TAMPILAN PULASAN IMUNOHISTOKIMIA MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9) PADA UNDIFFERENTIATED CARCINOMA NASOFARING
TIPE REGAUD DAN TIPE SCHMINCKE
T E S I S
HERZA PIASISKA NIM. 077108002
PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS I DEPARTEMEN PATOLOGI ANATOMI
FAKULTAS KEDOKTERAN USU/RSUP H. ADAM MALIK MEDAN
TAMPILAN PULASAN IMUNOHISTOKIMIA MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9) PADA UNDIFFERENTIATED CARCINOMA NASOFARING
TIPE REGAUD DAN TIPE SCHMINCKE
T E S I S
Untuk Memperoleh Gelar Spesialis Patologi Anatomi Dalam Program Pendidikan Dokter Spesialis I Pada Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara
HERZA PIASISKA NIM. 077108002
PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS I DEPARTEMEN PATOLOGI ANATOMI
Judul Tesis : Tampilan Pulasan Imunohistokimia Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) Pada Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Tipe Regaud Dan Tipe Schmincke
Nama : Herza Piasiska
NIM : 077108002
Program Studi : Program Pendidikan Dokter Spesialis Patologi Anatomi
TESIS INI TELAH DIPERIKSA DAN DISETUJUI OLEH :
PEMBIMBING I
Prof. Dr. H. M. Nadjib Dahlan Lubis, Sp.PA(K) NIP. 130 318 033
PEMBIMBING II
Dr. H. Soekimin, Sp.PA NIP. 19480801 198003 1 002
PERNYATAAN
TAMPILAN PULASAN IMUNOHISTOKIMIA
MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9) PADA
UNDIFFERENTIATEDCARCINOMA NASOFARING
TIPE REGAUD DAN SCHMINCKE
TESIS
Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam tesis ini tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.
Medan, 12 Mei 2011
LEMBAR PANITIA UJIAN
Judul Tesis : Tampilan Pulasan Imunohistokimia Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) Pada Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Tipe Regaud dan Tipe Schmincke
Telah diuji pada
Hari/ Tanggal : Selasa, 10 Mei 2011
Pembimbing : Prof. Dr. H. M. Nadjib Dahlan Lubis, SpPA(K)
Dr. H. Soekimin, SpPA
Penguji : Dr. H. Joko S.Lukito, Sp.PA
UCAPAN TERIMA KASIH
Alhamdulillah, puji syukur kehadirat Allah SWT atas berkat dan rahmatNya sehingga Penulis dapat menyelesaikan penelitian dengan judul “ Tampilan Pulasan Imunohistokimia Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) Pada Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Tipe Regaud dan Tipe Schmincke”. Tesis ini merupakan salah satu syarat yang harus dilaksanakan Penulis dalam rangka memenuhi persyaratan untuk meraih gelar keahlian dalam Program Pendidikan Dokter Spesialis Patologi Anatomi pada Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara.
Dengan selesainya tesis ini, perkenankanlah Penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya dan penghargaan yang setinggi-tingginya kepada :
Rektor Universitas Sumatera Utara, Prof. Dr. Syahril Pasaribu, DTM&H, Sp.A(K) dan seluruh jajarannya yang telah memberi kesempatan kepada Penulis untuk mengikuti pendidikan pada Program Pendidikan Dokter Spesialis Patologi Anatomi di Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara.
Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara, Prof. Dr. Gontar A. Siregar, Sp.PD(KGEH) atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada Penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan Pendidikan Dokter Spesialis Patologi Anatomi di Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara.
(pembimbing III), yang dengan penuh perhatian dan kesabaran telah mengorbankan waktu untuk memberikan dorongan, bimbingan, semangat, bantuan serta sara-saran yang bermanfaat kepada Penulis, mulai dari persiapan penelitian sampai pada penyelesaian tesis ini.
Dr. Sumondang M. Pardede, Sp.PA, Dr. H. Soekimin, Sp.PA, Prof. Dr. Nadjib Dahlan Lubis, Sp.PA(K) dan Prof. Dr. Gani W Tambunan, Sp.PA(K) yang telah memberi izin kepada Penulis untuk untuk mengambil data dan sampel pada laboratorium Patologi Anatomi yang dipimpin.
Dr. H. Joko S. Lukito,Sp.PA dan Dr. H. Delyuzar,Sp.PA (K) yang telah bersedia untuk menguji tesis penelitian saya.
