KAJIAN POLISAKARIDA MANNAN DARI BUNGKIL INTI
SAWIT SEBAGAI PENGENDALI
Salmonella thypimurium
DAN IMMUNOSTIMULAN PADA AYAM
MA’RUF TAFSIN
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI
Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa disertasi saya dengan judul: kajian polisakarida mannan dari bungkil inti sawit sebagai pengendali Salmonella
thypimurium dan immunostimulan pada ayam adalah benar-benar asli karya saya
dengan arahan komisi pembimbing, dan bukan hasil jiplakan atau tiruan dari tulisan siapapun serta belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun.
ABSTRACT
MA’RUF TAFSIN. Studies on Mannan Containing Polysaccharides from Palm Kernel Meal as Immunostimulant and to Control Salmonella thypimurium on Chicken. Under the supervisions of NAHROWI, KG WIRYAWAN, KAMALUDDIN ZARKASIE, WIRANDA G PILIANG, and LILY A SOFYAN.
Palm Kernel Meal (PKM) is a by-product of palm kernel oil extraction and found in large quantity in Indonesia. The inclusion of PKM on poultry diet are limited due to some nutritional problems such as anti-nutritional properties (mannan). On the other hand, mannan containing polysaccharides (PM)play in various biological functions particularly in enhancing the immune response and the ability to block the colonization of pathogen bacteria in the intestine of poultry The study consisted of three steps. The first step was the extraction process to produce PM from PKM. The second step was to investigate the inhibitory effect of PM against Salmonella thypimurium (in vitro and in vivo). In vivo studies were conducted using chicks that were challenged orally with S. thypimurium. The third step was to study the effect of PM from PKM as immunostimulant that were detected through of the antibody responses against ND (New Castle Disease) and IBD (Infectious Bursal Disease) virus. The levels of PM that were used in the study consisted of 0, 1000, 2000, 3000, 4000 ppm of mannan containing polysaccharides, in term of total sugar.
The result of the first step indicated that the polysaccharide was dominated by the galactose and mannose with ratio of 1:3, respectively. The extraction produced mannose ranging from 0.15-7.58% of the total mannan. The highest content of mannose was shown after treating PKM with water as the solvent. The result of second step showed that PM did not have bactericidal effect, but agglutination test showed the positive result microscopically. Compared with the control group, the number of chicks fed PM (2000-4000 ppm) decreased
Salmonella incidence. The total number Salmonella colony (cfu) also decreased that was proved in the second experiment. At third step, the titers against IBD virus of chicks fed PM had higher titers than that of the control diet, whereas the titers against ND virus was not influenced by treatments. The effect of PM gave various results on chicken performances. The results indicated that PM from PKM gave positive results on poultry performances at the condition of pathogen challenge (Salmonella), and at the level of 3000 ppm had 10% and 20% higher weight gain than that of the control group in the first and in the second experiment, respectively. The different result was shown in the third step, where the effect of PM did not influence the weight gain of the chicks.
It is concluded that PM showed the immunostimulant activity and prevented the colonization of Salmonella at the caecum of chicks, and could be used as feed additive in poultry diet.
RINGKASAN
MA’RUF TAFSIN. Kajian Polisakarida Mannan dari Bungkil Inti Sawit sebagai Pengendali Salmonella thypimurium dan Immunostimulan pada Ayam. Dibimbing oleh, NAHROWI, KG WIRYAWAN, KAMALUDDIN ZARKASIE, WIRANDA G PILIANG, dan LILY A SOFYAN.
Bungkil inti sawit (BIS) adalah produk samping dari industri pengolahan minyak kelapa sawit dengan ketersediaan yang tinggi di Indonesia. Penggunaan BIS dalam pakan unggas terbatas karena kandungan mannannya yang tinggi dan dapat bersifat anti nutrisi. Di lain pihak, polisakarida mannan (PM) mempunyai fungsi lain khususnya dapat meningkatkan respon kekebalan dan kemampuannya menghambat kolonisasi bakteri yang merugikan ternak. Tujuan penelitian ini adalah untuk mempelajari komposisi kimia PM dari BIS dan efeknya sebagai pengendali Salmonella thypimurium dan sebagai immunostimulan pada ternak ayam.
Proses ekstraksi untuk mendapatkan PM dari dinding sel BIS menggunakan metode ekstraksi air panas. Keragaman berat molekul dilihat secara kromatografi menggunakan gel sephadex-G 50 (16X800 mm), dan analisis komponen gula menggunakan HPLC yang dilengkapi dengan P-NH2 Carbohydrate column. Efek PM dari BIS sebagai pengendali Salmonella (in vitro) dilakukan dengan melihat uji aglutinasi dan inkubasi bakteri baik pada media agar maupun media cair. Tingkat penggunaan PM yang digunakan yaitu 0, 1000, 2000, 3000, 4000 ppm berdasarkan kandungan total gulanya. Pengujian in vivo dilakukan dengan menggunakan ayam broiler dan petelur (masing-masing 216 ekor) yang diinfeksi secara oral dengan 104 cfu Salmonella thypimurium pada hari ketiga. Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan petak terbagi (RPT) dengan galur ayam sebagai petak utama dan tingkat PM sebagai anak petak. Pengujian lanjutan dilakukan pada 60 ekor ayam boiler dan dilakukan uji tantang dengan 107 cfu Salmonella thypimurium pada hari ke tujuh. Tingkat penggunaan PM yang dilakukan sama dengan pengujian in vitro. Pengujian PM sebagai immunostimulan dilakukan dengan menggunakan masing-masing 180 ekor ayam broiler dan petelur. Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan petak-petak terbagi (RPPT) dengan galur ayam sebagai petak utama, dosis vaksin (penuh dan setengah) sebagai anak petak, dan tingkat PM sebagai anak-anak petak. Vaksin yang digunakan adalah ND (New castle disease) dan IBD (Infectious bursal disease) dan titernya diamati 3 minggu setelah vaksinasi kedua.
PM dari BIS tidak menunjukkan efek bakterisidal, tetapi jumlah koloni bakteri semakin menurun seiiring dengan meningkatnya PM dalam media cair, dan uji agglutinasi menunjukkan hasil positif secara mikroskopis. Penggunaan PM dari BIS (2000-4000 ppm) menurunkan insiden Salmonella. Jumlah koloni (cfu)
Salmonella pada caecum juga menunjukkan penurunan akibat penggunaan PM
yang terlihat pada penelitian kedua. Pengujian sebagai immunostimulan menunjukkan bahwa titer ND dipengaruhi galur ayam. Ayam petelur menunjukkan titer lebih tinggi dibandingkan ayam broiler, dan dosis vaksin penuh menunjukkan titer lebih tinggi dibandingkan dosis setengah. Penggunaan PM ternyata tidak mempengaruhi titer ND. Pengujian terhadap titer antibodi IBD menunjukkan hasil yang berbeda. Titer IBD tidak dipengaruhi oleh galur ayam dan dosis vaksin, sebaliknya penggunaan PM menunjukkan adanya pengaruh. Penggunaan PM pada tingkat 1000; 3000; dan 4000 ppm mempunyai titer nyata lebih tinggi dibandingkan kontrol, tetapi diantara penggunaan 1000-4000 ppm tidak menunjukkan perbedaan nyata.
Penggunaan PM dari BIS terhadap penampilan ayam menunjukkan hasil yang beragam. Pada percobaan pengendali Salmonella, penggunaan PM pada tingkat 2000-3000 ppm menunjukkan pertambahan berat badan (PBB) lebih baik dibandingkan kontrol dan terjadi peningkatan PBB sebesar 10% dan 20% lebih tinggi dibandingkan kontrol, berturut-turut pada penelitian pertama dan kedua. Selanjutnya penggunaan PM sebanyak 4000 ppm menunjukkan konversi ransum yang lebih buruk dibandingkan perlakuan lainnya. Pada percobaan sebagai immunostimulan, PM dari BIS tidak memberikan pengaruh terhadap konsumsi, PBB maupun konversi ransum. Hasil tersebut menunjukkan bahwa PM dari BIS menunjukkan hasil positif terhadap penampilan ternak pada kondisi uji tantang patogen. Dapat disimpulkan bahwa PM dari BIS menunjukkan adanya aktivitas sebagai immunostimulan dan mencegah kolonisasi Salmonella sehingga dapat digunakan sebagai imbuhan pakan dalam ransum ayam.
Kata kunci: Bungkil Inti sawit, Mannan, Salmonella thypimurium,
@ Hak cipta milik IPB, tahun 2007
Hak Cipta dilindungi Undang-undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumber
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
KAJIAN POLISAKARIDA MANNAN DARI BUNGKIL INTI
SAWIT SEBAGAI PENGENDALI
Salmonella thypimurium
DAN IMMUNOSTIMULAN PADA AYAM
MA’RUF TAFSIN
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada
Program Studi Ilmu Ternak
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Disertasi : Kajian Polisakarida Mannan dari Bungkil Inti Sawit sebagai Pengendali Salmonella thypimurium dan Immunostimulan pada Ayam
Nama : MA’RUF TAFSIN NIM : D016010061
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Nahrowi, M.Sc. Ketua
Dr. Ir. Komang G Wiryawan. Kamaluddin Zarkasie,DVM, PhD Anggota Anggota
Prof.Dr. Ir. Wiranda G Piliang, M.Sc. Prof. Dr. Lily A Sofyan, M.Sc. (Alm) Anggota Anggota
Diketahui
Koordinator Program Mayor Dekan Sekolah Pascasarjana Pascasarjana Departemen INTP
Dr.Ir. Muhammad Ridla, M.Agr. Prof.Dr.Ir. Khairil A Notodiputro, MS.
