EKSTRAKSI RUMPUT LAUT COKLAT Sargassum sp. (CP 01)
DAN PENGUJIAN EKSTRAK SEBAGAI
INHIBITOR TIROSINASE
ANASTASIA MENSANIE PUTRI
DEPARTEMEN TEKNOLOGI HASIL PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul Ekstraksi Rumput Laut Coklat Sargassum sp. (CP 01) dan Pengujian Ekstrak sebagai Inhibitor Tirosinase adalah benar merupakan hasil karya saya sendiri dengan arahan dosen pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Semua sumber data dan informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain yang telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, September 2014
ABSTRAK
ANASTASIA MENSANIE PUTRI. Ekstraksi Rumput Laut Coklat Sargassum sp. (CP 01) dan Pengujian Ekstrak sebagai Inhibitor Tirosinase. Dibimbing oleh LINAWATI HARDJITO.
Kulit gelap terjadi karena adanya pigmen melanin yang disebabkan oleh radiasi sinar ultraviolet dan enzim tirosinase. Jika jumlah melanin terbentuk berlebihan dapat menimbulkan hiperpigmentasi. Sargassum sp. adalah salah satu hasil perairan yang berpotensi sebagai inhibitor tirosinase dan dapat diaplikasikan ke dalam krim pencerah kulit. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan aktivitas inhibitor tirosinase dari ekstrak metanol Sargassum sp. (CP 01) dan menentukan komponen aktif dari ekstrak metanol Sargassum sp. (CP 01). Hasil penelitian menunjukkan ekstrak metanol Sargassum sp. (CP 01) memiliki aktivitas inhibitor tirosinase sebesar 27,50 ± 0,9 µg/ml pada substrat l-tyrosine dan pada substrat L-DOPA sebesar 209,06 ± 64,96 µg/ml. Komponen aktif yang terdapat dalam ekstrak metanol Sargassum sp. (CP 01) antara lain flavonoid, saponin, fenol, steroid, dan triterpenoid.
Kata kunci: ekstrak metanol Sargassum, inhibitor tirosinase
ABSTRACT
ANASTASIA MENSANIE PUTRI. Extraction of Brown Alga Sargassum sp. (CP 01) and Screening Extract as Tyrosinase Inhibitor. Supervised by LINAWATI HARDJITO.
Dark skin is caused by melanin pigments formed by UV radiation and tyrosinase. Excessive melanin formation results in skin hyperpigmentation. Sargassum sp. is one of marine resources that potentially contains tyrosinase inhibitor and can be applied into lightening cream. This study aimed to investigate the activity of Sargassum methanol extract as tyrosinase inhibitor and to determine the group of active compounds. The results showed that the methanol extract of Sargassum sp. described tyrosinase inhibitor at concentration of
27.50 ± 0.9 µg/ml and 209.06 ± 64.96 µg/ml for l-tyrosine and L-DOPA respectively. The methanol extract of Sargassum sp. contained flavonoids, saponins, phenols, steroids, and triterpenoids.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
EKSTRAKSI RUMPUT LAUT COKLAT Sargassum sp. (CP 01)
DAN PENGUJIAN EKSTRAK SEBAGAI
INHIBITOR TIROSINASE
ANASTASIA MENSANIE PUTRI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Perikanan pada
Departemen Teknologi Hasil Perairan
DEPARTEMEN TEKNOLOGI HASIL PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR
Judul Skripsi : Ekstraksi Rumput Laut Coklat Sargassum sp. (CP 01) dan Pengujian Ekstrak sebagai Inhibitor Tirosinase
Nama : Anastasia Mensanie Putri
NIM : C34100071
Program Studi : Teknologi Hasil Perairan
Disetujui oleh
Prof Dr Ir Linawati Hardjito, MS Pembimbing
Diketahui oleh
Prof Dr Ir Joko Santoso, MSi Ketua Departemen
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa karena atas berkat dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan penelitian ini dengan baik. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September 2013 hingga Februari 2014 dengan judul Ekstraksi Rumput Laut Coklat Sargassum sp. (CP 01) dan Pengujian Ekstrak sebagai Inhibitor Tirosinase. Penelitian ini dibiayai oleh DIKTI melalui program Hibah Kompetensi a.n. Prof Dr Ir Linawati Hardjito, MS.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu dalam penulisan karya ilmiah ini, terutama kepada:
1) Prof Dr Ir Linawati Hardjito, MS selaku dosen pembimbing atas segala bimbingan dan pengarahan yang diberikan kepada penulis.
2) Prof Dr Ir Joko Santoso, MSi selaku Ketua Departemen Teknologi Hasil Perairan.
3) Dra Ella Salamah, MSi selaku dosen penguji yang telah memberikan banyak masukan kepada penulis.
4) Papa Drs Bernard Manson Hutabarat, mama Esmi L. Tobing, abang Henrico Mensano Putra, S.Kom dan adik Mega Tri Novrianti tercinta yang telah memberikan segalanya kepada penulis.
5) Adel Christian Parentinus Sakeru atas bantuan, perhatian, dukungan, dan doa yang diberikan kepada penulis.
6) Bianca Benning, Emilia Dian, Zeta Fadilla, Siti Mayang Sari, Margareth Dina, Marie Violeta, Sri Wahyuningsih dan mbak Juju, atas segala bantuan, doa, dan dukungan yang telah diberikan.
7) Keluarga besar THP 47, P-FPIK, Komisi Kesenian, dan tim basket putri FPIK atas segala bantuan, doa, dan dukungan yang telah diberikan selama ini.
8) Serta semua pihak yang telah membantu dalam penulisan karya ilmiah ini, yang tidak dapat disebutkan satu persatu.
Kritik dan saran yang membangun sangat diharapkan untuk perbaikan di masa depan. Demikian skripsi ini disusun, semoga bermanfaat.