Dr. T. Ibnu Alferraly, Sp.PA selaku Ketua Program Studi Patologi Anatomi FK USU atas segala bimbingan, masukan dan dorongannya selama Penulis menjalankan pendidikan Dokter Spesialis di Departemen Patologi Anatomi FK USU. Tidak lupa saya mengucapkan terima kasih kepada Dr. Hj. Kemala Intan, MPd; Dr. Betty, SpPA; Dr. Lidya Imelda Laksmi, SpPA dan Dr. Jessy Chrestella, SpPA sebagai staf pengajar di Departemen Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran USU yang telah membantu Penulis dalam menyelesaikan tesis ini.
H. Adam Malik Medan. Terima kasih atas kerja sama dan saling pengertian yang diberikan sehingga penulis dapat sampai pada akhir program pendidikan ini.
Persembahan terima kasih tulus, rasa hormat dan sembah sujud kepada ayahanda dan ibunda tercinta ( Prof.DR IR. H.Zainal Abidin Pian, MSc dan Hj. Herawati), yang telah membesarkan dengan susah payah dengan penuh kasih sayang dan dengan jasa mereka inilah Penulis dapat menjalani pendidikan Dokter Spesialis Patologi Anatomi ini. Semoga Allah SWT mengampuni dan selalu merahmati kedua ayahanda dan ibunda ini.
Akhirnya, Penulis menyadari bahwa isi hasil penelitian ini masih perlu mendapat koreksi dan masukan untuk kesempurnaan. Oleh karena itu Penulis berharap adanya kritik serta saran untuk penyempurnaan tulisan ini. Semoga penelitian ini bermanfaat bagi kita semua. Amin.
Medan, 12 Mei 2011 Penulis
Herza Piasiska NIM.077108002
2.6.3. Radiologi ... 14
2.8. Klasifikasi Karsinoma Nasofaring ... 19
2.9. Makroskopis ... 19
2.10.2.1. Keratinizing Squamous Cell Carcinoma... 22
2.10.2.2. Nonkeratinizing Squamous Cell Carcinoma 23 2.10.2.3. Basaloid Squamous Cell Carcinoma ... 26
2.11. Stadium Klinik ... 27
2.12. Penatalaksanaan ... 29
2.13. Prognosis ... 30
2.14. Matrix Metalloproteinases ... 30
2.15. Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer (EMMPRIN) ... 34 2.16. Matrix Metalloproteinase dan Kanker ... 37
2.17. Matrix Metalloproteinase dan Angiogenesis ... 40
2.18. Matrix Metalloproteinase-9 ... 41
BAB 3. BAHAN DAN METODA
3.1. Rancangan Penelitian ... 47
3.2. Tempat dan Waktu Penelitian ... 47
3.2.1. Tempat Penelitian ... 47
3.5. Kriteria Penelitian ... 50
3.5.1. Kriteria Inklusi ... 50
3.5.2. Kriteria Ekslusi ... 50
3.6. Cara Kerja ... 50
3.6.1. Pembuatan Sediaan Mikroskopis ... 51
3.6.2. Prosedur Sebelum Pemulasan Antibodi Primer ... 52
3.6.3.Protokol Pemulasan MMP-9 dengan menggunakan The Envision+ Dual Link System dari Dako... 53
3.7. Alat dan Bahan penelitian ... 54
3.7.1. Alat-Alat Penelitian ... 54
3.7.2. Bahan Penelitian ... 55
3.8. Instrumen Penelitian ... 57
3.9. Kerangka Operasional ... 58
3.10. Variabel Penelitian ... 59
3.11. Definisi Operasional ... 59
3.12. Analisa Data ... 61
BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Hasil Penelitian... 62
BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN
5.1. Kesimpulan... 69 5.2. Saran...
DAFTAR PUSTAKA... LAMPIRAN-LAMPIRAN...
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 2.6.1 Formula Digby.. …………..……... 13 Tabel 4.1 Distribusi Penderita Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Tipe Regaud
Berdasarkan Jenis Kelamin………... 62 Tabel 4.2 Distribusi Penderita Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Tipe Regaud
Berdasarkan Umur………....
