikit pada beberapa

buah, produk susu dan cokelat. Tagatosa memiliki struktur molekul yang hampir

sama dengan fruktosa dan telah dikenal sebagai komponen yang aman digunakan

pada bahan pangan dan produk farmasi. Food and Drug Administration Amerika Serikat (U.S. FDA) telah menetapkan tagatosa sebagai GRAS (Generally Recognized As Safe) komponen (Levin 2002).

Suhu leleh dari tagatosa adalah 134ºC, dan stabil pada pH 2–7. Tagatosa

memiliki kelarutan yang tinggi [58% (w/w) pada 21 0C]. Karakter humektan tagatosa sama dengan sorbitol. Sifat higroskopis dari tagatosa lebih rendah jika

(25)

dibandingkan fruktosa. Viskositas tagatosa lebih rendah dibandingkan sukrosa

pada konsentrasi yang sama, akan tetapi sedikit lebih tinggi dibandingkan fruktosa

dan sorbitol. Pada suhu tinggi, reaksi Maillard dan karamelisasi oleh tagatosa akan memberikan warna coklat seperti yang dihasilkan oleh sukrosa (Levin 2002).

Tabel 1. Karakteristik fisik dan kimia tagatosa (Levin 2002; Skytte 2006)

Karakteristik Penjelasan

Nama umum D-Tagatosa, Tagatosa Sinonim D-lyxo-hexulose

Melting point 133-137ºC Bulk density (g/ml) 0.7-0.9

Optical rotation aD20= - 5ºC (c =1 dalam H2O)

Bentuk fisik Kristal

Nilai kalori < 1,5 kcal/g Odor, cooling effect dan

Karsinogenesitas

Tidak ada

Lu et al (2007) menyatakan bahwa tagatosa digunakan sebagai produk

antidiabetes dan pengendali obesitas. Tagatosa bisa meningkatkan high density lipoprotein (HDL) dan mencegah kanker kolon. Kemampuan tagatosa dalam mengendalikan gejala hiperglikemia dikarenakan tagatosa dapat menjadi inhibitor

bagi enzim maltase dan sukrase. Mekanisme tagatosa sebagai inhibitor enzim

maltase dan sukrase dapat dilihat pada gambar 5.

(26)

Konsumsi tagatosa tidak menyebabkan kerusakan gigi dan efek laktasif.

Tagatosa lambat diserap oleh saluran intestinal sehingga tidak berakibat pada

naiknya indeks glikemik secara cepat (Lu et al 2007). Gambar 6 memperlihatkan

perbandingan respon glikemik dari tagatosa dibandingkan pemanis lainnya.

Menurut Skytte (2006) hanya sekitar 25% tagatosa yang diserap pada usus halus,

sisanya 75% akan difermentasi dalam usus besar oleh mikroflora menjadi asam

lemak rantai pendek. Tagatosa dapat meningkatkan pertumbuhan Lactobacillus

dan bakteri asam laktat lainnya. Manfaat prebiotik tagatosa telah dipelajari pada

manusia dan hewan (Skytte 2006).

Gambar 6. Perbandingan respon glikemik tagatosa dengan beberapa pemanis (Skytte 2006)

Konsentrasi penggunaan tagatosa pada produk pangan bervariasi. Tagatosa

digunakan sebanyak 1% pada minuman diet berkarbonasi, 2% pada produk roti,

3% pada es krim dan 15% produk candies khusus untuk penderita diabetes (Dobbs & Bell 2010). Amerika Serikat, Korea, New Zeland dan Australia telah

(27)

Tabel 2. Manfaat kesehatan dan aplikasi tagatosa pada produk pangan (Oh 2007)

Manfaat kesehatan Jenis produk pangan

Rendah kalori Makanan rendah karbohidrat, sereal, minuman ringan dan health bars

No glycemic effect Diabetic food (tipe 2)

Anti halistosis Supplemen

Prebiotik Cokelat, candies, chewing gum

Flavor enhancement Yogurt, bakery, minuman susu dan

confectionary

C. KONSEP DNA REKOMBINAN

Prinsip teknologi rekombinasi DNA yaitu menggabungkan molekul fragmen

DNA atau gen dari organisme yang berbeda sehingga menghasilkan kombinasi

baru yang sebenarnya tidak terdapat secara alami (Glick & Pasternak 2003). DNA

dari manusia, hewan, tumbuhan dan mikroorganisme dapat direkombinasi. DNA

rekombinan buatan sangat berguna dalam penelitian genetika. Teknologi DNA

rekombinan terus mengembangkan metode untuk isolasi dan menyatukan gen

menjadi kombinasi baru.