Bogor, September 2014
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL ... vi
DAFTAR GAMBAR ... vi
DAFTAR LAMPIRAN ... vi
PENDAHULUAN ... 1
Latar Belakang ... 1
Perumusan Masalah ... 2
Tujuan Penelitian ... 2
Manfaat Penelitian ... 3
Ruang Lingkup Penelitian ... 3
METODE PENELITIAN ... 3
Bahan Penelitian ... 3
Peralatan Penelitian ... 3
Prosedur Penelitian ... 4
Preparasi Bahan Baku ... 4
Ekstraksi Sargassum sp. (CP 01) ... 4
Analisis Aktivitas Inhibitor Tirosinase ... 5
Analisis Fitokimia ... 6
HASIL DAN PEMBAHASAN ... 7
Rendemen Ekstrak Sargassum sp. (CP 01) ... 7
Aktivitas Inhibitor Tirosinase Ekstrak Sargassum sp. (CP 01) ... 9
Komponen Aktif Ekstrak Sargassum sp. (CP 01) ... 10
KESIMPULAN DAN SARAN ... 12
Kesimpulan ... 12
Saran ... 12
DAFTAR PUSTAKA ... 12
LAMPIRAN ... 17
DAFTAR TABEL
1 Formulasi pengujian ekstrak sebagai inhibitor tirosinase ... 5
2 Nilai IC50 ekstrak Sargassum sp. (CP 01) dan kojic acid ... 9
3 Hasil analisis fitokimia ekstrak Sargassum sp. (CP 01)... 10
DAFTAR GAMBAR
1 Diagram alir prosedur penelitian ... 42 Pengenceran ekstrak untuk analisis inhibitor tirosinase ... 5
3 Ekstrak metanol Sargassum sp. (CP 01) ... 8
4 Sisi aktif enzim tirosinase ... 11
DAFTAR LAMPIRAN
1 Contoh perhitungan rendemen ekstrak Sargassum sp. (CP 01) ... 172 Perhitungan IC50 ekstrak Sargassum sp. (CP 01) pada substrat l-tyrosine ... 18
3 Perhitungan IC50 ekstrak Sargassum sp. (CP 01) pada substrat L-DOPA ... 20
4 Perhitungan IC50kojic acid pada substrat l-tyrosine ... 22
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Makroalga laut yang secara taksonomi diklasifikasikan sebagai alga, memiliki 4 kelas utama, yaitu Rhodophyceae (alga merah), Chlorophyceae (alga hijau), Chyanophyceae (alga hijau biru), dan Phaeophyceae (alga coklat) (Thomas dan Kim 2013). Alga coklat (Phaeophyceae) tersebar di beberapa bagian Asia, salah satunya Indonesia. Sargassum merupakan salah satu marga Sargassum termasuk dalam kelas Phaeophyceae (Kadi 2005). Jenis-jenis Sargassum sp. yang dikenal di Indonesia ada sekitar 12 spesies, yaitu Sargassum duplicatum, S. histrix, S. echinocarpum, S. gracilimun, S. obtusifolium, S. binderi, S. policystum, S. crassifolium, S. microphylum, S. aquofilum, S. vulgare, dan S. polyceratium. Sargassum biasanya dicirikan oleh tiga sifat yaitu adanya pigmen coklat yang menutupi warna hijau, hasil fotosintesis terhimpun dalam bentuk laminaran dan alginat serta adanya flagel (Anggadiredja et al. 2006). Sargassum mengandung bahan alginat dan iodin yang bermanfaat sebagai bahan industri makanan, farmasi, tekstil, dan kosmetik (Kadi 2005).
Kosmetik saat ini banyak digunakan manusia khususnya wanita untuk membuat penampilan terlihat lebih menarik dan mengatasi masalah estetika. Salah satu masalah estetika yang serius pada manusia adalah kulit gelap yang umumnya dialami ketika usia produktif dan usia lanjut. Pigmen melanin pada kulit manusia adalah suatu mekanisme pertahanan terhadap paparan sinar matahari (Jennifer et al. 2012). Hal ini perlu diperhatikan terutama di Indonesia yang merupakan negeri tropis yang kaya akan paparan sinar matahari. Paparan sinar matahari (sinar UV) dapat mengaktifkan hormon yang menstimulasi sintesis pigmen melanin dan menyebabkan warna kulit tampak lebih gelap (Winata 2008).
Melanin merupakan pigmen warna coklat yang dapat melindungi jaringan kulit dari penghamburan sinar ultra violet. Jika jumlah melanin terbentuk berlebihan dapat menimbulkan hiperpigmentasi. Pada manusia proses pembentukan melanin (melanogenesis) dapat terjadi dengan bantuan biokatalis (enzim) dan sinar UV matahari. Biokatalis yang berperan dalam reaksi pencoklatan adalah tirosinase, yang ditemukan pada hewan, tumbuhan dan manusia. Enzim ini mengkatalisis dua reaksi utama dalam biosintesis melanin, yaitu hidroksilasi l-tyrosine menjadi L-DOPA dan oksidasi L-DOPA menjadi dopakuinon (Chang2009).
2
asam askorbat, arbutin, kojic acid, merkuri dan hidrokuinon (Putri et al. 2010). Penggunaan merkuri dan hidrokuinon sebagai inhibitor tirosinase pada kosmetik memiliki efek samping yang bersifat negatif. Merkuri dapat menyebabkan alergi, iritasi kulit, kerusakan permanen pada susunan saraf, otak, ginjal, gangguan perkembangan janin dan bersifat karsinogenik. Hidrokuinon dapat menyebabkan iritasi kulit, kulit kemerahan, rasa terbakar, dan bercak-bercak hitam (BPOM 2013). Kojic acid adalah salah satu jenis pemutih yang banyak digunakan dalam kosmetik. Namun, penggunaan kojic acid sebagai lightening agent dapat menyebabkan alergi pada kulit manusia (Kamakshi 2012). Oleh karena itu, pencarian alternatif inhibitor tirosinase perlu dilakukan, salah satunya dengan mencari bahan aktif pencerah kulit yang alami dan berpotensi menjadi inhibitor tirosinase.