63 Tabel 4.3 Distribusi Penderita Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Tipe
Schmincke Berdasarkan Jenis Kelamin………..……….. 63 Tabel 4.4 Distribusi Penderita Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Tipe
Schmincke Berdasarkan Umur………. 64 Tabel 4.5 Proporsi Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Tipe Schmincke dan
Regaud dan Skor Jumlah Sel yang Terwarnai ………. 64 Tabel 4.6 Proporsi Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Tipe Schmincke dan
Regaud dengan Skor Tampilan Warna……….... 65 Tabel 4.7 Proporsi Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Tipe Schmincke dan Tipe
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Anatomi nasofaring………... 6
Gambar 2. Skema Patogenesis karsinoma nasofaring...……... 12
Gambar 3. Sitologi Squamous Cell Carcinoma... 21
Gambar 4. Sitologi Undifferentiated Carcinoma ..………….….…... 22
Gambar 5. Histopatologi Keratinizing Squamous Cell Carcinoma... 23
Gambar 6. Histopatologi Non Keratinizing Squamous Cell Carcinoma, Differentiated type……… 24
Gambar 7. Histopatologi Non Keratinizing Squamous Cell Carcinoma Undifferentiated type………... 25
Gambar 8. Histopatologi Undifferentiated Carcinoma “ Regaud type”... 26
Gambar 9. Histopatologi Undifferentiated Carcinoma “ Schmincke type”. 26 Gambar 10. Histopatologi Basaloid Squamous Cell Carcinoma... 27
Gambar 11. Struktur MatrixMetalloproteinase……… 31 Gambar 12. Skema Hubungan EMMPRIN,MMP,Sel Tumor dan Sel
DAFTAR SINGKATAN
WHO : World Health Organization THT : Telinga Hidung Tenggorokan HLA : Human Leucocyte Antigen CT : Computed Tomografi
MRI : Magnetic Resonance Imaging DNA : Deoxy Nucleat Acid
RNA : Ribo Nucleat Acid
PCR : Polimerase Chain Reaction Ig : Imunoglobulin
EGFR : Epidermal Growth Factor Receptor EBV : Ebstein Barr Virus
LMP : Laten Membrane Proteinase
VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor EGF : Epidermal Growth Faktor
MEP : Major Excreted Protein MMPs : Matrix Metalloproteinases MMP-9 : Matrix Metalloproteinase-9 MMP-2 : Matrix Metalloproteinase-2
ABSTRAK
Tampilan Pulasan Imunohistokimia Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) Pada Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Tipe Regaud Dan Tipe Schmincke
(Hasil Penelitian)
Herza Piasiska, H. M. Nadjib Dahlan Lubis, Soekimin Departemen Patologi Anatomi, Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara,
Medan
Latar Belakang. Terdapat dua pola pertumbuhan dari undifferentiated carcinoma nasofaring yaitu tipe Regaud yang sel-sel neoplastiknya berkelompok dan berbatas tegas dikelilingi jaringan ikat berisi sedikit limfosit dan tipe Schmincke yang sel-sel neoplastiknya tumbuh difus dan bercampur dengan sel-sel radang. Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) merupakan enzim proteolitik yang berperan dalam perkembangan karsinoma nasofaring, termasuk invasi sel tumor dan metastasis. Penelitian ini ingin melihat apakah terdapat perbedaan tampilan matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) pada undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan tipe Schmincke.
Metoda. Rancangan penelitian berupa penelitian deskriptif analitik dengan pendekatan secara cross sectional dan diuji statistik dengan Uji Chi Square . Sampel penelitian sebanyak 53 sampel dari biopsi nasofaring, yang sebelumnya telah didiagnosa sebagai karsinoma nasofaring.
Hasil. Tidak ada perbedaan tampilan matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) pada kedua tipe undifferentiated carcinoma nasofaring.
Kesimpulan. Tidak dijumpai perbedaan kemampuan invasi pada pola pertumbuhan tumor antara undifferentiated carcinoma tipe Regaud dan tipe Schmincke.
ABSTRACT
Immunoexpression Staining of Matrix Metalloproteinase-9 (MMP- 9) on Undifferentiated Carcinoma Nasopharyng Regaud Type and Schmincke Type
( Research Result)
Herza Piasiska, H.M.Nadjib Dahlan Lubis, Soekimin
Anatomy Pathology Department of Medical Faculty of North Sumatera University
Objective. Undifferentiated nasopharyngeal carcinoma have two growth pattern, they are Regaud pattern consists of well defined aggregate of neoplastic epithelial cells surrounded by fibrous tissue and inflamatory cells and Schimcke type, the neoplastic epithelial cells growth diffusely and are closely intermingled with inflammatory cells. Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) is proteolytic enzyme plays significant roles in nasopharyngeal carcinoma progression, including tumor invasion and metastasis. The purpose of this research is to distinctive of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) expression among undifferentiated nasopharyngeal carcinoma.