KATA PENGANTAR
Segala puji hanya kepada Allah, Tuhan seru sekalian alam. Rasa syukur penulis panjatkan, karena atas tuntunan dan kehendak-Mu tugas ini dapat terselesaikan. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan khazanah baru mengenai pemanfaatan bungkil inti sawit yaitu sebagai sumber mannan yang berfungsi sebagai pengendali Salmonella dan immunostimulan pada ayam.
Penelitian ini dapat terselesaikan atas arahan, saran, dan kerjasama yang sangat baik dari komisi pembimbing, oleh karena itu ucapan terima kasih saya ucapkan kepada almarhumah Prof. Dr. Lily A. Sofyan selaku ketua komisi pembimbing, dan anggota komisi pembimbing yang terdiri atas Dr. Ir. Nahrowi MSc, Dr. Ir. Komang G Wiryawan, Kamaluddin Zarkasie, DVM, PhD., dan Prof.Dr.Ir. Wiranda G Piliang, MSc. Banyak sekali sumbangan pemikiran, waktu, dan segala pengertian yang telah diberikan komisi pembimbing kepada saya dan penulis berharap ”bekal” tersebut dapat diteruskan kepada orang lain yang memerlukan, sehingga menjadi amalan yang senantiasa mengalir.
Pada kesempatan ini, penulis juga mengucapkan terimakasih kepada Beasiswa Program Pascasarjana (BPPS) Dirjen Dikti, pimpinan dan staf Sekolah Pascasarjana IPB, Fakultas Peternakan IPB, dan Program Studi Ilmu Ternak Pascasarjana IPB atas penerimaan dan pelayanan yang baik selama penulis mengikuti pendidikan program doktor pada sekolah pascasarjana IPB. Ucapan yang sama penulis juga sampaikan kepada Rektor Universitas Islam Kalimantan (UNISKA) Banjarmasin, Rektor Universitas Al-Azhar, Medan, Koordinator Kopertis Wilayah XI Kalimantan dan Kopertis Wilayah I Sumatera Utara yang telah memberi kesempatan kepada saya untuk melanjutkan pendidikan program doktor di IPB.
IPB; Laboratorium Balai Pasca Panen Cimanggu, serta Laboratorium Teknologi Hasil Perikanan FPIK IPB atas segala dukungannya dalam pelaksanaan penelitian ini. Secara pribadi penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada Bapak Yatno; Achmad Jaelani; Mas Winarno dan Mbak Ida; Allaily; Merry dan adik-adik INMT 39 yang banyak membantu dalam pelaksanaan penelitian, serta teman pada Program Studi Ilmu Ternak yang tidak dapat penulis sebutkan satu-persatu.
Dorongan moril maupun materiil banyak penulis rasakan dari keluarga, oleh karena itu penulis mengucapkan terimakasih yang setinggi-tingginya kepada ayahanda H. Moch Saleh dan Ibunda Sukaesih serta Bapak dan Ibu mertua H. Hasan Hanfi (alm) dan Hj. Chairani K Lubis, serta saudaraku: Agus Patlas, Widaningsih, dan Awal Nugraha. Ucapan yang sama penulis sampaikan kepada Keluarga Hj. Pimi Aeni(alm), Kel. Syarief Maulana SKM, Kel Handi Soetisna SE,MSi, Kel. Prof. Dr. Kooswardono Mudikdjo dan Kel Prof. Dr. Chairuddin P Lubis, DTM&H,DSAk yang banyak membantu selama proses pendidikan penulis.
Akhirnya kepada istri tercinta Dr. Nevy D. Hanafi, SPt,MSi.dan Anakku tersayang Rifda Amaliya Maruf, Penulis ucapkan terima kasih atas segala dorongan, semangat, pengorbanan yang kalian berikan dan semoga hal ini semakin memperkuat ikatan kebersamaan diantara kita. Akhir kata, penulis berharap tulisan ini banyak memberikan manfaat dalam perkembangan industri peternakan, khususnya pakan ternak ayam, baik dimasa sekarang maupun yang akan datang.
Bogor, Agustus 2007
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan pada tanggal 26 Nopember 1967 di Pandeglang (Banten), anak kedua dari empat saudara pasangan H. Mochamad Soleh dan Sukaesih. Menikah dengan Nevy D Hanafi pada tahun 2001 dan dikaruniai seorang putri, Rifda Amaliya Maruf yang lahir pada tanggal 5 Nopember 2001 di Bogor.
Pendidikan dasar dan menengah penulis selesaikan di kota kelahirannya, dan pada tahun 1986 penulis diterima pada Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran, Bandung. Selepas pendidikan sarjana, penulis menempuh pendidikan magister pada Program Studi Ilmu Ternak ,Program Pascasarjana IPB yang diselesaikan pada tahun 2000. Selanjutnya pada tahun 2001 penulis melanjutkan pendidikan program doktor pada lembaga yang sama. Pendidikan Pascasarjana penulis tempuh atas beasiswa BPPS Ditjen Dikti.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL... xiv
DAFTAR GAMBAR... xv
DAFTAR LAMPIRAN... xvi
1 PENDAHULUAN ... 1
Latar Belakang... 1
Tujuan dan Manfaat Penelitian... 3
Kerangka Penelitian ... 3
2 TINJAUAN PUSTAKA... 6
Mikroflora pada Saluran Pencernaan Unggas ... 6
Penggunaan Antibiotik ……… 10
Sistem Kekebalan Tubuh (Imunitas)... 11
Mannan Oligosasakarida (MOS)... 15
3 EKSTRAK POLISAKARIDA MENGANDUNG MANNAN DARI BUNGKIL INTI SAWIT Pendahuluan... 22
Bahan dan Metode ... 24
Hasil... 26
Pembahasan ... 31
Kesimpulan ... 35
4 POLISAKARIDA MENGANDUNG MANNAN DARI BUNGKIL INTI SAWIT SEBAGAI PENGENDALI Salmonella thypimurium PADA AYAM Pendahuluan... 36
Bahan dan Metode ... 38
Hasil... 43
Pembahasan ... 54
5 POLISAKARIDA MENGANDUNG MANNAN DARI BUNGKIL INTI SAWIT SEBAGAI IMMUNOSTIMULAN PADA AYAM
Pendahuluan... 61
Bahan dan Metode ... 63
Hasil... 66
Pembahasan ... 72
Kesimpulan ... 77
6 PEMBAHASAN UMUM ………. 78
7 KESIMPULAN... 86
DAFTAR PUSTAKA ... 87
LAMPIRAN ... 96
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Mekanisme pengaturan bakteri secara langsung dan tidak langsung
terhadap mikroflora saluran pencernaan pada ayam... 9 2 Persentase komponen gula netral pada bungkil inti sawit (BIS)... 16 3 Perbandingan penggunaan antibiotik dengan MOS... 20
4 Pengaruh cara ekstraksi terhadap kandungan total gula yang
dihasilkan dari 100 g BIS... 26 5 Pengaruh cara ekstraksi terhadap kandungan dan rasio komponen
gula yang dideteksi dengan HPLC yang dilengkapi Carbohydrate
column.... 28 6 Susunan ransum percobaan... 39
7 Pengaruh penggunaan polisakarida mannan dari BIS terhadap
konsumsi ransum ayam umur 1-28 hari (g/ekor)... 45 8 Pengaruh penggunaan polisakarida mannan dari BIS terhadap
pertambahan bobot badan (PBB) ayam umur 1-28 hari (g/ekor)... 46 9 Pengaruh penggunaan polisakarida mannan dari BIS terhadap
pertambahan bobot badan akhir ayam umur 1-28 hari (g/ekor)... 47 10 Pengaruh penggunaan polisakarida mannan dari BIS terhadap
konversi ransum ayam umur 1-28 hari... 48 11 Pengaruh penggunaan polisakarida mannan dari BIS terhadap
kolonisasi bakteri Salmonella ... 49 12 Penggunaan polisakarida mannan (PM) terhadap konsumsi dan
konversi ransum serta pertambahan bobot badan (PBB)ayam broiler . 51 13 Penggunaan polisakarida mannan (PM) dari BIS terhadap insiden
infeksi, pH caecum dan indeks bursa fabricius... 53
14 Susunan ransum percobaan... 63 15 Pengaruh penggunaan PM dari BIS pada dosis vaksin dan galur ayam
berbeda terhadap konsumsi ransum selama 6 minggu (g/ekor).. 66 16 Pengaruh penggunaan PM dari BIS pada dosis vaksin dan galur ayam
berbeda terhadap PBB selama 6 minggu (g/ekor.)... 67 17 Pengaruh penggunaan PM dari BIS pada dosis vaksin dan galur ayam
berbeda terhadap bobot akhir selama 6 minggu (g/ekor.)... 68
Halaman
18 Pengaruh penggunaan PM dari BIS pada dosis vaksin dan galur ayam
berbeda terhadap konversi ransum... 69 19 Pengaruh penggunaan PM dari BIS pada dosis vaksin dan galur ayam
berbeda terhadap titer antibodi ND (2log)... 70 20 Pengaruh penggunaan PM dari BIS pada dosis vaksin dan galur ayam
berbeda terhadap titer antibodi IBD (2log)... 71
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Kerangka tahapan penelitian kajian polisakarida mengandung mannan dari BIS sebagai pengendali Salmonella thypimurium