Salah satu hasil perairan yang berfungsi sebagai inhibitor tirosinase adalah rumput laut coklat (Kang et al. 2012). Salah satu alga coklat, Ecklonia stolonifera dilaporkan memiliki aktivitas dalam menghambat enzim tirosinase tiga kali lebih besar daripada kojic acid (Jenifer et al. 2012). Chan et al. (2011) juga melaporkan Sargassum polycistum yang diambil dari Pulau Seri Buat dan Pulau Sembulan, Malaysia dapat menghambat aktivitas selular tirosinase.
Komponen aktif pada rumput laut coklat yang berperan sebagai inhibitor tirosinase adalah flavonoid (Chang 2009). Komponen aktif rumput laut coklat diperoleh dengan cara ekstraksi. Ekstraksi adalah pemisahan satu atau beberapa bahan dari suatu padatan atau cairan dengan bantuan pelarut. Pemisahan terjadi atas dasar kemampuan larut yang berbeda dari komponen-komponen dalam campuran (Darmawan 2002). Informasi mengenai komponen aktif dari rumput laut coklat, termasuk mengenai inhibitor tirosinase masih sangat sedikit. Oleh karena itu, perlunya penelitian inhibitor tirosinase dari ekstrak Sargassum sp. agar dapat dimanfaatkan lebih lanjut dan dikembangkan untuk mencegah pembentukan melanin yang berlebihan.
Perumusan Masalah
Rumput laut coklat Sargassum sp. (CP 01) merupakan hasil perairan yang potensial di Indonesia, namun penelitian dan informasi mengenai komponen aktif yang terkandung di dalamnya masih sangat terbatas. Hal ini yang menyebabkan pemanfaatan rumput laut coklat Sargassum sp. (CP 01) dalam bidang bioteknologi masih sangat sedikit. Salah satu upaya pemanfaatan rumput laut coklat Sargassum sp. (CP 01) adalah sebagai inhibitor tirosinase yang dapat diaplikasikan ke dalam krim pencerah kulit. Informasi mengenai komponen aktif dari Sargassum sp. (CP 01) perlu diteliti lebih lanjut guna menemukan bahan baku alami yang memiliki aktivitas inhibitor tirosinase.
Tujuan Penelitian
3
Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini adalah dapat memberikan informasi mengenai aktivitas inhibitor tirosinase dan komponen aktif yang terkandung dalam ekstrak rumput laut coklat Sargassum sp. (CP 01).
Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup penelitian ini meliputi preparasi bahan baku, ekstraksi rumput laut coklat Sargassum sp. (CP 01), analisis aktivitas inhibitor tirosinase, analisis fitokimia, dan analisis data.
METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September 2013 sampai Februari 2014. Preparasi bahan baku, ekstraksi rumput laut coklat Sargassum sp. (CP 01), dan analisis aktivitas inhibitor tirosinase dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Analisis fitokimia dilakukan di Laboratorium Kimia Analitik, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Bahan Penelitian
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah rumput laut coklat Sargassum sp. (CP 01) yang diambil dari Cipatujah, Tasikmalaya, Jawa Barat. Bahan lain yang digunakan dalam ekstraksi Sargassum sp. (CP 01) adalah aluminium foil, kapas, kertas saring, dan pelarut metanol PA. Bahan-bahan yang digunakan dalam analisis aktivitas inhibitor tirosinase antara lain ekstrak Sargassum sp. (CP 01) aluminium foil, bufer fosfat pH 6,8, enzim tirosinase, l-tyrosine, L-DOPA, dan kojic acid. Bahan yang digunakan dalam analisis fitokimia yaitu, kertas saring, kloroform, NH4OH 2M, H2SO4, reagen Mayer, Wagner, Dragendroff, magnesium, alkohol klorhidrat, amil alkohol, FeCl3, etanol, eter, anhidrida asam asetat, dan H2SO4 pekat.
Peralatan Penelitian
4
spektrofotometer (UV-VIS Jenwey 2030). Alat yang digunakan dalam analisis fitokimia antara lain tabung reaksi, batang pengaduk, timbangan, lempeng tetes, pipet tetes, pinggan porselen, dan beaker glass.
Prosedur Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dalam beberapa tahap. Tahap pertama adalah preparasi bahan baku rumput laut coklat Sargassum sp. (CP 01). Tahap selanjutnya adalah sampel yang telah berbentuk serbuk diekstrak guna mendapatkan ekstrak yang digunakan dalam analisis aktivitas inhibitor tirosinase dan analisis fitokimia. Diagram alir prosedur penelitian disajikan dalam Gambar 1.
Gambar 1 Diagram alir prosedur penelitian.
Preparasi Bahan Baku
Sampel Sargassum sp. (CP 01) yang diambil dari Cipatujah, Jawa Barat dibawa ke laboratorium dengan menggunakan coolbox lalu dikeringkan secara manual dibawah sinar matahari. Sampel kering kemudian dipotong-potong dengan menggunakan gunting untuk mempermudah proses penghancuran. Potongan sampel kemudian dihaluskan dengan menggunakan grinder hingga sampel berukuran 60 mesh atau berbentuk serbuk.
Ekstraksi Sargassum sp. (CP 01) (Yuvaraj et al. 2011)
Ekstraksi Sargassum sp. (CP 01) dilakukan dengan dua ulangan yang masing-masing sampel berbentuk serbuk ditimbang sebanyak 20 dan 50 gram. Sampel kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer, diberi pelarut metanol PA
Sargassum sp. (CP 01) kering
Preparasi Bahan Baku
Ekstraksi Sargassum sp.