Methods. This research constitute analytic descriptive research with cross sectional design and Chi Square statistic analys .Sample contain of 53 nasopharyngeal biopsy, that have been diagnosed as nasopharyngeal carcinoma before.
Result. There is no difference expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) on undifferentiated nasopharyngeal carcinoma Regaud type and Schmincke type.
Conclusion. There were no differences in the ability of invasion on tumor growth patterns between undifferentiated carcinoma type of Regaud and Schmincke type.
ABSTRAK
Tampilan Pulasan Imunohistokimia Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) Pada Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Tipe Regaud Dan Tipe Schmincke
(Hasil Penelitian)
Herza Piasiska, H. M. Nadjib Dahlan Lubis, Soekimin Departemen Patologi Anatomi, Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara,
Medan
Latar Belakang. Terdapat dua pola pertumbuhan dari undifferentiated carcinoma nasofaring yaitu tipe Regaud yang sel-sel neoplastiknya berkelompok dan berbatas tegas dikelilingi jaringan ikat berisi sedikit limfosit dan tipe Schmincke yang sel-sel neoplastiknya tumbuh difus dan bercampur dengan sel-sel radang. Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) merupakan enzim proteolitik yang berperan dalam perkembangan karsinoma nasofaring, termasuk invasi sel tumor dan metastasis. Penelitian ini ingin melihat apakah terdapat perbedaan tampilan matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) pada undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan tipe Schmincke.
Metoda. Rancangan penelitian berupa penelitian deskriptif analitik dengan pendekatan secara cross sectional dan diuji statistik dengan Uji Chi Square . Sampel penelitian sebanyak 53 sampel dari biopsi nasofaring, yang sebelumnya telah didiagnosa sebagai karsinoma nasofaring.
Hasil. Tidak ada perbedaan tampilan matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) pada kedua tipe undifferentiated carcinoma nasofaring.
Kesimpulan. Tidak dijumpai perbedaan kemampuan invasi pada pola pertumbuhan tumor antara undifferentiated carcinoma tipe Regaud dan tipe Schmincke.
ABSTRACT
Immunoexpression Staining of Matrix Metalloproteinase-9 (MMP- 9) on Undifferentiated Carcinoma Nasopharyng Regaud Type and Schmincke Type
( Research Result)
Herza Piasiska, H.M.Nadjib Dahlan Lubis, Soekimin
Anatomy Pathology Department of Medical Faculty of North Sumatera University
Objective. Undifferentiated nasopharyngeal carcinoma have two growth pattern, they are Regaud pattern consists of well defined aggregate of neoplastic epithelial cells surrounded by fibrous tissue and inflamatory cells and Schimcke type, the neoplastic epithelial cells growth diffusely and are closely intermingled with inflammatory cells. Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) is proteolytic enzyme plays significant roles in nasopharyngeal carcinoma progression, including tumor invasion and metastasis. The purpose of this research is to distinctive of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) expression among undifferentiated nasopharyngeal carcinoma.
Methods. This research constitute analytic descriptive research with cross sectional design and Chi Square statistic analys .Sample contain of 53 nasopharyngeal biopsy, that have been diagnosed as nasopharyngeal carcinoma before.
Result. There is no difference expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) on undifferentiated nasopharyngeal carcinoma Regaud type and Schmincke type.
Conclusion. There were no differences in the ability of invasion on tumor growth patterns between undifferentiated carcinoma type of Regaud and Schmincke type.
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1.Latar Belakang Penelitian
Karsinoma nasofaring adalah tumor yang berasal dari sel-sel epitelial yang menutupi permukaan nasofaring1,2. Karsinoma nasofaring pertama kali dikemukakan sebagai bagian yang terpisah oleh Regaud dan Schmincke pada tahun 19211.