dan immunostimulan pada ayam... 5 2 Mikroflora pada saluran pencernaan ayam... 6
3 Tiga jalur aktivasi komplemen... 13 4 Aktivasi komplemen melalui jalur lektin...
14 5 Mekanisme kerja MOS mencegah kolonisasi bakteri merugikan
(CFNP TAP Review)... 17 6 Kromatogram untuk perlakuan ekstraksi dengan pelarut akuades
(a); NaOH 0.05 N (b); NaOH 0.1 N (c)... 27 7 Pemisahan polisakarida dalam sephadex G50 (16x800 mm) pada
perlakuan pelarut akuades ... 29 8 Pemisahan polisakarida dalam sephadex G50 (16x800 mm) pada
perlakuan pelarut akuades + kaca ... 30 9 Struktur mannan dari guaran... 30 10 Pemisahan polisakarida dalam sephadex G50 (16x800 mm) pada
perlakuan pelarut NaOH 0.1N + kaca ... 33 11 Hasil uji aglutinasi terhadap Salmonella sp.... 43 12 Pengaruh penambahan ekstrak BIS terhadap koloni bakteri yang
terbentuk (log CFU)... 44 13 Pengaruh penggunaan PM dari BIS terhadap jumlah koloni
bakteri Salmonella (log cfu/g)... .. 50 14 Pengaruh penggunaan polisakarida mannan (PM) terhadap bobot
badan ayam broiler (g/ekor)... 52 15 Pengaruh penggunaan PM dari BIS terhadap jumlah koloni
Salmonella (log cfu/ml)... 53 16 Struktur galaktomannan dari bungkil inti sawit... 79 17 Struktur mannan dari S cerevisiae ... 82
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Analisis ragam terhadap kandungan total gula terekstrak... 97
2 Analisis ragam terhadap konsumsi ransum ayam (percobaan
Salmonella tahap I)... 98 3 Analisis ragam terhadap pertambahan bobot badan (PBB) ayam
(percobaan Salmonella tahap I)... 100
4 Analisis ragam terhadap bobot badan akhir ayam
(percobaan Salmonella tahap I)... 101
5 Analisis ragam terhadap konversi ransum ayam (percobaan
antibakteri)... 103 6 Pengujian χ2 insiden bakteri Salmonella...
105 7 Analisis ragam terhadap cfu (log) Salmonella...
106 8 Analisis ragam terhadap berat relatif bursa fabricius... 107
9 Analisis ragam terhadap pH caecum...
108 10
Analisis ragam terhadap konsumsi ransum ayam (percobaan
immunostimulan)... 109 11 Analisis ragam terhadap pertambahan bobot badan ayam
(percobaan immunostimulan)... 111 12 Analisis ragam terhadap bobot akhir ayam (percobaan
immunostimulan)... 113
13 Analisis ragam terhadap konversi ransum ayam (percobaan
immunostimulan)………... 115
14 Analisis ragam terhadap titer antibodi ND ayam (percobaan
immunostimulan)……….. 117
15 Analisis ragam terhadap titer antibodi IBD ayam (percobaan
immunostimulan) ……….. 118
1. PENDAHULUAN
Latar belakang
Bungkil inti sawit (BIS) adalah hasil ikutan dari industri pengolahan kelapa sawit dan di Indonesia ketersediaannya sangat tinggi. Luas lahan kelapa sawit pada tahun 2004 di proyeksikan sekitar 4.4 juta ha (Jakarta Future Exchange 2001) dan pada tahun 2006 mencapai luas 5.2 juta ha (Kompas 2006). Produksi tandan buah segar kelapa sawit sekitar 12.5 – 27.5 ton/ha, dan sekitar 2 persennya berupa bungkil inti sawit (Sinurat 2001). Penggunaan BIS sebagai salah satu pakan potensial telah banyak dilaporkan baik pada ternak ruminansia ( Elisabeth dan Ginting 2003; Mathius et al. 2003), ayam (Sundu dan Dingle 2005), bahkan ikan (Keong dan Chong 2005).
Salah satu faktor pembatas penggunaan BIS terutama untuk ternak monogastrik adalah kandungan seratnya yang tinggi dan komponen dominannya adalah berupa mannosa yang mencapai 56.4% dari total dinding sel BIS dan ada dalam bentuk ikatan β-mannan (Daud et al. 1993). Kandungan mannan yang tinggi disamping sebagai faktor pembatas juga dapat dianggap sebagai potensi untuk mendapatkan imbuhan pakan seperti prebiotik yang akan meningkatkan kesehatan ternak. Sundu et al. (2006) menduga bahwa ada kesamaan antara BIS dengan mannanoligosakarida (MOS) yang akan memperbaiki kesehatan dan sistem kekebalan ternak unggas.
contoh untuk antibiotik sekarang ini ditemukan beberapa strain bakteri yang resisten terhadap antibiotik. Selain itu penggunaannya terutama pada negara maju pengaturannya sangat ketat karena akan berpengaruh pada aspek keamanan pangan untuk manusia. Upaya alternatif dicoba untuk mengatasi keterbatasan tersebut, diantaranya dengan menggunakan karbohidrat. Devegowda et al. (1997) melaporkan bahwa tiga oligosakarida utama yang dapat memperbaiki produksi ternak, yaitu mannanoligosakarida (MOS), fruktooligosakarida, dan galaktooligosakarida, dan MOS dilaporkan memberikan hasil yang paling baik.
Pendekatan baru untuk mencegah infeksi mikroba ditemukan dengan diketahuinya pentingnya proses penempelan pada saluran pencernaan. Diketahui bahwa fimbriae tipe 1 yang sensitif terhadap mannosa berperan dalam menempelnya mikroba patogen. Bakteri seperti Salmonella, E. coli, dan Vibrio cholera mempunyai lektin pada permukaan selnya yang penempelannya spesifik terhadap mannosa, dengan demikian mannosa dapat menghambat proses penempelan mikroba merugikan pada saluran pencernaan (Center for Food and Nutrition Policy (CFNP) Technical Advisory Panel (TAP) Review 2002).
Beberapa paten yang terkait penggunaan sakarida untuk ternak sebagian besar dihasilkan dari proses ekstraksi ragi Saccharomyces cerevisiae. Sebagai contoh Dawson dan Sefton (2003) menguji kemampuan MOS untuk kontrol koksidiosis; Sunvold dan Hayek (2001) tentang perbaikan metabolisme glukosa, dan absorpsi zat makanan pada hewan peliharaan; Howes dan Newman (2000) terkait dengan penurunan mikotoksin pada pakan. Selanjutnya Haschke et al. (2003) melaporkan penggunaan fruktosoligosakarida sebagai imunostimulan.
Pengkajian penelitian ini adalah ke arah sumber mannan baik yang berasal dari mikroba ataupun dari sumber lain seperti dari dinding sel tanaman. Ishihara
et al. (2000) menggunakan mannan yang berasal dari hidrolisis guar gum
(Cyamoposis tetragonolobus) yang mengandung galaktomannan dengan bobot
molekul sekitar 20 000 Da. Potensi lain yang dapat digunakan sebagai sumber mannan adalah BIS. Sejauh ini, BIS hanya dipakai sebagai salah satu sumber pakan, padahal melihat potensi tersebut dapat ditingkatkan nilai tambahnya menjadi bahan baku pembuatan imbuhan pakan. Mengamati latar belakang tersebut kami tertarik untuk meneliti proses isolasi, produksi dan aplikasi mannan dari BIS sebagai imunostimulan dan substansi pengendali Salmonella pada ayam.
Tujuan Penelitian
1. Mengetahui proses ekstraksi untuk mendapatkan polisakarida mengandung mannan dari bungkil inti sawit.
2. Menguji kemampuan polisakarida mengandung mannan dari bungkil inti sawit sebagai pengendali Salmonella thypimurium pada ayam.
3. Menguji kemampuan polisakarida mengandung mannan dari bungkil inti sawit sebagai immunostimulan pada ayam.
Manfaat Penelitian
Kerangka Penelitian
Landasan pemikiran dilakukannya penelitian ini adalah kondisi peternakan unggas komersial yang mempunyai tingkat kepadatan yang tinggi menghadapi bahaya rentannya terkena serangan penyakit dari mikroba patogen. Upaya yang dilakukan yaitu menggunakan antimikroba dan sampai sekarang kebanyakan anti mikroba yang digunakan adalah antibiotik. Akibat negatif penggunaan antibiotik pada ternak antara lain terdapatnya residu pada produk ternak dan terjadinya resistensi mikroba yang pada akhirnya dapat membahayakan manusia.
Upaya alternatif pengganti antibiotik banyak dikaji untuk mengatasi masalah tersebut diantaranya menggunakan MOS (Mannanoligosakarida). MOS banyak dikembangkan dari dinding sel mikroba seperi ragi Saccharomyces
cerevisiae sebagai bahan baku yang menyebabkan harga produknya sangat mahal
dan masih di impor. Sampai saat ini belum banyak laporan tentang mannan dari BIS, padahal BIS sangat berpotensi untuk menghasilkan ekstrak yang mengandung mannan mengingat kandungannya yang tinggi.