Tahap awal dari rekombinasi adalah isolasi gen target. Isolasi gen dapat

dilakukan dengan 2 cara yakni pemotongan secara langsung dan isolasi mRNA

untuk persiapan cDNA. Enzim endonuklease restriksi digunakan untuk memotong untai DNA. Sedangkan DNA ligase berguna untuk menggabungkan fragmen-fragmen DNA. Apabila menggunakan metode isolasi mRNA, maka

harus berdasarkan prinsip reverse transcription dan memerlukan penyusunan DNA primer. Gen yang telah diperoleh kemudian disisipkan pada vektor

pembawa yang akan membawa gen ke dalam sel inang (host). Sel inang yang telah ditransformasi kemudian diseleksi dan digunakan ataupun dikembangkan

sebagai organisme penghasil DNA rekombinan (Lehninger 2004).

1. Plasmid

Cara insersi gen asing ke dalam sel inang pada teknik rekombinasi DNA

dapat dilakukan dengan plasmid, bakteriophage, cosmid dan kromosom buatan (Prescott 2002). Plasmid dan bakteriophage merupakan vektor yang paling banyak digunakan. Plasmid adalah DNA berbentuk lingkaran yang ditemukan

(28)

replikasi, transkripsi dan translasi secara terpisah, tetapi dalam waktu yang

bersamaan dengan kromosom. Plasmid memiliki sifat istimewa, sehingga sangat

bermanfaat dalam teknik rekayasa genetika. Plasmid dapat melewati sel, pindah

dari sel yang satu ke sel lainnya atau dari satu spesies bakteri ke spesies lainnya.

Penggabungan gen asing ke dalam plasmid dapat dilakukan dengan mudah. Selain

itu, plasmid dapat disisipi atau terkadang telah memiliki penanda seleksi (Tortora

et al 2010).

Plasmid juga bisa digunakan sebagai vektor ekspresi. Ekpresi adalah

perubahan fragmen DNA atau gen menjadi protein spesifik melalui tahap

transkripsi dan translasi. Untuk ekspresi, plasmid harus memiliki signal pemulai

tahapan transkripsi dan translasi yang diperlukan. Tingkat ekspresi gen yang

dikloning dikendalikan oleh sekuen promoter dan regulator yang terdapat pada

vektor ekpresi tersebut. Promoter dan regulator memberikan isyarat tempat

dimana RNA polimerase berikatan dan mulai melakukan proses transkripsi

(Lehninger 2004).

Pemakaian teknologi rekombinasi DNA dibidang produksi enzim secara

lebih spesifik dapat dilakukan dengan beberapa cara, salah satunya aplikasi gen

terpilih melalui plasmid. Pemindahan gen penyandi enzim suatu mikroba atau

organisme yang bersifat unggul ke dalam mikroba lain dapat dilakukan dengan

cara mengisolasi gen yang diinginkan. Kemudian memindahkan dan

mengintegrasikannya ke dalam plasmid tertentu. Selanjutnya dilakukan

amplifikasi gen yang diinginkan sehingga dapat meningkatkan produksi protein

(29)

2. Plasmid pET-21b(+) dan Inang E. coli BL21 (DE3) pLysS

Plasmid pET-21b(+) merupakan salah satu plasmid yang dirancang untuk

mengekspresikan gen target yang telah membawa situs pengikatan ribosom dan

kodon pemulai (start codon). pET-21b(+) berukuran 5442 bp dimana peta konstruksi sistem ekspresinya terdiri dari sebuah gen lacI yang mengkode protein represor, sebuah promoter T7 yang spesifik untuk hanya T7 RNA polimerase

(bukan bakteri RNA polimerase dan juga tidak terdapat dalam genom

prokariotik), operator lac (lac O) yang dapat menghalangi transkripsi, multiple cloning site (MCS), sebuah gen replikasi asli dari plasmid alaminya (pBR322 ORI), dan suatu gen resistensi ampisilin (Blaber 1998). Gambar 8 menampilkan

secara garis besar peta plasmid kontruksi pET-21b(+). Sistem pET memberikan

hasil ekspesi protein target yang tinggi dan sangat kuat dalam mengendalikan

ekpresi basal yang tidak diinginkan. Sistem pET plasmid yang berdasarkan T7

promoter merupakan yang paling tepat untuk kloning dan ekspresi DNA

rekombinan di dalam E. coli (Studier & Moffatt 1986; Novagen 1999).