carcinoma, differentiated type dan undifferentiated carcinoma merupakan tipe karsinoma nasofaring yang disebabkan oleh infeksi virus Epstein Barr (EBV)2,6. Matrix metalloproteases ( matrix metalloproteinases, MMPs) atau matrixin merupakan zinc dependent endopeptidase yang merupakan protein utama yang berperan dalam degradasi matriks ekstraselular7,8,9. Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) ( 92-Kd Type IV collagenase/gelatinase B), mendegradasi kolagen tipe IV, yang merupakan komponen utama dari matrik ekstraselular, yang dilaporkan berhubungan dengan invasi dan metastases sel-sel tumor10,11. Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) dapat diinduksi oleh berbagai faktor pada lingkungan tumor, salah satunya adalah Latent membrane protein 110,12. Latent membrane protein 1 (LMP1) merupakan onkoprotein yang paling utama dari EBV yang berfungsi mengaktivasi reseptor Tumor Necrosis Factor (TNF) dan terutama untuk imortalisasi sel B dan transformasi dari fibroblas tikus. LMP1 meningkatkan ekspresi Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) dan Vaskular Endotelial Growth Factor (VEGF) dan menekan ekspresi E cadherin pada sel epitelial in vitro dan pada jaringan tumor pada karsinoma nasofaring. Sehingga LMP1 dianggap berpengaruh pada invasi, angiogenesis dan metastasis tumor pada karsinoma nasofaring13,14.
Zen Liu et al melaporkan bahwa matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)
dari protein matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) memiliki korelasi positif dengan ekspresi dari onkoprotein LMP1 pada jaringan karsinoma nasofaring10.
1.2.Perumusan Masalah
Nonkeratinizing squamous cell carcinoma , differentiated type dan undifferentiated type merupakan tipe karsinoma nasofaring yang disebabkan oleh infeksi virus Epstein Barr. Virus Epstein Barr menghasilkan onkoprotein LMP1 yang menginduksi Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) yang akan mendegradasi matriks ekstraselular dan menyebabkan invasi dan metastase. Undifferentiated carcinoma terdiri dari sel-sel yang uniform dengan inti vesikuler, anak inti yang menonjol dan batas sel yang tidak jelas sehingga membentuk pola pertumbuhan syncitial dengan stroma yang diinfiltrasi oleh sel-sel radang. Undifferentiated carcinoma memiliki dua pola pertumbuhan yaitu tipe Regaud, yang memiliki pola pertumbuhan berupa kelompokan sel-sel epitelial neoplastik dengan batas yang jelas yang dikelilingi oleh jaringan ikat fibrous dan sel-sel limfosit. Yang kedua tipe Schmincke yang memiliki pola pertumbuhan berupa sel-sel epitelial neoplastik yang tumbuh difus dan bercampur dengan sel-sel radang.
1.3.Hipotesa
Terdapat perbedaan tampilan imunohistokimia matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) pada undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan tipe Schmincke.
1.4.Tujuan Penelitian 1.4.1. Tujuan Umum
Melihat tampilan imunohistokimia matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) pada undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan tipe Schmincke.
1.4.2. Tujuan Khusus
1. Melihat gambaran karakteristik penderita undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan tipe Schmincke.
1.5. Manfaat Penelitian
1.Penelitian ini diharapkan dapat menjadi indikator untuk melihat derajat keparahan dari undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan tipe Schmincke.
2. Dengan penelitian diharapkan dapat membantu untuk menentukan
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Anatomi
Nasofaring merupakan lubang sempit yang terdapat pada belakang rongga hidung. Bagian atap dan dinding belakang dibentuk oleh basi sphenoid, basi occiput dan ruas pertama tulang belakang. Bagian depan berhubungan dengan rongga hidung melalui koana. Orificium dari tuba eustachian berada pada dinding samping dan pada bagian depan dan belakang terdapat ruangan berbentuk koma yang disebut dengan torus tubarius. Bagian atas dan samping dari torus tubarius merupakan reses dari nasofaring yang disebut dengan fossa Rosenmuller. Nasofaring berhubungan dengan orofaring pada bagian soft palatum2,16,17.
2.2. Histologi
Mukosa nasofaring dilapisi oleh epitel bersilia respiratory type2,18. Setelah 10 tahun kehidupan, epitel secara lambat laun bertransformasi menjadi epitel nonkeratinizing squamous, kecuali pada beberapa area (transition zone)19. Mukosa membentuk invaginasi membentuk kripta. Stroma kaya akan jaringan limfoid dan terkadang dijumpai jaringan limfoid yang reaktif. Epitel permukaan dan kripta sering diinfiltrasi dengan sel radang limfosit dan terkadang merusak epitel membentuk reticulated pattern. Kelenjar seromucinous dapat juga dijumpai, tetapi tidak sebanyak yang terdapat pada rongga hidung2.
2.3. Epidemiologi
Karsinoma nasofaring merupakan penyebab kematian terbanyak pada sebagian besar populasi di Asia tenggara dan hanya sedikit pada Afrika Utara4. Walaupun jarang karsinoma nasofaring dapat dijumpai pada anak-anak1. Insiden meningkat setelah usia 30 tahun dan usia puncak pada 40-60 tahun5.