Rancangan penelitian yang akan digunakan adalah berupa eksperimen murni baik yang diadakan di laboratorium (ekstraksi dan produksi mannan dan pengujian in vitro) maupun di kandang percobaan (in vivo). Gambaran kerangka tahapan penelitian tersaji pada Gambar 1. Penelitian ini dibagi menjadi beberapa tahapan. Pertama. Proses ekstraksi dan karakterisasi mannan dari BIS dengan melakukan ekstraksi menggunakan air panas (hot water extraction). Kedua, Mengkaji kemampuan mannan yang telah diproduksi sebagai pengendali
Salmonella. Pada tahapan ini akan dilihat kemampuan mannan dalam
menghambat kolonisasi bakteri yang merugikan pada ternak ayam yaitu
Gambar 1 Kerangka tahapan penelitian kajian polisakarida mengandung mannan
Penggunaan PM dari BIS sebagai pengendali Salmonella dan
Tahap I • Kandungan total gula
2. TINJAUAN PUSTAKA
Mikroflora pada Saluran Pencernaan Unggas
Saluran pencernaan pada unggas yang baru ditetaskan umumnya steril. Sesaat setelah menetas unggas yang masih muda secara alami mikroflora saluran pencernaannya berkembang melalui kontaminasi dari material feses yang berasal dari ayam dewasa. Faktor lain yang berpengaruh yaitu transfer mikroba dari induk pada anak, dan kontak dengan bakteri dari lingkungan. Saluran pencernaan unggas apabila dilihat dari aspek mikrobiologis dapat dikelompokkan menjadi lima bagian yaitu : tembolok (crop); rempela; usus halus; sekum; kolon dan kloaka (Gambar 2).
Gambar 2 menunjukkan bahwa faktor utama yang menentukan populasi mikroba adalah pH. Escherichia coli dan Enterococci merupakan organisme yang dominan yang ditemukan pada unggas yang baru menetas. Pada bagian tembolok,
Lactobacillus menjadi dominan pada lima hari pertama, sedangkan pada usus halus memerlukan waktu dua minggu. Kolonisasi bakteri pada usus halus lebih lambat dibandingkan pada bagian lain dari saluran pencernaan dan pada hari pertama konsentrasinya dibawah 105 CFU/g (Coloni Forming Unit). Pada bagian sekum, pada umur unggas sekitar dua sampai empat minggu bakteri obligat aerob meningkat. Pada saat ini bakteri Bifidobacteria, Bacteroides, Eubacteria,
Peptostreptococci, dan Clostridia menjadi predominan. Selain itu pada sekum ditemukan juga kelompok bakteri selulolitik pada tingkat diatas 103 CFU/g (Spring 1997).
Sekarang ini telah diketahui bahwa mikroflora yang secara alami sudah ada dalam saluran pencernaan (indegenous) pada hewan dan manusia dapat memberikan perlindungan terhadap infeksi mikroorganisme yang bersifat patogen. Istilah yang menjelaskan perlindungan tersebut dikenal dengan nama ‘colonization resistance’. Penelitian yang menunjukkan hal tersebut diantaranya dilakukan pada mencit dan diamati pada tiga fase yaitu sebelum, selama, dan sesudah pemberian antibiotik (streptomycin dan neomycin). Hasil penelitian menunjukkan bahwa sebelum pemberian antibiotik ‘colonization resistance’ tinggi terhadap tiga mikroba (E coli; Klebsiela pneumoniae; Pseudomonas aeroginosa). Selama pemberian antibiotik akan menurunkan resistensi dan mencit lebih mudah terinfeksi tiga mikroba patogen tersebut karena hilangnya flora pada usus. Selanjutnya pada fase setelah pemberian antibiotik resistensi ini kembali menuju normal karena terjadinya repopulasi flora saluran pencernaan yang tahan terhadap antibiotik (Hentges 1992).
saluran pencernaan. Selanjutnya Mulder et al. (1997) menjelaskan teori “competitive exclusion (CE)” yaitu perlakuan terhadap anak ayam (DOC) yang diberi mikroflora yang menghasilkan resistensi terhadap mikroorganisme yang berpotensi patogen. Beberapa percobaan telah dilakukan menggunakan kultur mikroba murni maupun kultur campuran (undefined microflora). Hasil penelitian menunjukkan bahwa dibandingkan dengan kultur murni ternyata pemberian dengan “undefined microflora” yang berasal dari sekum ayam memberikan hasil yang lebih baik. Kultur tersebut mengandung sejumlah besar mikroba aerobik yang telah diketahui dan banyak bakteri anaerobik yang belum diketahui.
Teori “competitive exclusion (CE)” pertama kali dikemukakan oleh Rantala dan Nurmi (1973) dan banyak mengilhami peneliti selanjutnya untuk mengamati pencegahan bakteri merugikan seperti Salmonella pada ternak unggas. Beberapa hasil positif ditemukan yaitu dengan menurunnya kolonisasi bakteri
Salmonella pada ayam broiler dengan digunakannya kultur yang mengandung 29
strain bakteri dari sekum (Corrier et al. 1995). Selanjutnya Ziprin dan Deloach (1993) meneliti pada ayam broiler dan petelur dengan menggunakan bakteri normal dari sekum. Hasil penelitian menunjukkan bahwa bakteri Salmonella
menurun meskipun kultur mikroba dari sekum tersebut diberikan tiga hari setelah dilakukan uji tantang terhadap Salmonella typhimurium.
Tabel 1. Mekanisme pengaturan bakteri terhadap mikroflora saluran pencernaan pada unggas
Mekanisme Pengaturan Faktor Pengontrol
Perangsangan proses kekebalan Ig pada usus halus
Modifikasi garam empedu Asam empedu tak berkonjugasi Stimulasi peristalsis Laju lintas
Penggunaan nutrient Kompetisi nutrien atau faktor pertumbuhan
Pemanfaatan nutrient sinergis
Penempelan Kompetisi tempat reseptor
Stimulasi pergantian epitel sel
Pembentukan lingkungan terbatas pH
Asam laktat VFA
Hidrogen sulfida
Modifikasi garam empedu Perangsangan proses kekebalan
Produksi substansi antimikroba Ammonia
Hidrogen peroksida hemolisin
Penggunaan Antibiotik
Kemajuan peternakan ayam broiler sekarang ini menuntut optimalisasi baik dari segi pertumbuhan, perbaikan konversi ransum, dan kepadatan ternak per satuan luas. Meningkatnya kepadatan akan membawa akibat semakin mudahnya ayam akan terkena serangan penyakit. Upaya pencegahan dan pengobatan yang dilakukan sekarang ini masih bergantung pada penggunaan antimikroba, bahkan dapat dikatakan secara ekonomis tidak mungkin mengembangkan ternak ayam broiler komersial tanpa antimikroba. Pada negara-negara maju seperti Masyarakat Uni Eropa penggunaan antibiotik sebagai imbuhan pakan pengaturannya sangat ketat, dan sampai sekarang penggunaan beberapa antibiotik seperti virginiamycin, tylosin, spiramycin, dan zinc bacitracyn telah dilarang. Pelarangan penggunaan antibiotik yang bersifat pencegahan ini akan membawa akibat meningkatnya penggunaan antibiotik yang bersifat terapetik (menggunakan dosis tinggi), lebih banyak ayam yang akan terkena bakteri patogen dan pada akhirnya kerugian ekonomis akan lebih besar (Bouliane 2003).
antibiotik, yaitu bakteri yang dahulunya sensitif menjadi resisten. Resistensi seperti ini dihasilkan dari perubahan gen dan dicapai dengan dua cara yaitu ; (1)mutasi dan seleksi; dan (2) pertukaran gen antara strain dan spesies.
Selanjutnya Levy (2000b) menjelaskan bahwa di Amerika Serikat (AS) lebih dari 40 persen antibiotik yang diproduksi diberikan pada hewan baik untuk pencegahan dan pengobatan infeksi, dan pemacu pertumbuhan. Penggunaan antibiotik sebagai pemacu pertumbuhan kadarnya sangat kecil untuk melawan infeksi dan diberikan dalam jangka waktu yang lama (beberapa minggu sampai bulan). Pemberian dalam jangka waktu yang lama dan dosis rendah ini menjadikan bakteri terseleksi dan menjadi resisten. Environmental Media services (EMS) (2000) menjelaskan bahwa bakteri Salmonella umum ditemukan pada produk ternak (daging dan telur) dan di AS dilaporkan infeksi Salmonella
pada manusia lebih dari 40.000 kasus setiap tahun. Selain itu ditemukan pula strain Salmonella DT-104 yang resisten terhadap lima antimikroba: ampicillin, chloramphenic, streptomycin, sulfonamide, dan tetrasiklin.
Sistem Kekebalan Tubuh (Imunitas)
spesifik. Ada dua jenis mekanisme efektor yang menengahi respon imun spesifik: (1) imunitas humoral, yaitu yang diperantarai oleh produk sel jaringan limfosit yang disebut antibodi, dan (2) imunitas seluler, yaitu yang diperantarai oleh limfosit sendiri yang tersensititasi secara spesifik (Belanti 1993).