(CP 01)
Analisis Fitokimia Analisis Aktivitas Inhibitor
5
dengan perbandingan 1:10 serta ditutup dengan kapas dan aluminium foil. Selanjutnya sampel dimaserasi menggunakan magnetic stirrer selama 24 jam dengan suhu 37 oC. Hasil maserasi yang berupa larutan disaring dengan kertas saring sehingga didapat filtrat dan residu. Filtrat yang diperoleh kemudian dievaporasi menggunakan rotary vacuum evaporator dengan suhu 40-50 oC. Ekstrak yang diperoleh kemudian dikerok dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf. Rendemen ekstrak dihitung sebagai presentase bobot ekstrak yang didapat dari bobot sampel awal. Perhitungan rendemen ekstrak Sargassum sp. (CP 01) dilakukan dengan rumus berikut:
Rendemen (%) = Bobot ekstrak (gram)
Bobot sampel awal (gram)
x
100%Analisis Aktivitas Inhibitor Tirosinase
Aktivitas inhibitor tirosinase dari ekstrak Sargassum sp. (CP 01) ditentukan menggunakan metode yang dilaporkan Chan et al. (2011) dengan modifikasi pada konsentrasi sampel dan substrat. Aktivitas inhibitor tirosinase ditentukan dengan menggunakan substrat l-tyrosine dan L-DOPA. Analisis inhibitor tirosinase menggunakan ekstrak Sargassum sp. (CP 01) yang diencerkan dimulai dari konsentrasi 6,10 mg/ml pada substrat l-tyrosine dan 9,10 pada substrat L-DOPA. Pengenceran ekstrak untuk analisis inhibitor tirosinase dapat dilihat pada Gambar 2.
1 2 3 4 5 6 6,10 mg/ml 3,05 mg/ml 1,53 mg/ml 0,76 mg/ml 0,38 mg/ml kontrol 9,10 mg/ml 4,55 mg/ml 2,28 mg/ml 1,14 mg/ml 0,05 mg/ml kontrol
Gambar 2 Pengenceran ekstrak untuk analisis inhibitor tirosinase.
Analisis inhibitor tirosinase dilakukan dengan mempersiapkan enam tabung reaksi hasil pengenceran ekstrak dengan akuades. Enzim tirosinase (25.000 unit/ml) sebanyak 40 µ l juga diencerkan dengan menggunakan bufer fosfat pH 6,8 sebanyak 960 µ l. Analisis inhibitor tirosinase dilakukan dengan menggunakan hasil pengenceran ekstrak dari tabung 1-5, seperti pada Gambar 2 kemudian dimasukkan formula pada masing-masing tabung seperti pada Tabel 1. Tabel 1 Formulasi pengujian ekstrak sebagai inhibitor tirosinase
6
Setelah formulasi pada masing-masing tabung reaksi selesai, selanjutnya masing-masing tabung reaksi diinkubasi selama 10 menit. Sampel kemudian diukur nilai absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 475 nm (Bt0). Setelah itu, keenam tabung reaksi ditambahkan substrat l-tyrosine dengan konsentrasi 3,6 mg/10ml yang sebelumnya diencerkan dengan akuades atau L-DOPA dengan konsentrasi 3,3 mg/10ml yang sebelumnya diencerkan dengan bufer fosfat sebanyak 1 ml, lalu diinkubasi selama sepuluh menit. Keenam tabung reaksi kemudian diukur kembali nilai absorbansinya dengan spektrofotometer (Bt10) untuk menentukan persen inhibisi dan nilai konsentrasi hambat 50 % (IC50). Persen inhibisi dihitung dengan cara membandingkan absorbansi sampel dengan penambahan ekstrak (B) dan kontrol (A) pada panjang gelombang 475 nm. Persen inhibisi ekstrak Sargassum sp. (CP 01) dapat dihitung dengan rumus berikut:
Inhibisi (%) = (A t10− A t0) – (B t10− B t0)
(A t10− A t0) × 100%
Keterangan: At0 = nilai absorbasi kontrol pada t0 At10 = nilai absorbansi kontrol pada t10 Bt0 = nilai absorbansi sampel pada t0 Bt10 = nilai absorbansi sampel pada t10
Analisis Fitokimia (Harborne 1987) Uji Alkaloid
Ekstrak sampel dilarutkan dalam 10 ml kloroform dan beberapa tetes NH4OH. Larutan kemudian disaring, filtratnya dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 tetes H2SO4 2M lalu dikocok. Tabung reaksi didiamkan hingga terbentuk dua lapisan. Lapisan asam diambil dan dimasukkan ke dalam tiga tabung reaksi lainnya untuk diuji alkaloid menggunakan reagen Mayer, Wagner, dan Dragendroff. Hasil positif dari uji alkaloid dengan ketiga reagen ialah terbentuknya endapan berturut-turut berwarna coklat, putih, dan merah-jingga.
Uji Saponin dan Flavonoid
7
Uji Tanin dan Fenol
Ekstrak sampel ditambahkan 100 ml air panas lalu didihkan selama 5 menit. Larutan kemudian disaring dan filtratnya ditambahkan larutan FeCl3. Hasil positif tanin menunjukkan perubahan warna menjadi hitam kehijauan, sedangkan hasil positif fenol ditunjukkan dengan timbulnya warna ungu, biru atau hijau.
Uji Triterpenoid dan Steroid
Ekstrak sampel dilarutkan dengan 25 ml etanol panas (50 oC) kemudian disaring ke dalam pinggan porselen dan diuapkan sampai kering. Residu ditambahkan eter dan ekstrak eter dipindahkan ke lempeng tetes. Ekstrak eter
ditambah 3 tetes anhidrida asam asetat dan 1 tetes H2SO4 pekat (uji Lieberman-Buchard). Hasil positif triterpenoid ditunjukkan dengan adanya
perubahan warna menjadi merah sementara hasil positif steroid ditunjukkan dengan perubahan warna menjadi hijau atau biru.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Sargassum merupakan salah satu marga Sargassum yang termasuk dalam kelas Phaeophyceae. Sargassum tumbuh di perairan pada kedalaman 0,5-10 m ada arus dan ombak. Alga ini tumbuh sebagai makroalga bentik yang melekat pada substrat dasar perairan. Sargassum tumbuh berumpun dengan untaian cabang-cabang. Panjang thallus utama mencapai 1-3 m dan tiap-tiap percabangan terdapat gelembung udara berbentuk bulat yang disebut bladder berfungsi untuk menopang cabang-cabang thallus terapung ke arah permukaan air guna mendapatkan intensitas cahaya matahari. Sargassum memiliki kandungan bahan kimia utama yaitu alginat. Sargassum juga banyak mengandung protein, vitamin C, tanin, iodin, dan komponen fenolik (Kadi 2005). Sargassum memiliki efek biologis antara lain antitumor, antibakteri, antifungi dan antivirus (Marry et al. 2012). Sargassum juga memiliki aktivitas inhibitor tirosinase dan dapat diaplikasikan ke dalam krim pencerah (Chan et al. 2011).