Eropa atau Amerika Utara yang mempunyai angka kejadian 1 per 100.000 penduduk per tahun20.
Angka kejadian karsinoma nasofaring di Indonesia cukup tinggi, yakni 4,7 kasus baru per tahun per 100.000 penduduk. Catatan dari berbagai rumah sakit menunjukkan bahwa karsinoma nasofaring menduduki urutan ke empat setelah kanker leher rahim, kanker payudara dan kanker kulit. Tetapi seluruh bagian THT (telinga hidung dan tenggorokan) di Indonesia sepakat mendudukan karsinoma nasofaring pada peringkat pertama penyakit kanker pada daerah ini. Dijumpai lebih banyak pada pria daripada wanita dengan perbandingan 2-3 orang pria dibandingkan 1 wanita20. Penelitian Fachiroh di Yogyakarta menyatakan insiden penderita karsinoma nasofaring 3,9 orang per 100.000 penduduk. Di bagian THT FK-UI RSCM selama periode 1988-1992 didapati 511 penderita baru karsinoma nasofaring. Di RSUP H. Adam Malik Medan pada tahun 1998-2000 ditemukan 130 penderita karsinoma nasofaring dari 1370 pasien baru onkologi kepala dan leher. Sementara pada periode 1 juli 2005-30 juni 2006 ditemukan 79 orang penderita baru karsinoma nasofaring21.
2.4.Etiologi
Penyebab dari karsinoma nasofaring ini adalah gabungan antara genetik, faktor lingkungan dan virus Epstein Barr2,4,6,16,22.
2.4.1.Genetik
Analisa genetik pada populasi endemik berhubungan dengan HLA-A2, HLA-B17 dan HLA-Bw26. Dimana orang dengan yang memiliki gen ini memiliki resiko dua kali lebih besar menderita karsinoma nasofaring19. Studi pada orang Cina dengan keluarga menderita karsinoma nasofaring dijumpai adanya kelemahan lokus pada regio HLA. Studi dari kelemahan HLA pada orang-orang Cina menunjukkan bahwa orang-orang dengan HLA A*0207 atau B*4601 tetapi tidak pada A*0201 memiliki resiko yang meningkat untuk terkena karsinoma nasofaring23.
2.4.2.Lingkungan
Paparan dari formaldehid pada udara dan debu kayu juga berhubungan dengan peningkatan insiden karsinoma nasofaring. Laporan terakhir, pada wanita pekerja tekstil di Shanghai Cina , juga memiliki peningkatan insiden karsinoma nasofaring disebabkan akumulasi dari debu kapas, asam, caustic atau dyeing process. Merokok juga berhubungan dengan peningkatan resiko karsinoma nasofaring. Penelitian menunjukkan adanya paparan jangka panjang dari bahan-bahan polusi memegang peranan dalam patogenesis karsinoma nasofaring. Faktor lingkungan lain yang dapat meningkatkan resiko karsinoma nasofaring yang pernah dilaporkan adalah penggunaan herbal cina, dijumpainya nikel pada daerah endemik, penggunaan alkohol dan infeksi jamur pada kavum nasi2,23,25.
2.4.3.Virus Epstein Barr
Virus Epstein Barr (EBV) merupakan virus yang menginfeksi human B lymphocyte yang berhubungan dengan infeksi mononukleosis, limfoma burkitt's dan karsinoma nasofaring16,24.
Epstein Barr . Yang menarik, ekspresi dari Epstein Barr Virus Early Antigen (EA) berhubungan positif dengan konsumsi makanan bergaram dan makanan yang diawetkan , menunjukkan bahwa dijumpainya Virus Ebstein Barr positif dapat berhubungan dengan kebiasaan diet dan berhubungan dengan studi epidemiologi pada karsinoma nasofaring25.