Secara garis besar kekebalan yang diperoleh hewan dapat terjadi secara alami dan buatan. Kekebalan secara alami mencakup penghalang secara fisik dan fisiologis yang mencegah masuknya agen infeksi seperti kulit, saliva, asam lambung, dan anti bakteri seperti lysozime. Kekebalan alami yang terjadi pada jaringan dan sirkulasi diperantarai sel efektor yang disebut fagosit dan sel “natural killer (NK)”. Selain itu ada juga protein komplemen darah yang mendukung fagositosis dan melisiskan patogen. Kekebalan secara buatan biasanya diperoleh secara aktif melalui infeksi alami atau dengan vaksinasi. Kekebalannya akan berkembang setelah beberapa hari atau minggu setelah pemaparan dan diperantarai oleh limfosit (Decker 2000).
Mannan Binding Lectin (MBL)
Sistem komplemen merupakan salah satu kekebalan yang bersifat alami dan mencakup rangkaian protein yang bersirkulasi dalam darah. Protein tersebut bersirkulasi dalam bentuk inaktif, tetapi sebagai respons terhadap pengenalan komponen molekul mikroba akan menjadi aktif , dan bekerja dalam rangkaian aliran dalam bentuk ikatan satu protein yang menyokong ikatan protein selanjutnya. Ada tiga jalur sistem komplemen yang terjadi yaitu melalui jalur komplenen klasik; jalur komplemen alternatif, dan jalur lektin (Kaiser 2002).
Jalur Klasik Jalur Lektin Jalur Alternatif
Kompleks Antigen- Permukaan Permukaan Antibodi mikroba mikroba
C1q MBL C3b
MASP-1
C1r MASP-2
C1s
C4 C4
C2 C2
C3 C3b
Gambar 3 Tiga jalur aktivasi komplemen (Laursen dan Nielsen 2000).
Jalur komplemen klasik diaktifkan melalui kompleks imun, sementara jalur lektin diaktifkan oleh karbohidrat dari permukaan sel mikroba. Jalur alternatif diaktifkan oleh beragam campuran dan permukaan sel yang terkait dengan pengaturan dan pembentukan alternatif C3 convertase. Keseluruhan jalur akan mengaktifkan komponen pusat yaitu C3 menjadi C3b yang akan berikatan secara kovalen dengan permukaan mikroba dan memediasi fungsi efektor komplemen (Laursen dan Nielsen 2000).
Gambar 4 Aktivasi komplemen melalui jalur lektin (Medzhitov dan Janeway 2000).
Aktivasi komplemen melalui jalur lektin dimediasi oleh mannosa binding lectin (MBL) yang merupakan reseptor spesifik dari karbohidrat mikroba. MBL berasosiasi dengan serin protease MBL-associated protease I dan 2 (MASP1 dan MASP2). Ikatan MBL dengan ikatan mikroba mengaktifkan protease, dan terjadi peregangan komponen komplemen C2 dan C4, produknya berupa C2a dan C4b dan membentuk C3 konvertase yang memprakarsai komplemen dengan pemecahan protein C3. Kompleks MBL dan lektin dan fungsi protease sama dengan kompleks C1 dari komplemen klasik (Medzhitov dan Janeway 2000).
utama pertahanan adalah IgA, dan disekresikan ke seluruh permukaan mukosa tubuh dan memainkan peranan penting dalam mekanisme pertahanan terhadap mikroorganisme yang masuk.
Mannan Oligosasakarida (MOS)
Sumber Mannanoligosakarida (MOS)
MOS dapat diperoleh dari beberapa sumber yaitu dari fungi (dinding sel fungi) dan dari sumber lain seperti dinding sel tanaman atau berupa limbah pertanian. Uraian berikut ini menjelaskan mengenai beberapa sumber yang dapat digunakan untuk memproduksi MOS. Faktor yang perlu diperhatikan dalam memproduksi MOS yaitu kandungan komponen gula mannosa yang dikandung sumber bahan yang akan diekstraksi.
Hasil penelitian Tafsin (2000) menunjukkan bahwa Dinding sel fungi
Penicillium sp didominasi oleh mannosa. Urutan selengkapnya komponen gula dari dinding sel Penicillium sp adalah tersusun atas glukosa; mannosa; galaktosa; asam glukoronat; arabinosa : dan glukosamin dengan perbandingan konsentrasi berturut-turut 119 ; 169; 11; 15; 1; 1 . Penelitian lanjutan mengenai derajat antigenisitas dengan mengukur produksi antibodi poliklonal dengan menggunakan metode ELISA (Enzymes Link Immunosorbant Assay) menunjukkan bahwa baik glikoprotein maupun polisakarida yang diekstraksi dari miselium fungi tersebut bersifat imunogenik. Hal tersebut dapat dilihat dari nilai absorbansi yang lebih tinggi (300-400 persen) dibandingkan dengan hewan kontrol. Percobaan tersebut menggunakan hewan kelinci sebagai model percobaannya.
Bungkil inti sawit tinggi akan serat kasar yakni berkisar antara 13.0– 15.7% dan ADF (Acid Detergent Fiber) 31.7% (Daud et al. 1993). Total dinding sel terbanyak adalah mannosa sebesar 56.4%. Formasi linier mannan berbentuk
Tabel 2 Persentase komponen gula netral pada bungkil inti sawit (BIS)
Komponen gula netral Persentase dari dinding sel (%)
Mannosa 56.4 ± 7.0
Selulosa 11.6 ± 0.7
Xylosa 3.7 ± 0.1
Galaktosa 1.4 ± 0.2
Total 73.1 ± 7.2
Sumber : Daud et al. (1993).
Turner et al. (2000) menyebutkan bahwa sumber yang paling umum yang dapat digunakan untuk menghasilkan MOS adalah dari Saccharomycescerevisae. Hal tersebut dipakai karena kandungan gula mannosanya yang tinggi yang mencapai 45% dari keseluruhan dinding selnya. Sumber lain yaitu CFNP TAP Review (2002) menyebutkan kandungannnya dapat mencapai 50 persen.
Ishihara et al. (2000) menjelaskan sumber MOS dari tumbuhan yaitu dari guar gum (Cyamoposis tetragonolobus). Guar gum diperoleh dari biji guar yang selanjutnya diproses dengan menggunakan enzim β-D-mannanase untuk memecah ikatan tulang punggung (backbone) , dan mengandung galaktomannan dengan bobot molekul 20.000 Da.
Peranan MOS sebagai Pengendali Salmonella.
Polisakarida dari nilai nutrisinya secara umum dikenal sebagai penyumbang sumber energi untuk ternak disamping sebagai bagian integral struktur seperti asam nukleat, glikolipid dan glikoprotein . Devegowda et al.
ayam yang diberi MOS. Selain itu MOS juga mempunyai fungsi untuk mengikat mikotoksin seperti zearalenone dan aflatoksin (Lyons 1997; Power 1997).
Pendekatan baru untuk mencegah infeksi mikroba ditemukan dengan diketahuinya pentingnya proses penempelan pada saluran pencernaan. Diketahui bahwa fimbriae tipe 1 yang sensitif terhadap mannosa berperan dalam menempelnya patogen, dengan demikian mannosa dapat menghambat proses penempelan mikroba merugikan pada saluran pencernaan. Kemampuan lain dari MOS adalah dapat merangsang sistem kekebalan dan efek ini juga berperan dalam melawan bakteri Salmonella (Spring 1997).
Mekanisme kerja yang terjadi dari pencegahan kolonisasi bakteri merugikan oleh MOS dapat dilihat pada Gambar 5 berikut :
a b
Gambar 5 Mekanisme kerja MOS mencegah kolonisasi bakteri merugikan (CFNP Technical Advisory Panel (TAP) Review 2002).
Gambar 5a menjelaskan mekanisme terjadinya kolonisasi bakteri pada saluran pencernaan, sedangkan Gambar 5b menunjukkan efek penggunaan karbohidrat seperti MOS dalam mencegah kolonisasi bakteri yang merugikan. Karbohidrat pada permukaan sel merupakan faktor utama yang bertanggung jawab dalam pengenalan oleh sel. Bakteri mempunyai lektin pada permukaan selnya yang dapat mengenal gula spesifik dan membiarkan sel untuk menempel pada gula tersebut. Gula tersebut dapat ditemukan pada permukaaan sel epitel. Pengikatan Salmonella, E. coli, dan Vibrio cholera dimediasi oleh substansi seperti lektin yang spesifik terhadap mannosa dari permukaan sel bakteri. MOS akhirnya dapat mencegah penempelan bakteri patogen pada usus halus sehingga
Karbohidrat
Lektin Bakteri
tidak terjadi kolonisasi yang dapat menimbulkan penyakit, dan dapat menjadi sumber makanan terhadap bakteri lain yang menguntungkan (CFNP TAP review 2002).
Turner et al. (2000) menunjukkan adanya efek yang menguntungkan dari MOS terhadap kesehatan pada saluran pencernaan dan sistem kekebalan. Sebagai contoh terhadap Salmonella thypimurium invitro akan dihambat dengan adanya mannosa, dan selanjutnya setelah dilakukan pemberian melalui air minum pada ayam ternyata menurunkan kolonisasi S. thypimurium pada sekumnya. Selanjutnya pada ternak kalkun, ternyata penggunaan MOS akan meningkatkan level plasma IgG dan konsentrasi IgA pada cairan empedu.