Gambar 8. Peta plasmid pET-21b(+) secara garis besar

Bakteri E. coli BL21 (DE3) pLysS mempunyai stabilitas yang tinggi dalam ekspresi protein. Inang ekspresi ini membawa gen T7 RNA polimerase

dibawah kontrol promoter lacUV5. E. coli BL21 memiliki plasmid pLysS, plasmid ini akan mengkode sejumlah kecil lisosim T7 yang mempunyai kontrol

(30)

Plasmid pLysS mempunyai sedikit inhibisi terhadap T7 RNA polimerase sehingga

perlu diinduksi oleh _{isopropyl-ß -D-thiogalactopyranoside}_{(IPTG). IPTG} menginduksi T7 RNA polimerase dengan promoter lacUV5 sehingga ekspresi protein rekombinan dapat maksimal (Sambrook & Russell 2001).

3. Mekanisme Ekspresi Gen Target pada Kombinasi Plasmid pET-21b dan

E. coli BL21

Ekpresi protein pada sistem pET21b(+) dan inang E. coli BL21 merupakan sistem operon indusibel yang sangat kompleks. Operon adalah kelompok gen

yang diatur secara terkoordinasi dengan fungsi yang saling terkait. Operon terdiri

dari promoter, operator, kompleks gen penyandi protein fungsional dan gen

pengkode represor yang berada pada bagian terluar dari operon. Promoter

berfungsi sebagai tempat RNA polimerase mengawali proses transkripsi. Operator

sebagai saklar yang akan menentukan perlu atau tidaknya ekspresi suatu protein

atau peptida pada operon. Saklar operator akan aktif apabila represor terlepas dari

operator (Campbell et al 2003).

Plasmid pET21b yang telah mengandung gen target pada posisi hilir dari

T7 promoter dimasukkan ke dalam inang E. coli BL21. E. coli BL21 telah mengandung gen T7 faga yang akan menghasilkan T7 RNA polimerase. T7 RNA

polimerase ini hanya bekerja dan memulai transkripsi pada situs promoter T7

(yang dalam hal ini terdapat pada plasmid pET21b[+]). Pembentukan T7 RNA

polimerase diatur melalui operon tersendiri yang telah dikonstruksi pada genom

E. coli BL21 (Sambrook & Russell 2001).

Penambahan senyawa IPTG akan menyebabkan represor tidak dapat

menginkatifkan operator yang awalnya memblok proses transkripsi, sehingga T7

RNA polimerase dihasilkan yang selanjutnya memulai tahapan transkripsi pada

T7 promoter gen target. Karena T7 merupakan promoter dari virus, maka gen

target akan ditranskripsikan secara cepat selama RNA polimerase ada (Sambrook

& Russell 2001). Ekspresi gen target akan naik secara cepat sebagaimana jumlah

mRNA yang ditranskripsikan juga meningkat. Mekanisme pada plasmid ini

(31)

[image:31.595.39.522.86.632.2]

Gambar 9. Mekanisme ekspresi gen target pada E. coli BL21 (DE3) pLysS pET21b(+) araA (Sambrook & Russell 2001).

D. PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI ENZIM

Isolasi dan pemurnian enzim intraseluler mikrobial dapat dilakukan dengan

cara pemecahan dinding sel. Pemecahan dinding sel bisa secara mekanis dan non

mekanis. Teknik freeze-thaw merupakan teknik pemecahan dinding sel non mekanis dengan manipulasi lingkungan. Freeze-thaw dapat memisahkan protein target dari protein membran dan inclusion bodies. Perlakuan pembekuan dan pencairan sel secara cepat akan mengakibatkan rusaknya dinding sel.

Pembentukan kristal es merupakan faktor utama penyebab kerusakan ini. Yang

perlu diperhatikan dalam proses pemecahan sel melalui cara freeze-thaw adalah penggunaan suhu dibawah -20ºC, perlakuan yang cepat dan sistem pelarut sel.

Pada proses penghancuran ditambahkan buffer atau cairan sehingga memudahkan

proses ekstraksi (Suhartono, 1989).

Pemisahan partikel dari cairan termasuk bagian penting operasi dalam

isolasi enzim. Pemisahan dilakukan untuk memisahkan sel dari cairan kultur dan

penggumpalan presipitat enzim. Enzim intraseluler yang telah dikeluarkan,

(32)

dipisahkan dari bagian sel dan dindingnya dengan proses sentrifugasi. Pemisahan

dengan sentrifugasi merupakan sistem pemisahan berdasarkan berat. Partikel

dengan berat yang berbeda akan mengendap pada kecepatan yang berbeda. Proses

sentrifugasi pada enzim sebagian besar dilakukan pada suhu rendah, sehingga

kehilangan aktivitas enzim dapat dijaga seminimal mungkin (Suhartono, 1989).