Lesi premalignant pada epitel nasofaring juga menunjukan adanya virus Epstein Barr, yang memperlihatkan infeksi terjadi pada fase awal karsinogenesis. Specific EBV latent gene dijumpai terekspresi pada karsinoma nasofaring dan pada lesi displastik. Hubungan latent viral protein (latent membrane protein 1 dan 2) memiliki peranan penting pada pertumbuhan tumor, menyebabkan sifat invasif yang tinggi dari karsinoma26.
sebanyak 100% pada 48 biopsi karsinoma nasofaring di Taiwan dan 86% dari 187 biopsi di Asia14
2.5.Patogenesis
2.6.Diagnosis
Diagnosis ditegakkan berdasarkan : 2.6.1.Gejala
Menurut Formula Digby, setiap gejala mempunyai nilai diagnostik dan berdasarkan jumlah nilai dapat ditentukan karsinoma nasofaring. Tabel 2.6.1. Formula Digby
Bila jumlah nilai mencapai 50, diagnosa klinik karsinoma nasofaring dapat dipertangungjawabkan. Sekalipun secara klinik jelas karsinoma nasofaring, namun biopsi tumor primer mutlak dilakukan, selain untuk
konfirmasi diagnosis histopatologi, juga menentukan subtipe histopatologi yang erat kaitannya dengan pengobatan dan prognosis27.
2.6.2.Pemeriksaan Nasofaring
Pemeriksaan tumor primer di nasofaring dapat dilakukan dengan cara rinoskopi posterior (tidak langsung) dan nasofaringoskop (langsung) serta fibernasofaringoskopi27.
2.6.3.Radiologi
Digunakan untuk melihat massa tumor nasofaring dan melihat massa tumor yang menginvasi pada jaringan sekitarnya dengan menggunakan :
1. Computed Tomografi (CT), dapat memperlihatkan penyebaran ke jaringan ikat lunak pada nasofaring dan penyebaran ke ruang paranasofaring. Sensitif mendeteksi erosi tulang, terutama pada dasar tengkorak.
2. Magnetic Resonance Imaging (MRI), menunjukkan kemampuan imaging yang multiplanar dan lebih baik dibandingkan CT dalam membedakan tumor dari peradangan. MRI juga lebih sensitif dalam mengevaluasi metastase pada retrofaringeal dan kelenjar limfe yang dalam. MRI dapat mendeteksi infiltrasi tumor ke sumsum tulang, dimana CT tidak dapat mendeteksinya22,24.
2.6.4.Serologi
Pada tumor, DNA Epstein Barr bersifat homogen dan klonal melalui pengulangan skuensi. Ekspresi dari spesific viral messenger RNAs atau produk gen secara konsisten dapat dideteksi pada seluruh sel tumor. Virus dapat dideteksi pada tumor dengan pemeriksaan insitu hibridisasi dan tekhnik imunohistokimia. Dapat juga dideteksi dengan tekhnik PCR pada material yang diperoleh dari aspirasi biopsi jarum halus pada metastase kelenjar getah bening leher. Deteksi dari antibodi Ig G ( yang dijumpai pada masa awal infeksi virus ) dan antibodi Ig A ( yang dijumpai pada capsid viral antigen ) digunakan di Amerika Serikat untuk mendukung diagnosis karsinoma nasofaring4,24. Virus Epstein Barr dapat dijumpai pada nonkeratinizing squamous cell carcinoma dan undifferentiated carcinoma6.
2.6.5.Pemeriksaan Patologi
2.6.5.1.Biopsi aspirasi jarum halus pada kelenjar getah bening servikalis.
2.6.5.2.Biopsi
Biopsi dapat dilakukan dengan dua cara yaitu dari hidung dan dari mulut. Biopsi melalui hidung dilakukan tanpa melihat jelas tumornya ( blind biopsy). Kunam biopsi dimasukkan melalui rongga hidung menyusuri konka media ke nasofaring kemudian cunam diarahkan ke lateral dan dilakukan biopsi.
Biopsi melalui mulut dengan memakai bantuan kateter nelaton yang dimasukkan melalui hidung dan ujung kateter yang berada di dalam mulut ditarik keluar dan diklem bersama-sama dengan ujung kateter yang dihidung. Demikian juga dengan kateter disebelahnya sehingga palatum mole tertarik ke atas. Kemudian dengan kaca laring dilihat daerah nasofaring. Biopsi dilakukan dengan melihat tumor melalui kaca tersebut atau memakai nasofaringoskop yang dimasukkan melalui mulut, massa tumor akan terlihat lebih jelas. Biopsi tumor nasofaring umumnya dilakukan dengan anestesi topikal dengan xylocain 10%28.