Ishihara et al. (2000) melakukan penelitian MOS yang diperoleh dari Guar gum dan mengamati efeknya terhadap Salmonella enteridis (SE) pada ayam broiler dan ayam petelur. Hasil penelitian menunjukkan penambahan MOS secara oral menurunkan adanya SE pada organ, Peningkatan ekskresi SE pada feses, menurunkan titer antibodi terhadap SE pada serum. Efek lain yang ditimbulkan yaitu meningkatkan jumlah bakteri Bifidobacterium spp dan
Lactobacillus spp. Keadaan yang sama ditemui pada ayam petelur dengan menurunnya SE baik pada permukaan kerabang, putih dan kuning telur. Kadar optimum MOS pada penelitian ini yaitu 0.025% dari ransum.
Spring et al. (2000) meneliti efek MOS pada ayam broiler menemukan bahwa MOS dapat mengaglutinasikan lima dari tujuh strain E.coli dan 7 dari 10 strain Salmonella thypimurium dan Salmonella enteridis. Sedangkan terhadap strain Salmonella pullorum, Salmonella choleraesuis, dan Campylobacter tidak terjadi agglutinasi. Selanjutnya dilakukan uji tantang terhadap bakteri Salmonella
thypimurium 29E sebanyak 104 cfu pada umur anak ayam tiga hari. Kadar MOS
Tabel 3 Perbandingan penggunaan antibiotik dengan MOS
Antibiotik Mannanoligosakarida (MOS)
•Menghambat viabilitas dan proliferasi beberapa mikroflora patogen dan mikroba pencernaan yang menguntungkan
• Mencegah penempelan dan kolonisasi beberapa bakteri pada saluran pencernaan, tapi tidak membunuhnya
•Mempunyai aktivitas spektrum luas terhadap bakteri gram positif
• Mempunyai aktivitas spesifik terhadap bakteri gram negatif yang mempunyai Fimbriae tipe I yang spesifik terhadap mannose
•Menurunkan efek merugikan dari metabolit mikroba dengan menekan mikrofloranya
• Menurunkan efek merugikan dari metabolit mikroba dengan meningkatkan profil mikroflora
•Menurunkan stress imunologis dengan cara menurunkan masuknya mikroba pada saluran pencernaan
• Merangsang sistem kekebalan dengan jalan berlaku seperti antigen mikroba yang bersifat non patogen
•Penggunaan secara jangka panjang dan tidak tepat dapat menghasilkan patogen yang resisten
• Tidak menghasilkan bakteri yang resiten baik terhadap antibiotik atau MOS
•Memberikan keuntungan pada inang untuk menyerap zat makanan penting dengan jalan menekan kompetisi dari mikroba saluran cerna.
• Memberikan keuntungan pada inang untuk menyerap zat makanan penting dengan jalan memperbaiki kesehatan ‘brush borders’.
•Memperbaiki ketersedian Energi Netto (EN) untuk produksi dengan jalan memperbaiki Energi Metabolis (EM) pakan dan menurunkan kebutuhan energi tubuh untuk hidup pokok.
• Memperbaiki ketersedian Energi Netto (EN) untuk produksi dengan jalan memperbaiki Energi Metabolis (EM) pakan.
•Secara konsisten memperbaiki penampilan pertumbuhan pada kondisi lingkungan yang berbeda.
• Memperbaiki penampilan pertumbuhan terutama ketika dilakukan uji tantang dengan patogen dari saluran pencernaan.
•Menurunkan perlindungan mukosa yang non spesifik dengan jalan menurunkan kolonisasi bakteri yang menguntungkan (sebagai contoh ; laktobasilus)
Peranan MOS untuk Meningkatkan Sistem Kekebalan Tubuh.
Komponen gula mannosa dari MOS mempengaruhi sistem kekebalan dengan jalan merangsang sekresi protein pengikat mannosa, dan dikenal pula dengan istilah Mannosa binding lectin (MBL). MBL disintesa di hati dan disekresikan kedalam serum sebagi komponen dengan fase respon yang bersifat akut. MBL dapat berikatan dengan karbohidrat dari dinding sel bakteri, ragi atau virus. (Medzhitov dan Janeway 2000).
Selanjutnya Devegowda et al. (1994) menyebutkan bahwa MOS diturunkan dari dinding sel ragi Saccharomycescerevisiae dan mempunyai derajat antigenisitas yang tinggi yang disebabkan adanya komponen mannan dan glukan. Komponen gula mannosa dari MOS mempengaruhi sistem kekebalan dengan jalan merangsang sekresi protein pengikat mannosa dari hati yang mengikat kapsul bakteri yang masuk dan merangsang sistem komplemen. Studi lainnya menunjukkan bahwa MOS merangsang sistem kekebalan dengan jalan meningkatkan aktivitas fagosit dari makrofage yang dilakukan pada tikus.
Lyons (1996) dan Power (1997) melaporkan penggunaan MOS pada tingkat 1-2 kg/ton pakan akan memperbaiki kekebalan yang ditunjukkan dengan meningkatnya level Ig (Imunoglobulin) dan meningkatkan aktivitas fagosit. Selain itu juga mempunyai fungsi untuk mengikat bahan patogen pada saluran pencernaan (seperti Ecoli dan Salmonella).
3.
EKSTRAK POLISAKARIDA MENGANDUNG MANNAN
DARI BUNGKIL INTI SAWIT
PENDAHULUAN
Karbohidrat dari nilai nutrisinya secara umum dikenal sebagai penyumbang sumber energi untuk ternak disamping sebagai bagian integral struktural seperti asam nukleat, glikolipid dan glikoprotein. Fungsi biologis lainnya dari karbohidrat yaitu dapat memperbaiki sistem kekebalan tubuh dan menghambat kolonisasi bakteri yang merugikan yang ada pada ternak (Devegowda et al. 1997). Beberapa produk banyak dikembangkan sekarang ini mengingat fungsi lain karbohidrat tersebut. Beberapa prebiotik seperti fruktooligosakarida dan inulin berperan dalam memperbaiki kesehatan dengan jalan memodifikasi keseimbangan mikroflora usus (Crittenden 1999) dan secara selektif merangsang pertumbuhan bakteri menguntungkan seperti Lactobacillus
dan Bifidobacteria (Cumming et al. 2001). Karbohidrat spesifik tersebut berfungsi sebagai makanan bagi bakteri yang menguntungkan tersebut (Patterson dan Burkholder 2003).
Jenis karbohidrat lain yang banyak dikembangkan yaitu karbohidrat yang mengandung komponen gula mannosa. Beberapa laporan menyebutkan fungsinya untuk menghambat bakteri merugikan seperti Salmonella (Oyofo 1989), atau sebagai immunostimulan (Sashidara dan Devegowda 2003). Bahan alam yang dikembangkan untuk mendapatkan komponen tersebut dilaporkan diperoleh dari ragi S cerevisiae, dengan produknya yang dikenal dengan nama MOS (mannanoligosakarida) (Turner et al. 2000; White et al. 2002), selanjutnya Ishihara et al. (2000) mendapatkannya dari guar gum dengan menggunakan enzim β-D-mannanase yang menghasilkan galaktomannan dengan berat molekul 20 000 Da, dan produknya disebut ”Partially Hydrolized Guar Gum” (PHGG), dan dilaporkan efektif menghambat Salmonella dan meningkatkan bakteri
Mannan dikatagorikan sebagai polisakarida dan banyak terdapat pada ragi, rumput laut, dan beberapa jenis tanaman (Kennedy dan White 1988a). Mannan dengan komposisi linear (1-4)-β–D-Manp merupakan komponen utama dari dinding sel bungkil kelapa dan bungkil inti sawit (BIS) dan pada bahan makanan lainnya untuk unggas komponen ini terdapat dalam jumlah yang sangat kecil (Carre 2002). Selanjutnya Daud et al. (1993), melaporkan bahwa kandungan mannosa BIS mencapai 56.4% dari total dinding selnya, sedangkan pada serat perasan buahnya menurut Sun et al. (1999) kaya akan glukosa dan xylosa.
BIS merupakan hasil ikutan dari industri pengolahan minyak inti sawit yang ketersediaannya di Indonesia sangat tinggi, dan selama ini penggunaan BIS sebagai bagian pakan untuk ternak. Kandungan β -mannan yang tinggi pada BIS yang tergolong polisakarida bukan pati (NSP: Non Starch Polysaccharides) menjadi salah satu pembatas penggunaan BIS untuk ternak monogastrik. Sundu dan Dingle (2005) melaporkan penggunaan enzim β-mannanase efektif untuk meningkatkan nilai nutrisi BIS. Selanjutnya Sundu et al. (2006) menduga adanya kesamaan fungsi mannan dari BIS dengan MOS komersial sehingga berpengaruh terhadap kesehatan unggas.
Informasi proses ekstraksi untuk mendapatkan polisakarida mannan dari BIS masih terbatas, sedangkan potensi untuk pengembangannya sangat besar. Penelitian ini mencoba untuk mengkaji proses dan mengkarakterisasi ekstrak BIS yang dihasilkan. Produk yang dihasilkan pada tahapan ini selanjutnya akan diuji kemampuannya sebagai antimikroba dan immunostimulan untuk ternak unggas.
Tujuan dan Manfaat Penelitian
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain bungkil inti sawit (BIS) yang diperoleh dari PT Indofeed Bogor. Sebelum dilakukan proses ekstraksi, BIS terlebih dahulu disaring dengan menggunakan penyaring berdiameter 2 mm yang bertujuan memisahkan sisa batok (endokaprium) dari bungkil inti sawitnya.