Rendemen Ekstrak Sargassum sp. (CP 01)
Ekstraksi adalah pemisahan satu atau beberapa bahan dari suatu padatan atau cairan dengan bantuan pelarut. Pemisahan terjadi atas dasar kemampuan larut yang berbeda dari komponen-komponen dalam campuran (Darmawan 2002). Faktor-faktor yang berpengaruh terhadap proses ekstraksi adalah lama ekstraksi, suhu, dan jenis pelarut yang digunakan harus memperhatikan daya melarutkan, titik didih, sifat toksik, mudah tidaknya terbakar, dan sifat korosif terhadap peralatan ekstraksi (Khopkar 2003).
8
pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan (suhu kamar). Prosedurnya dilakukan dengan merendam simplisia dalam pelarut yang sesuai dalam wadah tertutup. Pengadukan sesekali ataupun konstan dapat meningkatkan kecepatan reaksi (Khairunnisa 2012). Maserasi memiliki beberapa kelebihan yaitu jumlah pelarut organik yang digunakan tidak terlalu banyak dan suhu ekstraksi yang digunakan di bawah titik didih pelarut sehingga terdegradasinya komponen minyak akibat panas dapat dihindari (Houghton dan Raman 1998).
Pemilihan pelarut dan metode ekstraksi akan mempengaruhi hasil kandungan senyawa metabolit sekunder yang dapat terekstraksi. Pemilihan pelarut ekstraksi umumnya mengunakan prinsip like dissolves like, dimana senyawa nonpolar akan larut dalam pelarut nonpolar sedangkan senyawa polar akan larut pada pelarut polar (Dewi et al. 2013). Pelarut organik yang digunakan dalam penelitian ini adalah metanol. Putri et al. (2010) menyatakan bahwa pelarut metanol dapat melarutkan hampir semua senyawa organik yang ada pada sampel, baik senyawa polar maupun nonpolar. Proses evaporasi digunakan untuk memisahkan pelarut dari ekstrak. Suhu yang digunakan adalah 40-50 oC untuk mencegah kerusakan komponen aktif yang terkandung dalam ekstrak (Harborne 1987). Ekstrak metanol Sargassum sp. (CP 01) dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3 Ekstrak metanol Sargassum sp. (CP 01) Sumber: Dokumentasi pribadi (2014).
Rendemen merupakan suatu parameter yang penting untuk mengetahui nilai ekonomis dan efektivitas suatu bahan atau produk. Rendemen adalah persentase bagian dari bahan baku yang dapat dimanfaatkan. Semakin tinggi nilai rendemen suatu bahan maka nilai ekonomisnya akan lebih tinggi begitu pula dengan pemanfaatannya. Rendemen ekstrak yang diperoleh dari ekstraksi Sargassum sp. (CP 01) adalah sebesar 6,02 ± 0.08 %. Rendemen ekstrak Sargassum sp. (CP 01) berbeda dengan rendemen ekstrak Sargassum filipendula dengan pelarut etanol pada penelitian Bambang et al. (2013) yaitu sebesar 1,69 ± 0,159 %. Wijayanto (2010) melaporkan bahwa penggunaan pelarut metanol
lebih efektif dalam ekstraksi alga merah Kappaphycus alvarezii dan Eucheuma
denticullatum dibandingkan dengan etanol yang memiliki tingkat kepolaran yang
lebih rendah. Perbedaan rendemen ekstrak bergantung pada kondisi alamiah
9
Aktivitas Inhibitor Tirosinase Ekstrak Sargassum sp. (CP 01)
Tirosinase merupakan enzim yang terlibat dalam proses biosintesis melanin pada kulit manusia. Enzim ini mengkatalisis tiga macam reaksi yaitu hidroksilasi l-tyrosine menjadi L-DOPA dan oksidasi L-DOPA menjadi dopakuinon dan oksidasi 5,6 Dihidroksiindol menjadi Indol 5,6 Kuinon yang selanjutnya membentuk melanin (Putri et al. 2010). Reaksi pencoklatan oleh enzim tirosinase dapat dihambat dengan suatu penghambat reaksi enzimatis berupa ion atau molekul yang disebut inhibitor tirosinase. Inhibitor tirosinase merupakan senyawa yang dapat menghambat proses pembentukan melanin. Inhibitor tirosinase saat ini banyak digunakan pada produk kosmetik dan farmasi untuk menghambat produksi melanin berlebih pada lapisan epidermis dan membuat kulit tampak lebih cerah (Arung et al. 2006). Daya inhibisi tirosinase ekstrak Sargassum sp. (CP 01) diukur sebagai nilai IC50 terhadap aktivitas
monofenolase (l-tyrosine) dan difenolase (L-DOPA) sebagai substrat. Nilai IC50
menyatakan besarnya konsentrasi sampel yang dibutuhkan untuk menghambat enzim tirosinase sebesar 50 %. Kojic acid juga dianalisis aktivitas inhibitor tirosinasenya sebagai kontrol positif. Nilai IC50 ekstrak Sargassum sp. (CP 01)
dan kojic acid pada kedua substrat diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 475 nm. Nilai IC50 ekstrak Sargassum sp. (CP 01) dan
kojic acid dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2 Nilai IC50ekstrak Sargassum sp. (CP 01) dan kojic acid
Sampel l-tyrosine (µg/ml) L-DOPA (µg/ml)
Ekstrak Sargassum sp. (CP 01) 27,50 ± 0,9 209,06 ± 64,96
Kojic acid 3,45 ± 0,82 14,27 ± 0,73
Tabel 2 menunjukkan ekstrak Sargassum sp. (CP 01) memiliki nilai IC50
pada tahap monofenolase dengan substrat l-tyrosine sebesar 27,50 ± 0,9 µg/ml. Nilai IC50 ekstrak Sargassum sp. (CP 01) berbeda dengan nilai IC50 dari kojic acid
10
penggunaan kojic acid sebagai lightening agent dapat menyebabkan alergi pada kulit manusia (Kamakshi 2012).