Pemurnian atau purifikasi enzim adalah memisahkan enzim target dari

selainnya. Tujuan pemurnian enzim adalah mendapatkan enzim target dalam

keadaan murni. Untuk enzim termofolik, pemurnian dengan perlakuan panas

sering kali dilakukan. Dengan perlakuan panas akan memisahkan enzim yang

tahan panas dari protein lain yang tidak tahan panas. Hal penting yang harus

diperhatikan dalam merencanakan tahapan pemurnian yaitu mempertahankan

aktivitas enzim atau mengurangi proteolisis dan denaturasi aktivitas enzim murni

serta menentukan jumlah enzim yang dibutuhkan. Enzim yang kasar dan murni

dapat digunakan untuk tujuan komersial. Sedangkan untuk keperluan

laboratorium diperlukan enzim murni (Harris 1989).

Pemurnian enzim seringkali menggunakan kolom kromatografi. Terdapat 5

teknik kromatografi kolom yang sering digunakan antara lain seperti:

kromatografi pertukaran ion, kromatografi gel filtrasi, kromatografi afinitas,

kromatografi interaksi hidrofobik dan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC)

(Sheehan 2009). Kromatografi penukar ion memanfaatkan perbedaan afinitas

antara molekul bermuatan di dalam larutan dengan senyawa yang tidak reaktif

yang bermuatan berlawanan sebagai pengisi kolom. Golongan senyawa ini

merupakan polimer terhidratasi yang bersifat tidak larut seperti selulosa, dekstran

dan agarosa. Gugus penukar ion diimobilisasikan pada matriks. Matriks selulosa

biasanya digunakan untuk memisahkan protein (termasuk enzim), polisakarida

dan asam nukleat. Beberapa gugus penukar anion yaitu aminoetil (AE-) kuntenari

aminoetil (QAE-) dan dietil aminoetil (DEAE-), sedangkan gugus penukar kation

yaitu sulfopropil (SP-), metil sulfonat dan karboksimetil (CM-) (Widyastuti

2007).

Kromatografi penukar ion dilakukan dengan mengelusi protein enzim

menggunakan buffer awal yang telah diatur. Protein enzim yang diharapkan

(33)

kekuatan ionik pelarut (Phage & Thorpe 2009). Molekul enzim atau protein terdiri

atas muatan positif dan negatif tergantung pada rantai samping asam amino asam

dan basa. pH pada kondisi jumlah muatan positif dan muatan negatif sama disebut

titik isoelektrik (pI). pI sebagian besar protein berkisar antara pH 5 dan 9. Protein

yang berada pada kondisi pH diatas pI akan bermuatan negatif, dan apabila pH

dibawah pI akan bermuatan positif (Lehninger 2004). Karboksimetil selulosa

(CMC) dan dietilaminoetil (DEAE) selulosa merupakan penukar ion yang banyak

dipakai untuk keperluan fraksinasi enzim. Apabila kondisi elusi dapat dijaga

dengan hati-hati, tingkat kemurnian yang tinggi seringkali dapat dicapai.

Agar enzim dapat bekerja secara optimal, perlu diketahui karakteristik

biokimiawi enzim, seperti suhu dan pH optimum, pengaruh ion logam, stabilitas

panas dan lainnya. Kondisi lingkungan harus menunjang kondisi yang dibutuhkan

enzim untuk dapat berfungsi sebagai katalis suatu reaksi (Buchholz et al 2005).

Enzim adalah suatu protein, maka kenaikan suhu dapat menyebabkan

terjadinya denaturasi. Apabila terjadi proses denaturasi, maka bagian aktif enzim

akan terganggu dan dengan demikian konsentrasi efektif enzim akan berkurang

dan kecepatan reaksinya juga akan menurun. Kenaikan suhu sebelum terjadinya

proses denaturasi dapat menaikkan kecepatan reaksi, akan tetapi kenaikan suhu

pada saat mulai terjadinya proses denaturasi akan mengurangi kecepatan reaksi.

Peningkatan suhu tertentu menyebabkan semakin meningkatnya aktivitas katalitik

enzim tetapi juga semakin bertambahnya kerusakan enzim (Illanes 2008).

Struktur protein menentukan aktivitas enzim, jika strukturnya terganggu

maka aktivitasnya akan berubah pula. Kenaikan suhu sampai batas tertentu dalam

suatu reaksi menyebabkan peningkatan kecepatan reaksi karena bertambahnya

energi kinetik yang mempercepat gerak vibrasi, translasi dan rotasi enzim dan

substrat sehingga memperbesar peluang keduanya untuk bereaksi. Pada suhu yang

lebih besar dari batas reaksi, protein enzim dapat mengalami perubahan

konformasi yang bersifat detrimal yaitu berubahnya susunan tiga dimensi yang

khas dari rantai polipeptida. Hal yang sama juga dapat terjadi pada substrat yang

perubahan konformasinya dapat menyebabkan gugus reaktifnya akan mengalami

(34)