Alat yang digunakan dalam mengekstrak BIS antara lain Mortar Grinder; Autoklaf; Sentrifuge; Rotary Evaporator; dan Freeze-dryer. Proses separasi dilakukan dengan menggunakan kolom kromatografi filtrasi gel (16 mm x 900 mm) yang diisi Sephadex G-50 dan dilengkapi dengan Fraction Collector. Pengukuran kandungan total gula menggunakan spektrofotometer, sedangkan analisis komponen gula menggunakan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) yang dilengkapi kolom P-NH2 Carbohydrate (30 x 1cm).
Metode Penelitian Proses Ekstraksi BIS
Isolasi polisakarida mannan dari BIS dilakukan dengan cara ekstraksi menggunakan air panas. Proses ini dimulai dengan menggiling BIS menggunakan mortar grinder (Retsch KM1) selama 30 menit yang dilanjutkan dengan pemanasan menggunakan autoklaf (121 oC; 15 menit). Tahapan selanjutnya yaitu proses pemisahan menggunakan sentrifugasi (12 000 G; 15 menit), dan supernatannya dikoleksi. Supernatan yang diperoleh dipekatkan dengan menggunakan alat rotary eveporator (Yamato RE50) dan dilanjutkan dengan pengeringan menggunakan alat freeze dryer (Yamato DC 56A).
Kandungan Total Gula
Kromatografi Filtrasi Gel
Kromatografi filtrasi gel menggunakan kolom mengandung gel Sephadex G-50 (16x800 mm), dan dilengkapi fraction collector dengan volume setiap fraksi sebanyak 10 ml. Sampel yang diinjeksikan sebanyak 0.5 ml dan laju alir yang digunakan adalah 0.5 ml/menit. Fraksi yang diperoleh selanjutnya diukur kandungan total gulanya.
Analisis Komponen Gula
Pembacaan kimia polisakarida dilakukan dengan mengidentifikasi komponen monosakarida dengan menggunakan alat HPLC (High Performance Liquid Chromatography) yang dilengkapi kolom P-NH2 Carbohydrate. Kecepatan alir yang digunakan yaitu 0.5 ml/menit dengan fase gerak menggunakan campuran 60% acetonitril:40% air pada temperatur ruang (25-28oC). Sampel sebelum diinjeksikan ke kolom, dihidrolisis menggunakan 2 M TFA (Trifluoro Acetic Acid) pada suhu 105oC selama 3 jam dalam ampul dan dinetralkan menggunakan ethyl acetate (Ramli et al. 1994).
Rancangan Penelitian
Perlakuan ekstraksi yang diuji adalah penggunaan beragam pelarut yang dikombinasikan dengan penggunaan kaca pada saat proses grinding. Perbandingan jumlah pelarut yang digunakan yaitu 100 g BIS menggunakan 500 ml pelarut (rasio 1:5 w/v). Peubah yang diukur pada tahapan ini adalah kandungan total gula terekstrak. Perlakuan selengkapnya yang diuji adalah :
P1 = Akuades P2 = NaOH 0.05 N P3 = NaOH 0.1 N P4 = Akuades + Kaca P5 = NaOH 0.05 N + Kaca P6 = NaOH 0.1 N + Kaca.
HASIL
Kandungan Total Gula Terekstrak
Hasil pengamatan terhadap kandungan total gula yang dihasilkan dari 100 g BIS disajikan pada tabel berikut :
Tabel 4 Pengaruh cara ekstraksi terhadap kandungan total gula yang dihasilkan dari 100 g BIS
Perlakuan Total Gula (mg) Mannosa yang dihasilkan (%)* Akuades 1 353.6 c ± 119.8
keterangan : superskrip dengan huruf berbeda kearah kolom menunjukkan perbedaan nyata (p<0.05).
* didasarkan pada kandungan mannosa (Tabel 5) dan total mannan dari BIS (28.5%) menurut Yokomizo (2005).
Tabel di atas menunjukkan bahwa perlakuan memberikan pengaruh yang nyata (p<0.05) terhadap kandungan total gula yang dihasilkan. Penggunaan kaca dalam proses ekstraksi meningkatkan kandungan total gula dibandingkan tanpa menggunakan kaca yang ditunjukan pada penggunaan pelarut akuades dan NaOH 0.05 N. Kandungan total gula tertinggi ditunjukkan oleh perlakuan pelarut NaOH 0.05 N dengan menggunakan kaca (3 168 mg/100 g BIS) dan diikuti pelarut akuades + kaca (2 114 mg). Penggunaan NaOH dengan konsentrasi 0.1 N ternyata menunjukkan hasil total gula yang lebih rendah dibandingkan pelarut lainnya. Hasil tersebut menunjukkan bahwa pada konsentrasi tersebut, gula yang terlarut dari proses ekstraksi menjadi rusak akibat terlalu kuatnya konsentrasi NaOH.
menunjukkan persentase yang dihasilkan dari setiap ektraksi berdasarkan total mannan yang ada dalam BIS berkisar antara 0.15-7.58%. Hasil cukup tinggi ditunjukkan oleh perlakuan penggunaan kaca dengan menggunakan pelarut akuades dan NaOH 0.05 N yaitu berturut turut 5.49 dan 7.58%.
Analisis Komponen Gula
Hasil analisis terhadap komponen gula menunjukkan bahwa komponen gula ekstrak BIS tersusun atas galaktosa, glukosa, dan mannosa, dan gambaran beberapa kromatogram disajikan pada Gambar 6.
standar (a) (b) (c)
Gambar 6 Kromatogram untuk perlakuan ekstraksi menggunakan kaca dengan pelarut Akuades (a); NaOH 0.05 N (b); NaOH 0.1 N (c).
Hasil analisis terhadap kandungan dari tiap komponen gula disajikan pada Tabel 5. Tabel tersebut menunjukkan bahwa komponen gula ekstrak BIS tersusun atas galaktosa, glukosa, dan mannosa. Komponen utama monosakarida ekstrak BIS adalah berupa mannosa dan diikuti oleh galaktosa dan glukosa. Perlakuan ekstraksi ternyata menunjukkan hasil yang berbeda terhadap komponen gula yang terekstrak. Secara umum tabel di atas menunjukkan bahwa penggunaan kaca dapat merombak dinding sel sehingga komponen mannosa lebih mudah untuk
larut. Penggunaan pelarut NaOH 0.1 N selain menghasilkan kandungan total gula yang lebih rendah, juga menunjukkan komponen mannosa yang paling rendah dibanding pelarut akuades atau NaOH 0.05 N.
Tabel 5 Pengaruh cara ekstraksi terhadap kandungan dan rasio komponen gula yang dideteksi dengan HPLC yang dilengkapi Carbohydrate column
Perlakuan Komponen gula (ppm)
Galaktosa Glukosa Mannosa Mannosa (%)
Akuades 664.2 51.65 786.3 52.35
keterangan : angka dalam kurung menunjukkan rasio komponen gula terhadap glukosa
Komponen gula dominan yang terdeteksi dengan HPLC adalah berupa mannosa dan galaktosa, hal tersebut mengindikasikan bahwa ekstrak BIS adalah berupa galaktomannan. Rasio komponen gula antara mannosa dengan galaktosa pada perlakuan tanpa menggunakan kaca dengan pelarut akuades dan NaOH 0.05 N dan NaOH 0.1 N berturut turut 1.18:1; 1.10:1 dan 0.07:1. Rasio komponen gula pada perlakuan pelarut akuades dan NaOH 0.05 N mendekati rasio 1:1. Selanjutnya pada perlakuan ekstraksi menggunakan kaca, rasio komponen gula antara mannosa dengan galaktosa dengan pelarut akuades dan NaOH 0.05 N dan NaOH 0.1 N berturut turut 3.33:1; 2.54:1; dan 1.87:1. Rasio komponen gula pada perlakuan pelarut akuades dan NaOH 0.05 N mendekati angka 3 :1.
persen. Kandungan mannosa tertinggi ditunjukkan oleh penggunaan pelarut akuades yang diekstrak menggunakan pecahan kaca. Kandungan tersebut mencapai 74 persen dari total gula yang terekstrak.
Pemisahan dengan Kromatografi Filtrasi Gel
Gambar 7 menunjukkan bahwa ekstrak bungkil inti sawit dapat terpisahkan secara baik dalam gel sephadex G-50.
Gambar 7 Pemisahan polisakarida dalam sephadex G-50 (16x800 mm) pada perlakuan pelarut akuades .
Perlakuan ekstraksi menggunakan akuades tanpa menggunakan kaca menunjukkan bahwa komponen polisakarida mulai muncul pada fraksi ke 7 dan berakhir pada fraksi ke 37. Komponen tersebut terbagi menjadi dua peak besar.
Peak pertama mulai muncul pada fraksi ke 7-15, sedangkan peak kedua muncul pada fraksi ke 19-37.