Komponen Aktif Ekstrak Sargassum sp. (CP 01)
Analisis fitokimia merupakan analisis yang digunakan untuk memberikan informasi jenis senyawa kimia yang terkandung dalam tumbuhan. Beberapa dari senyawa tersebut memberikan efek fisiologis yang lebih dikenal sebagai senyawa atau komponen kimia aktif (Copriyadi et al. 2005). Informasi mengenai komponen aktif sangat berguna untuk memprediksi komponen aktif yang memiliki manfaat bagi tubuh manusia. Tumbuhan yang diuji fitokimia dapat berbagai bentuk seperti segar, kering, serbuk, ekstrak, dan bentuk sediaan (Harborne 1987). Ekstrak Sargassum sp. (CP 01) dianalisis fitokimia untuk mengetahui komponen aktif yang berperan sebagai inhibitor tirosinase. Analisis fitokimia yang dilakukan antara lain alkaloid, flavonoid, saponin, fenol, steroid, triterpenoid, dan tanin. Hasil analisis fitokimia ekstrak Sargassum sp. (CP 01) disajikan pada Tabel 3.
Tabel 3 Hasil analisis fitokimia ekstrak Sargassum sp. (CP 01)
Keterangan: (+) = Lemah (++) = Kuat (++++) = Sangat kuat (-) = Tidak ada
Berdasarkan analisis fitokimia secara kualitatif dapat dilihat bahwa ekstrak Sargassum sp. (CP 01) mengandung komponen aktif antara lain flavonoid, saponin, fenol, steroid dan triterpenoid. Komponen aktif dari ekstrak Sargassum sp. (CP 01) yang diduga berperan sebagai inhibitor tirosinase antara lain flavonoid, saponin, fenol, dan steroid.
Flavonoid umumnya terdapat pada seluruh bagian tanaman, termasuk pada buah, tepung sari dan akar dalam bentuk glikosida. Flavonoid diklasifikasikan menjadi flavon, flavonol, flavanon, flavanol, isoflavon, kalkon, dihidrokalkon, auron, antosianidin, katekin, dan flavan-3,4-diol (Sirait 2007). Flavonoid merupakan senyawa pereduksi yang baik, menghambat banyak reaksi oksidasi, secara enzimatis maupun non enzimatis (Redha 2010). Flavonoid sebagai inhibitor tirosinase telah dilaporkan oleh Lo et al. (2009) yang diisolasi dari Sophora japonica dengan nilai IC50 sebesar 85 µM. Struktur flavonoid pada prinsipnya kompatibel dengan peran dari kedua substrat dan bersifat kompetitif sebagai inhibitor tirosinase. Penghambatan yang dilakukan salah satunya oleh flavonol, yang merupakan kelompok flavonoid yaitu sebagai inhibitor kompetitif
11
pada oksidasi L-DOPA oleh tirosinase dan 3-hidroksi-4-keto yang merupakan bagian dari struktur flavonol yang berperan sebagai kunci dalam pengkelat logam (Chang 2009).
Inhibitor kompetitif adalah suatu penghambat yang berlomba dengan substrat untuk berikatan dengan sisi aktif enzim, tetapi sekali terikat tidak dapat diubah oleh enzim tersebut (Lehninger 2004). Sisi aktif enzim tirosinase dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4 Sisi aktif enzim tirosinase Sumber: Eslami et al. (2012).
Senyawa fenolik dari flavonoid berikatan dengan atom Cu pada sisi aktif tirosinase yang menyebabkan tidak terjadi reaksi oksidasi yang dikatalisis tirosinase sehingga pembentukan senyawa dopakuinon dan dopakrom menjadi berkurang (Juwita 2011). Inhibitor kompetitif biasanya pengkelat logam, analog non-metabolisabel atau turunan dari suatu substrat (Chang 2009). Hal ini sesuai dengan pernyataan Redha (2010) bahwa flavonoid memiliki kemampuan untuk mengkelat logam.
Saponin merupakan senyawa aktif permukaan dan bersifat seperti sabun dan dapat dideteksi berdasarkan kemampuannya membentuk busa. Kandungan saponin pada tanaman dan obat-obatan memiliki beberapa macam bioaktivitas, seperti antivirus, anti-inflamasi, dan antiparasit (Navarroa et al. 2001). Sebagian besar saponin bereaksi netral (larut dalam air), beberapa ada yang bereaksi asam (sukar larut dalam air), sebagian kecil ada yang bereaksi basa (Sirait 2007). Saponin yang diisolasi dari Xanthoceras sorbifolia dilaporkan oleh Zhang dan Zhou (2013) dapat menghambat kerja tirosinase sebesar 52% dengan konsentrasi yaitu 0,96 mg/ml. Mekanisme saponin yang diisolasi dari Xanthoceras sorbifolia adalah meningkatkan nilai Km tetapi menurunkan laju oksidasi yang terindikasi dari rendahnya nilai Vmax.