Seperti protein pada umumnya, struktur ion enzim tergantung pada pH

lingkungannya. Enzim dapat berbentuk ion positif, ion negatif atau ion bermuatan

ganda (zwitter ion). Dengan demikian perubahan pH lingkungan akan berpengaruh terhadap aktivitas bagian aktif enzim dalam bentuk kompleks enzim

substrat. Disamping pengaruh struktur ion pada enzim, pH rendah atau pH tinggi

dapat pula menyebabkan terjadinya proses denaturasi dan ini akan menyebabkan

menurunnya aktivitas enzim (Lehninger 2004)

Enzim memiliki pH optimum yang khas, yaitu pH yang menyebabkan

aktivitas maksimal. Profil aktivitas pH enzim menggambarkan pH pada saat

gugus pemberi atau penerima proton yang penting pada sisi katalitik enzim berada

dalam tingkat ionisasi yang diinginkan. Nilai pH optimum tidak perlu sama

dengan pH lingkungan normalnya, dengan pH yang mungkin sedikit berada diatas

atau dibawah pH optimum. Aktivitas katalitik enzim dalam sel mungkin diatur

sebagian oleh perubahan pada pH medium atau lingkungan (Lehninger 2004).

Banyak enzim yang memerlukan tambahan komponen kimia bagi

aktivitasnya. Komponen ini disebut dengan kofaktor. Kofaktor bisa berupa

molekul organik seperti ion Fe, Mn dan Zn atau mungkin juga molekul organik

kompleks yang disebut koenzim seperti tiamin pirofosfat, FAD serta koenzim A.

Beberapa enzim memerlukan satu atau lebih kofaktor dan koenzim bagi

aktivitasnya. Pada beberapa enzim, koenzim atau ion logam hanya terikat secara

lemah atau dalam waktu sementara. Akan tetapi pada beberapa enzim lainnya

senyawa ini terikat kuat dan permanen. Dalam hal ini disebut gugus prostetik.

Enzim yang strukturnya sempurna dan aktif mengkatalisis bersama-sama dengan

koenzim atau gugus logam lainnya disebut holoenzim. Koenzim dan ion logam

bersifat stabil selama pemanasan, sedangkan bagian protein enzim yang disebut

apoenzim akan terdenaturasi oleh pemanasan (Illanes 2008).

Ion logam mempunyai peranan penting dalam menjaga kestabilan enzim.

Logam biasanya berperan sebagai pengatur aktivitas enzim. Ion logam dapat

mengaktifkan enzim melalui berbagai kemungkinan seperti : 1) menjaga bagian

internal enzim, 2) menghubungkan enzim dengan substrat 3) merubah konstanta

keseimbangan reaksi enzim 4) merubah tegangan permukaan reaksi enzim 5)

(35)

aktif enzim maupun substrat, dan 7) merubah konformasi enzim menjadi

konformasi yang lebih aktif (Whitaker et al 2003).

Beberapa jenis enzim mengandung ion logam yang telah terikat ataupun

memerlukan ion logam yang sengaja ditambahkan bagi aktivitasnya. Metaloenzim

mengandung ion logam fungsional dalam jumlah pasti, yang dipertahankan

selama proses pemurnian. Enzim yang diaktifkan oleh logam memperlihatkan

ikatan yang lebih lemah dengan logam, dan dengan demikian memerlukan logam

tambahan. Oleh karena itu, perbedaan metaloenzim dengan enzim yang diaktifkan

oleh logam terletak pada afinitas suatu enzim tertentu terhadap ion logamnya

(Bugg 2004).

Seperti halnya katalisator, enzim dapat mempercepat reaksi kimia dengan

menurunkan energi aktivasinya. Kemampuan enzim merubah substrat menjadi

produk disebut sebagai aktivitas enzim. Dengan persetujuan internasional, 1,0 unit

aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah yang menyebabkan pengubahan 1,0

mikromol (10-6

mol) substrat per menit pada keadaan pengukuran optimal.

Aktivitas spesifik adalah jumlah unit substrat yang dirubah per milligram enzim

(Lehninger 1982).