Gambaran pemisahan pada perlakuan pelarut akuades dengan menggunakan kaca pada Gambar 8 menunjukkan hasil yang berbeda dibandingkan perlakuan tanpa kaca. Komponen polisakarida mulai muncul pada fraksi ke 7 dan berakhir pada fraksi ke 79. Peak dominan yang muncul hampir sama dengan perlakuan akuades tanpa menggunakan kaca, yaitu terbagi menjadi
Gambar 8 Pemisahan polisakarida dalam sephadex G-50 (16x800 mm) pada perlakuan pelarut akuades + kaca .
dua peak besar. Peak pertama muncul pada fraksi ke 7-19 dan peak kedua muncul pada fraksi ke 19-38, dan selanjutnya empat buah peak kecil ditemukan antara fraksi ke 38-80. Penggunaan kaca menghasilkan bobot molekul yang lebih beragam dibandingkan tanpa menggunakan kaca, dan menunjukkan bahwa proses pemotongan dinding sel bungkil inti sawit menjadi lebih efektif
Gambar 9 menunjukkan pemisahan polisakarida perlakuan pelarut NaOH 0.1 N dalam sephadex G-50.
Gambar 9 Pemisahan polisakarida dalam sephadex G-50 (16x800 mm) pada perlakuan pelarut NaOH 0.1N + kaca .
Kandungan total gula mulai terdeteksi pada fraksi ke 3-60. Peak dominan ditemukan pada fraksi ke 13-19, dan peak kecil pada fraksi ke 3-13. Selanjutnya pada fraksi ke 31-60 masih terdeteksi adanya kandungan total gula, akan tetapi tidak dapat terpisahkan secara baik dalam sephadex G-50. Hasil tersebut mengindikasikan bahwa ekstraksi menggunakan NaOH juga menghasilkan bobot molekul yang jauh lebih kecil dibandingkan pelarut akuades.
Secara umum ekstrak bungkil inti sawit yang dihasilkan didominasi oleh dua peak yang terkoleksi pada fraksi awal dalam sephadex G-50. Hasil tersebut menunjukkan bahwa produk tersebut didominasi oleh bobot molekul yang besar dan mengindikasikan masih dalam bentuk polisakarida.
PEMBAHASAN
Kandungan total gula yang dihasilkan dari setiap 100 g BIS berkisar antara 1218-3168 mg. Beberapa peneliti lain seperti Takegawa et al. (1997) melaporkan kandungan total gula yang diperoleh dari ekstraksi 100 g miselium Fusarium sp
berkisar antara 57-284 mg dengan rataan 135.8 mg. Selanjutnya Tafsin (2000) melaporkan kandungan total gula yang dihasilkan dari 100 g miselium fungi
Penicillium sp dan Cunninghamella sp berturut-turut 300.9 mg dan 272.0 mg. Jumlah total gula yang diperoleh dari BIS jauh lebih tinggi dibandingkan dengan hasil penelitian tersebut.
menunjukkan efektifnya penggunaan enzim untuk memecah ikatan mannan dari BIS, tetapi beberapa kekurangan juga dimiliki oleh metode tersebut yaitu kondisi yang dibutuhkan untuk menghasilkan mannosa yang tinggi memerlukan waktu yang cukup lama (mencapai 72 jam), dan membutuhkan kondisi reaktor tertentu (pada temperatur 60oC) dan selain itu harga enzimnya cukup tinggi. Kajian secara ekonomis tampaknya masih diperlukan untuk mencari metode yang paling tepat, atau merubah metode dengan jalan mengkombinasikan perlakuan baik secara fisik dan enzim untuk mendapatkan komponen mannosa dari BIS yang paling efektif dan efisien.
Perlakuan dengan menggunakan kaca yang dikombinasikan dengan konsentrasi NaOH yang berbeda menunjukkan bahwa terjadi peningkatan komponen gula galaktosa terekstrak seiring dengan meningkatnya konsentrasi perlakuan NaOH yang diberikan. Keadaan ini dapat diartikan bahwa ikatan galaktosa pada polisakarida BIS mempunyai ikatan kimia yang lebih labil dari ikatan mannosa. Penggunaan pelarut NaOH sampai tingkat 0.05 N menunjukkan hasil total gula dan persentase mannosa yang lebih baik dibandingkan perlakuan lainnya. Hasil tersebut menunjukkan terjadinya proses hidrolisis sehingga lebih mudah terekstrak. Hasil sebaliknya ditunjukkan pada penggunaan NaOH 0.1 N yang ternyata menghasilkan total gula yang lebih rendah dibandingkan penggunaan pelarut akuades atau NaOH 0.05 N. White dan Kennedy (1988) menjelaskan bahwa penggunaan alkali akan menimbulkan proses hidrolisis dari gugus ester yang berikatan dengan gugus hidroksil dan karboksilat dari monosakarida. Penggunaan alkali dapat menimbulkan reaksi lebih lanjut pada gugus pereduksi (reducing end) dari polisakarida yang diistilahkan dengan ”peeling reaction”. Tampaknya reaksi tersebut yang menyebabkan penggunaan NaOH 0.1 N menghasilkan total gula yang lebih rendah, dan juga menjelaskan terdeteksinya komponen gula tetapi tidak dapat terpisahkan secara baik pada gel sephadex G-50 ( Gambar 10) yaitu pada fraksi ke 31-60.
D-Manp. Hasil tersebut mengindikasikan bahwa komponen mannan merupakan rantai utama (back bone) dari struktur dinding sel BIS. Komponen gula lainnya yang terdeteksi adalah galaktosa dan sejumlah kecil glukosa (kurang dari 5%).
Perlakuan beragam ekstraksi ternyata menghasilkan rasio komponen galaktosa : mannosa yang beragam pula. Penggunaan konsentrasi NaOH yang semakin tinggi menghasilkan komponen galaktosa terekstrak yang lebih tinggi. Hal tersebut diduga karena ikatan galaktosa merupakan rantai sisi yang lebih mudah terekstrak karena ada dalam bentuk ikatan -(1→6). Rasio yang hampir sama ditunjukkan pada perlakuan penggunaan kaca dengan menggunakan pelarut akuades atau NaOH 0.05 N. Rasio antara komponen galaktosa : mannosa pada perlakuan tersebut mendekati angka 1:3. Kennedy dan White (1988b) menyebutkan bahwa struktur polisakarida mannan bervariasi tergantung sumber bahan. Rasio komponen monosakarida antara galaktosa : mannosa berkisar antara 1:1 sampai 1:5, akan tetapi keseluruhannya mempunyai kesamaan struktur yaitu ikatan (1→4) βDmannopyranosil dengan rantai cabang berisi gugus tunggal -D-galactopyranosil dengan ikatan (1→6). Gambaran struktur mannan dari guaran disajikan pada gambar berikut :
→4)- β-D-manp-(1→4)- β-D-manp-(1→4)- β-D-manp-(1→4)- β-D-manp-(1→4)-(1→
6 6
↑ ↑
-D-galp -D-galp
Gambar 10 Struktur mannan dari guaran (Kennedy dan White, 1988b).
Gambar 10 menunjukkan struktur mannan dari guaran dengan rasio komponen galaktosa: mannnosa yaitu 1:2. Struktur mannan dari BIS tampaknya hampir sama dengan dari guaran, hanya rasio komponen gulanya berbeda, dan dari penelitian ini rasio komponennya mendekati angka 1:3.
berupa polisakarida. Penggunaan kaca dan NaOH menunjukkan sebaran berat molekul yang lebih beragam dibandingkan penggunaan pelarut akuades tanpa kaca. Selanjutnya pada penggunaan NaOH 0.1N ditemukan peak yang tidak dapat terpisahkan secara baik dalam sephadex G-50 yang mengindikasikan komponen tersebut mempunyai bobot molekul yang rendah.
Sumber yang paling umum yang dapat digunakan untuk menghasilkan MOS adalah dari Saccharomyces cerevisiae. Hal tersebut dipakai karena kandungan gula mannosanya yang tinggi yang mencapai 45% dari keseluruhan dinding selnya (Turner et al. 2000) Sumber lain menyebutkan kandungannnya dapat mencapai 50 % (CFNP TAP Review 2002). Struktur polisakarida S cerevisiae sebagai sumber MOS mempunyai rantai utama berupa α-(1-6) dan mempunyai rantai sisi berupa oligosakarida α-Man(1-2)- α-Man dan α-Man(1-3 α-Man(1-2) α-Man (Carpenter dan Nepogodiev 2005). Tampaknya struktur tersebut menjadi kelebihan S cerevisiae dibandingkan BIS karena relatif lebih mudah diekstrak, tetapi salah satu kekurangannya adalah memerlukan waktu dan substrat untuk proses kulturnya agar diperoleh sel ragi tersebut.
KESIMPULAN
1. Kandungan total gula terekstrak dari 100 g BIS berkisar antara 1 218 - 3 168 mg, sedangkan jumlah mannosa terekstrak dari total mannan yang ada dalam BIS berkisar antara 0.15 -7.58%. Penggunaan pecahan kaca dalam proses ekstraksi menghasilkan rendemen mannosa yang lebih tinggi dibandingkan tanpa menggunakan kaca, dan jumlah mannosa yang dihasilkan dari total mannan BIS pada perlakuan tersebut sebanyak 5.49 dan 7.58% yang dilakukan berturut-turut pada pelarut menggunakan akuades dan NaOH 0.05 N.
2. Penggunaan kaca dalam proses ekstraksi menghasilkan bobot molekul yang lebih beragam dibandingkan perlakuan tanpa kaca. Peak dominan yang muncul dalam sephadex G-50 mengindikasikan ekstrak tersebut didominasi oleh polisakarida.