Komponen fenolat merupakan struktur aromatik yang berikatan dengan satu atau lebih gugus hidroksil, beberapa mungkin digantikan dengan gugus metil atau glikosil. Komponen fenolat bersifat larut air selama komponen tersebut berikatan dengan gula membentuk glikosida. Senyawa fenol bebas biasanya terdapat dalam jaringan kayu, sementara senyawa fenol yang berada di tempat lain biasanya dalam bentuk glikosida. (Harborne 1987). Senyawa fenol terlibat dalam transport elektron pada fotosintesis dan dalam pengaturan enzim tertentu. Senyawa ini juga memiliki aktivitas antiinflamasi, karena dapat menghambat sintesis prostaglandin (Robinson 1995).
12
dibangun oleh molekul isoprene dengan kerangka terpenoid terbentuk dari dua atau lebih banyak satuan isoprene (C5) (Sirait 2007). Terpenoid terdiri atas beberapa macam senyawa yaitu komponen minyak atsiri, diterpenoid, giberalin, triterpenoidem, sterid dan karotenoid (Lenny 2006). Tiga steroid yang diisolasi dari Trifolium balansae dilaporkan memiliki aktivitas inhibitor tirosinase yang isolat keduanya memiliki nilai IC50 sebesar 2,39 µM dan sebanding dengan kojic acid sebagai kontrol positif (Sabudak et al. 2006).
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Rendemen ekstrak yang diperoleh dari ekstraksi Sargassum sp. (CP 01) adalah sebesar 6,02 ± 0,08 %. Ekstrak metanol Sargassum sp. (CP 01) memiliki nilai IC50 pada substrat l-tyrosine yaitu sebesar 27,50 ± 0,9 µg/ml dan sebesar
209,06 ± 64,96 µg/ml pada substrat L-DOPA. Komponen aktif yang terdapat dalam ekstrak metanol Sargassum sp. (CP 01) antara lain flavonoid, saponin, fenol, dan steroid, dan triterpenoid.
Saran
Saran yang diberikan dari hasil penelitian ini adalah penelitian lanjutan tentang pemurnian atau fraksinasi komponen aktif pada ekstrak metanol Sargassum sp. (CP 01) yang berperan sebagai inhibitor tirosinase dan pengujian kembali aktivitas inhibitor tirosinase komponen aktif tersebut.
DAFTAR PUSTAKA
Anggadireja J, Zatnika A, Purwoto H, Istini S. 2006. Rumput Laut. Jakarta (ID): Penebar Swadaya.
Arung ET, Shimizu K, Kondo R. 2006. Inhibitory effect of artocarpanone from Artocarpus heterophyllus on melanin biosynthesis. J Biol. 29:1966-1969. Bambang BS, Kumalaningsih S, Susinggih W, Hardoko. 2013. Polyphenol
content and antioxidant activities of crude extract from brown algae by various solvents. J. Life Sci. Biomed. 3(6): 439-443.
Batubara I, Darusman L K, Vibrianthi C. 2012. Potensi Tanaman Alamanda cathartica di daerah Bogor sebagai inhibitor tirosinase. Di dalam: Sukrasno, Yulinah, Soemardji, Moelyono, Damayanti, Sutjiatmo, Paryati, Januwati, editor. Seminar Nasional Pokja TOI XLII; 2012 Mei 20; Cimahi, Indonesia.
13
Chan YY, Kim KH, Cheah SH. 2011. Inhibitory effects of Sargassum polycystum on tyrosinase activity and melanin formation in B16GF10 murine melanoma cells. J of Ethnopharm: 1183-1188.
Chang TS. 2009. An update review of tyrosinase inhibitors. Int J Mol Sci. 10: 2440-2473.
Copriyadi J, Yasmi E, Hidayati. 2005. Isolasi dan karakterisasi senyawa kumarin dari kulit buah jeruk purut (Citrus hystrix DC). J Biogenesis. 2(1):13-25. Darmawan P. 2002. Ekstraksi protein dari buah mengkudu dengan pelarut asam.
J Kimia Teknol. 2:339-347.
Dewi IDADY, Astuti KW, Warditiani NK. 2013. Skrining fitokimia ekstrak etanol 95% kulit buah manggis (Garcinia mangosta L.). J Farm FMIPA Universitas Udayana.
Eslami M, Zare H R, Namazian M. 2012. Thermodynamic parameters of electrochemical oxidation of l-DOPA: Experimental and Theoretical Studies. J. Phys Chem. B 116 (41). DOI: 10.1021/jp3054229.
Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. Edisi ke-2. Padmawinata K, Soediro I, penerjemah. Bandung (ID): Institut Teknologi Bandung. Terjemahan dari: Phytochemical Methods.
Hougton PJ, Raman A. 1998. Laboratory Handbook For The Fractination Of Natural Extract. London (UK): Chapman & Hall
Jennifer C, Stephie CM, Abhishri SB, Shalini BU. 2012. A review on skin whitening property of plant extracts. Int J of Pharm and Biol Sci. 3(4): 332-347.
Juwita NK. 2011. Uji penghambatan tirosinase dan stabilitas fisik sediaan krim
pemutih yang mengandung ekstrak kulit batang nangka (Artocarpus heterophyllus) [skripsi]. Depok (ID): Universitas Indonesia.
Kadi A. 2005. Beberapa catatan kehadiran marga Sargassum di perairan Indonesia. Oseana. 30(4): 19-29.
Kamakshi R. 2012. Fairness via formulations: A review of cosmetic skin-lightening ingredients. J Cosmet Sci. 63: 43-54.
Kang SM, Heo SJ, Kim KN, Lee SH, Yang HM, Kim AD, Jeon YJ. 2012. Molecular docking studies of phlorotannin, dieckol isolated from Ecklonia cava with tyrosinase inhibitory activity. Bioorganic and Medic Chemist. 20(1): 311-316.
Khairunnisa S. 2012. Uji aktivitas antidiabetes fraksi-fraksi ekstrak etanol herba
meniran (Phyllanthus niruri L.) melalui penghambatan aktivitas
α-glukosidase dan identifikasi golongan komponen aktif dari fraksi yang aktif. Depok (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia.