E. SODIUM DEDOSIL SULFAT POLIAKRILAMID GEL

ELEKTROFORESIS (SDS-PAGE)

Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) merupakan metode analisis protein secara kualitatif yang paling banyak

digunakan. Secara umum SDS-PAGE bermanfaat untuk menganalisis kemurnian

protein. Dan karena dapat memisahkan protein berdasarkan ukuran, maka metode

ini juga dapat digunakan untuk menentukan berat molekul relatif protein (Walker

2009). Elektroforesis adalah peristiwa perpindahan partikel-partikel bermuatan

karena pengaruh medan listrik. Pada tahapan SDS-PAGE, protein didenaturasi

menggunakan panas, ß-merkaptoetanol, dan SDS. Protein yang terdenaturasi akan

bereaksi dengan SDS yang merupakan deterjen anionik membentuk kompleks

yang bermuatan negatif. Protein dalam bentuk kompleks yang bermuatan negatif

ini akan dapat dipisahkan berdasarkan muatan dan ukurannya secara elektroforesis

(36)

bantuan protein standar (marker) yang telah diketahui berat molekulnya melalui

perbandingan nilai mobilitas relatif (Rf) (Lehninger 2004).

Gel poliakrilamid tersusun atas monomer monoakrilamid yang membentuk

ikatan silang dengan bantuan ammonium persulfat (APS) dan N,N,N,N -tetramethylethylenediamine (TEMED). Ukuran pori gel poliakrilamid bergantung pada konsentrasi akrilamid. SDS-PAGE terdiri dari 2 gel yaitu stacking gels dan

separating gels. Stacking gels memiliki kandungan akrilamid yang lebih rendah sehingga memiliki pori yang lebih besar. Stacking gels berfungsi sebagai media agar protein terdenaturasi yang telah bermuatan negatif bergabung atau

berasosiasi membentuk elips masuk kedalam separating gel. Separating gels yang memiliki pori yang lebih kecil kemudian akan memisahkan protein berdasarkan

ukuran. Protein yang berukuran lebih kecil akan lebih cepat melewati pori-pori

pada separating gels (Walker 2009).

SDS-PAGE dilakukan dengan posisi berdiri, dimana pada bagian bawah gel

diberi buffer anoda (bermuatan positif) dan dibagian atas gel diberi buffer katoda

(bermuatan negatif). Kompleks protein-SDS yang telah bermuatan negatif akan

bergerak melewati gel poliakrilamid menuju anoda dengan bantuan medan listrik

dan buffer elektroforesis. Laju pergerakan protein bergantung pada ukuran pori

dan kekuatan medan listrik. Setelah dilakukan elektroforesis, gel divisualisasi

dengan pewarnaan. Pewarnaan protein dalam gel dapat dilakukan dengan pewarna

Coomassie Brilliant Blue R-250 atau pewarna perak (silverstain). Dengan pewarnaan, protein dalam gel poliakrilamid akan terlihat membentuk band atau

pita yang terpisah berdasarkan ukurannya masing-masing (Walker 2009).

F. PENGUKURAN KONSENTRASI PROTEIN

Menurut Walker (2009), kuantifikasi protein dapat dilakukan dengan

beberapa metode diantaranya adalah dengan: 1) absorbansi dengan sinar

ultraviolet (UV absorption), 2) metode Lowry, 3) bicinchoninic acid (BCA) assay

dan 4) metode Bradford. Metode Bradford merupakan salah satu teknik penentuan

kadar protein yang berdasarkan pada pengikatan secara langsung zat warna

Coomassine Brilliant Blue G250 (CBBG) oleh protein pada kondisi pH asam. Grup trifenilmetana mengikat struktur non polar protein dan grup anion sulfonat

(37)

Jumlah CBBG yang terikat pada protein proporsional dengan muatan positif yang

ditemukan pada protein. Reagen CBBG bebas berwarna merah-kecoklatan

(panjang gelombang

maks 465 nm), sedangkan dalam suasana asam reagen CBBG akan berada dalam bentuk anion yang akan mengikat protein membentuk warna

biru (panjang gelombangmaks 595 nm). (Bradford 1976).

Pada metode Bradford, penentuan protein dapat dilakukan dengan cara

mikro untuk kandungan protein yang rendah dan makro untuk kandungan protein

yang tinggi. Standar konsentrasi protein yang sesuai adalah 10-100 µg.

Konsentrasi protein 0-10 µg biasanya digunakan dalam pengujian mikro dan

10-100 µg digunakan dalam pengujian makro. Karena lebih sederhana dan lebih

sensitif, metode ini adalah yang paling banyak digunakan untuk analisis protein

secara kuantitatif (Kruger 2009).

Hubungan absorbansi dan konsentrasi protein ditentukan melalui kurva

standar yang telah dibuat sebelumnya. Penetapan kurva standar dilakukan dengan

menggunakan protein tertentu seperti bovin serum albumin (BSA), dengan

berbagai konsentrasi. Besarnya konsentrasi BSA sebagai protein standar adalah

sekitar 150-750 µg/ml (Coligan et al 2004). Hubungan antara konsentrasi larutan

standar dan absorbansinya dinyatakan sebagai persamaan regresi linier: Y = a +

bx. Dalam analisis dengan metode bardford ini terdapat dua jenis metode yaitu

makro assay untuk konsentrasi protein tinggi dan mikro assay untuk konsentrasi

(38)

METODOLOGI PENELITIAN

A. BAHAN DAN ALAT

Inang atau bakteri penghasil enzim yang digunakan dalam penelitian ini

adalah E. coli BL21 (DE3) pLysS pET-21b yang telah ditransformasi dengan gen

araA dari bakteri Geobacillus sterothermophilus strain lokal asal Tanjung Api, Poso, Indonesia di laboratorioum Carbohydrate Bioengeenering Research Grup

(CBRG) Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI Cibinong.

Bahan kimia yang digunakan untuk produksi, purifikasi dan karakterisasi

enzim antara lain yeast extract, tripton, NaCl, limbah cair tahu, ampisilin, kloramfenikol, isopropylthiogalactoside (IPTG), Tris, HCl, gliserol, loading protein, sodium dedosil sulfat (SDS), ammonium persulfate (APS), akrilamid, N,N,N,N-tetramethylethylenediamine (TEMED), buffer elektroforesis, protein marker, coommasie blue, metanol, standar bovin serum albumin (BSA), fruktosa, galaktosa, karbazol, sistein, etanol, asam sulfat, Bradford reagent, resin dietilaminoetil (DEAE) sepharos, NaOH, sodium asetat, sodium fosfat,

MnCl2.4H2O, CaCl2.2H2O, akuades dan alkohol 70%.

Peralatan yang digunakan yakni laminar flow, sentrifus dingin, shaker

inkubator, lemari pendingin (suhu 4 0C), freezer (suhu -20 dan -70ºC), mikropipet, spektrofotometer, waterbath, vorteks, perangkat elektroforesis SDS-PAGE, hot plate, pH meter, kolom kromatografi buatan (1.5x8cm), pompa kromatografi,

effendof, kuvet, autoklaf, pipet Mohr, timbangan analitik dan alat-alat gelas.

B. METODE PENELITIAN

Penelitian dilakukan dengan 3 tahap yaitu produksi, purifikasi dan

karakterisasi. Penelitian diawali dengan produksi enzim menggunakan modifikasi

medium ekpresi dan kemudian optimalisasi dengan lama waktu induksi pada

medium ekspresi terpilih. Hasil yang optimal dikonfirmasi dengan SDS-PAGE

(melalui ketebalan pita) dan aktivitas enzim. Ketebalan pita dan aktivitas yang

tinggi pada supernatan dari presipitat diharapkan sehingga menunjukkan bahwa

(39)

1. Produksi Enzim

a. Persiapan medium (Shin et al 1997; Putri 2010)

Media Luria Bertani (LB) cair sebanyak 100 mL dibuat dengan komposisi

(m/v) 1% bacto-pepton , 1% NaCl, dan 0.5% ekstrak khamir. Limbah cair tahu (LCT) diatur pH-nya menjadi 6.71-6.73 kemudian ditambahkan ekstrak khamir

0.5 g per 100 mL (LCT+YE). Medium LCT dan LB disterilisasi pada temperatur

121ºC selama 15 menit.

b. Persiapan kultur E. coli transfroman

Untuk persiapan dan penyegaran, kultur E. coli transfroman sebanyak 20 µl ditumbuhkan dalam 2 ml media cair Luria Bertani (LB) yang mengandung 50

µg/ml ampisilin dan 50 µg/ml kloramfenikol. Selanjutnya diinkubasi selama 16

jam pada shaker inkubator (37ºC, 150 rpm). Setelah inkubasi, kultur sebanyak 800 µl dimasukkan ke dalam effendof dan ditambahkan 200 µl gliserol, kemudian

disimpan pada suhu -20ºC. Setiap satu bulan dilakukan penyegaran terhadap

kultur E. coli transforman.

c. Produksi enzim dengan membandingkan medium ekspresi standar dengan medium ekspresi yang dimodifikasi (Modifikasi Cheng et al 2009)

Kultur E. coli dengan umur 16 jam diinokulasikan masing-masing sebanyak 50 µl pada 5 ml medium cair LB dan medium LCT+YE. Kedua medium ekpresi

tersebut telah ditambahkan 50 µg/ml ampisilin dan 50 µg/ml kloramfenikol.