Khopkar SM. 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta (ID): UI-Press.
14
Lenny S. 2006. Senyawa flavonoida, fenil propanoida dan alkaloida [karya ilmiah]. Medan (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, Universitas Sumatera Utara.
Lo HY, Lin RD, Lin PY, Liu LY, Lee HM. 2009. Active constituents from Sophora japonica exhibiting cellular tyrosinase inhibition in human epidermal melanocytes. J of Ethnopharm. 124(3): 625-629.
Marry JS, Vinotha P, Pradeep A. 2012. Screening for in vitro cytotoxic activity of seaweed, Sargassum sp. Against Hep-2and MCF-7 cancer cell lines. Asia Pac J Cancer Prev. 13.
Navarroa P, Ginera RM, Recioa MC, Maneza S, Cerda-Nicolas M, Riosa JL. 2001. In vivo anti-inflammatory activity of saponins from Bupleurum rotundifolium. Life Sci. 68(1): 1199-1206.
Putri SW, Supriyanti FM, Zackiyah. 2010. Penentuan aktivitas dan jenis inhibisi ekstrak metanol kulit batang Artocarpus heterophyllus LAMK sebagai inhibitor tirosinase. J Sains Teknol Kimia. 1(1): 94-99
Redha A. 2010. Flavonoids: Struktur, sifat antioksidatif dan perannya dalam sistem biologis. J Berlian. 9(2): 196-200.
Robinson T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Edisi ke-4. Kosasih, Padmawinata, penerjemah. Bandung (ID): ITB Press.
Sabudak T, Khan MT, Choudhary MI, Oksuz S. 2006. Potent tyrosinase inhibitors from Trifolium balansae. Nat Prod Res. 20(7): 665-670.
Sirait M. 2007. Penuntun Fitokimia dalam Farmasi. Bandung (ID): Institut Teknologi Bandung.
Thomas VN, Kim S. 2013. Beneficial effects of marine algal compounds in cosmeceuticals. Mar Drugs: 146-164.
Wijayanto DB. 2010. Uji aktivitas antibakteri ekstrak rumput laut Kappaphycus alvarezii dan Eucheuma denticullatum terhadap bakteri Aeromonas hydrophila dan Vibrio harveyii. J Kelautan. 3(1): 1-17.
Winata T. 2008. Sintesis meti-p-butoksisinamat dan uji aktivitasnya sebagai inhibitor tirosinase [skripsi]. Surabaya (ID): Fakultas Farmasi, Universitas Katolik Widya Mandala.
Yuvaraj N, Kanmani P, Satishkumar R, Paari KA, Pattukumar V, Arsd V. 2011. Extraction, purification, and partial characterization of Cladophora glomerata against multidrug resistant human pathogen Acinetobacter baumannii and fish pathogens. W J of Fish and Mar Sci. 3(1):51-57
17
Lampiran 1 Contoh perhitungan rendemen ekstrak Sargassum sp. (CP 01)
Bobot sampel awal (gram) Bobot ekstrak (gram) Rendemen (%)
20 1,22 6,08
50,07 2,99 5,96
Rendemen (%) = Bobot ekstrak (gram)
Bobot sampel awal (gram)
x
100%
=1,22 gram
20 gram
x
100%18
19
20
21
22
Lampiran 4 Perhitungan IC50kojic acid pada substrat l-tyrosine
Ulangan I
Grafik data percobaan dan garis regresi IC50kojic acid pada substrat l-tyrosine
ln IC50 = 1,05
Konsentrasi Kojic Acid (µg/ml)
KA (l-tyrosine I)
Log. (KA (l-tyrosine I)) data percobaan
23
Grafik data percobaan dan garis regresi IC50kojic acid pada substrat l-tyrosine
IC50 = (50-14,71/8,754)
Konsentrasi Kojic Acid (µg/ml)
KA (l-tyrosine II)
Linear (KA (l-tyrosine II))
data percobaan
24
Lampiran 5Perhitungan IC50kojic acid pada substrat L-DOPA
Ulangan I
Grafik data percobaan dan garis regresi IC50kojic acid pada substrat L-DOPA
ln IC50 = 2,62
Konsentrasi Kojic Acid (µg/ml)
KA (L-DOPA I)
Log. (KA (L-DOPA I)) data percobaan
25
Grafik data percobaan dan garis regresi IC50kojic acid pada substrat L-DOPA
ln IC50 = 2,69
Konsentrasi Kojic Acid (µg/ml)
KA (L-DOPA II)
Log. (KA (L-DOPA II)) data percobaan
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bekasi pada tanggal 19 Januari 1993 dari ayah Drs. Bernard Manson Hutabarat dan ibu Esmi L. Tobing. Penulis merupakan anak kedua dari tiga bersaudara. Pendidikan formal yang ditempuh penulis dimulai di SD DRIEWANTI, Bekasi Selatan pada tahun 1998 hingga tahun 2004. Penulis melanjutkan pendidikan pada tahun yang sama di SMPN 12 Bekasi Selatan hingga tahun 2007. Pendidikan formal selanjutnya ditempuh di SMAN 3 Bekasi pada tahun 2007 dan lulus pada tahun 2010. Tahun 2010 penulis diterima sebagai Mahasiswa pada Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor melalui jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB).
Selama perkuliahan, penulis menjadi asisten praktikum mata kuliah Teknologi Produk Tradisional Hasil Perairan dan mata kuliah Bioteknologi Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan pada tahun ajaran 2012/2013. Penulis juga pernah aktif berorganisasi di Komisi Kesenian PMK IPB sebagai Divisi Internal dan sebagai Divisi PSDM di Himpunan Mahasiswa Teknologi Hasil Perairan (HIMASILKAN), Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan tahun kepengurusan 2011-2012. Tahun 2013 penulis melaksanakan praktik lapangan dengan judul Good Manufacturing Practices (GMP) pada Industri Pembekuan Tuna Saku Natural di PT Lautan Niaga Jaya, Muara Baru, Jakarta Utara.