Selanjutnya kultur pada medium ekpresi diinkubasi pada shaker inkubator (37ºC, 150 rpm). Setelah optical density (OD) kedua medium mencapai 0.5-0.6 (pada panjang gelombang 600 nm) maka kedua medium masing-masing dibagi menjadi

2 bagian. Untuk memisahkan perlakuan induksi dan non induksi. Induksi

dilakukan dengan penambahan IPTG pada medium dengan konsentrasi akhir 1

mM, dan diinkubasi kembali selama 4 jam. Inkubasi atau waktu induksi

dihentikan dengan meletakkan medium pada cairan es. Setelah itu, sel pada

medium dipanen dengan setrifugasi pada kecepatan 11,000 rpm suhu 4ºC selama

15 menit. Supernatan 1 (S1) yang merupakan medium ekspresi dibuang,

sedangkan pellet 1 (P1) yang tertinggal ditambahkan dengan 500 µl (25%) buffer

(40)

campuran pellet dan buffer tersebut diambil dan disimpan pada lemari pendingin.

Campuran pellet 1 (P1) dan buffer ini disebut juga dengan total suspensi (T). Sisa

total suspensi (T) kemudian dipisahkan kembali untuk memperoleh supernatan 2

(S2) dan pellet 2 (P2) seperti yang akan dijelaskan pada tahapan purifikasi.

d. Optimasi produksi enzim pada medium ekpresi terpilih

Sebanyak 600 µl kultur E. coli transforman ditumbuhkan pada 60 ml medium ekpresi terpilih yang telah ditambahkan ampisilin dan kloramfenikol.

Setelah OD kultur mencapai 0.5-0.6, kemudian diinduksi dengan penambahan

IPTG (konsentrasi akhir IPTG pada medium = 1 mM). Sel dipanen setiap interval

0, 4, 8, 12, 16, 20 dan 24 jam setelah induksi. Pengambilan total suspensi sel

dilakukan dengan cara yang sama dengan yang telah diterangkan sebelumnya.

Setelah itu dilakukan pemisahan kembali dengan teknik freeze-thaw untuk mendapatkan supernatan 2 (S2) dan pellet 2 (P2). Penentuan keberadaan enzim

dilakukan dengan perangkat gel elektroforesis SDS-PAGE. Sedangkan aktivitas

enzim diukur pada panjang gelombang 560 nm.

2. Purifikasi

a. Freeze-thaw

Total suspensi sel (T) atau campuran P1 dan buffer diberi perlakuan freeze-thaw dengan cara memasukkannya pada freezer bersuhu -70 0

C sampai membeku

selama ± 30 menit dan mencairkannya kembali (freeze-thaw dilakukan dengan 3 kali pengulangan). Kemudian disentrifugasi pada kecepatan 11,000 rpm suhu 4 0C

selama 15 menit untuk memisahkan pellet 2 (P2) dan supernatan 2 (S2). Pellet 2

(P2) ditambahkan buffer Tris HCl pH 7.5, sedangkan supernatan 2 (S2)

dimurnikan lebih lanjut. Penentuan keberadaan enzim AI dilakukan menggunakan

SDS-PAGE. Dan penentuan konsentrasi protein pada S2 ditentukan dengan

metode Bradford. Sedangkan aktivitasnya diukur pada panjang gelombang=560

(41)

b. Heat treatment (Lee et al 2004)

Enzim dari supernatant 2 (S2) atau enzim ekstrak kasar (Crude Extract

[CE]) dipanaskan dengan waterbath pada suhu 60ºC selama 30 menit. Dengan perlakuan panas (heat treatment) akan mendenaturasi protein lain yang tidak tahan panas yang berikatan dengan enzim target. Setelah perlakuan heat treatment

kemudian disentrifugasi pada kecepatan 11,000 rpm suhu 4 ºC selama 15 menit.

Supernatan yang diperoleh diambil (S3), sedangkan pellet dibuang. Supernatan

tersebut (S3) dianalisis dengan SDS-PAGE, diukur aktivitasnya serta konsentrasi

proteinnya dengan metode Bradford.

c. Kromatografi penukar anion (Cheng et al 2009)

Pertama dilakukan bufferizing terhadap kolom kromatografi DEAE dengan buffer 10 mM Tris-HCl pH 7.5. Suspensi enzim L-arabinosa isomerase hasil heat treatment (S3) diaplikasikan ke dalam kolom kromatografi DEAE. Protein dielusi secara step wise menggunakan NaCl (0, 100, 300, 400, 500 mM dan 1 M) dalam Tris-HCl pH 7.5 dengan kecepatan aliran 1 mL/menit. Fraksi ditampung dalam

tabung yang berbeda masing-masing sebanyak 2 mL. Kandungan protein yang

terelusi masing-masing konsentrasi garam diukur dengan absorbansi sinar

ultraviolet (UV) pada panjang gelombang 280 nm. Sampel dengan nilai OD₂₈₀

tertinggi kemudian digunakan dalam elektroforesis SDS-PAGE. Protein yang

telah dipurifikasi disimpan pada temperatur 4°C untuk kemudian diuji aktifitasnya

dan dikarakterisasi.