2.7. Gambaran Klinis
unilateral, dan merupakan gejala yang paling dini dari karsinoma nasofaring. Sehingga bila timbul berulang-ulang dengan penyebab yang tidak diketahui perlu diwaspadai sebagai karsinoma nasofaring24,29. Pada karsinoma nasofaring stadium lanjut gejala klinis lebih jelas sehingga pada umumnya telah dirasakan oleh pasien, hal ini disebabkan karena tumor primer telah meluas ke organ sekitar nasofaring atau mengadakan metastasis regional ke kelenjar getah bening servikal. Pada stadium ini gejala yang dapat timbul adalah gangguan pada syaraf otak karena pertumbuhan ke rongga tengkorak dan pembesaran kelenjar leher2,24,29. Tumor yang meluas ke rongga tengkorak melalui foramen laserasum dan mengenai grup anterior saraf otak yaitu syaraf otak III, IV dan VI. Perluasan yang paling sering mengenai syaraf otak VI ( paresis abdusen) dengan keluhan berupa diplopia, bila penderita melirik ke arah sisi yang sakit. Penekanan pada syaraf otak V memberi keluhan berupa hipestesi ( rasa tebal) pada pipi dan wajah. Gejala klinik lanjut berupa ophtalmoplegi bila ketiga syaraf penggerak mata terkena. Nyeri kepala hebat timbul karena peningkatan tekanan intrakranial24,29.
Metastasis sel-sel tumor melalui kelenjar getah bening mengakibatkan
timbulnya pembesaran kelenjar getah bening bagian samping (limfadenopati servikal). Selanjutnya sel-sel kanker dapat mengadakan infiltrasi
pada otot dan sulit digerakkan. Limfadenopati servikal ini merupakan gejala utama yang dikeluhkan oleh pasien24,29.
2.8.Klasifikasi Karsinoma Nasofaring
Klasifikasi WHO tahun 1978 untuk karsinoma nasofaring (1) Keratinizing squamous cell carcinoma, (2) Nonkeratinizing squamous cell carcinoma (3) Undifferentiated carcinoma1,3,16. Klasifikasi WHO tahun 1991 membagi karsinoma nasofaring menjadi (1) Keratinizing squamous cell carcinoma, (2) Nonkeratinizing squamous cell carcinoma terdiri atas differentiated nonkeratinizing cell carcinoma dan undifferentiated carcinoma sedangkan klasifikasi WHO tahun 2005 membagi karsinoma nasofaring menjadi (1) Keratinizing squamous cell carcinoma, (2) Non-keratinizing terdiri dari differentiated type dan undifferentiated type dan (3) Basaloid squamous cell carcinoma3. Menurut Ackerman berdasarkan pola pertumbuhannya terdapat 2 tipe undifferentiated carcinoma yaitu tipe Regaud dan tipe Schmincke1,4,5.
2.9.Makroskopis
2.10.Mikroskopis
2.10.1. Sitologi
2.10.1.1. Sitologi squamous cell carcinoma
2.10.1.2. Sitologi Undifferentiated Carcinoma
Gambaran sitologi yang dapat dijumpai pada undifferentiated carcinoma berupa kelompokan sel-sel berukuran besar yang tidak berdiferensiasi, inti yang membesar dan khromatin pucat, terdapat anak inti yang besar, sitoplasma sedang, dijumpai latar belakang sel-sel radang limfosit diantara sel-sel epitel31,32,33.
Dijumpai gambaran mikroskopis yang sama dari aspirat yang berasal dari lesi primer dan metastase pada kelenjar getah bening regional33.
2.10.2.Histopatologi
2.10.2.1. Keratinizing Squamous cell carcinoma
Pada pemeriksaan histopatologi keratinizing squamous cell carcinoma memiliki kesamaan bentuk dengan yang terdapat pada lokasi lainnya2,6.
tengah pulau menunjukkan sitoplasma eosinofilik yang banyak mengindikasikan keratinisasi. Dijumpai adanya keratin pearls2.
2.10.2.2. Non Keratinizing Squamous cell carcinoma a.Differentiated Type
Pada pemeriksaan histopatologi nonkeratinizing squamous cell carcinoma differentiated type memperlihatkan gambaran stratified dan membentuk pulau-pulau4,5. Sel-sel menunjukkan batas antar sel yang jelas dan terkadang dijumpai intercellular bridge yang samar-samar. Dibandingkan dengan undifferentiated carcinoma ukuran sel lebih kecil, rasio inti sitoplasma lebih kecil, inti lebih hiperkhromatik dan anak inti tidak menonjol2.
b. Undifferentiated Type
Pada pemeriksaan undifferentiated carcinoma memperlihatkan gambaran sinsitial dengan batas sel yang tidak jelas,inti bulat sampai oval dan vesikular, dijumpai anak inti. Sel-sel tumor sering tampak terlihat tumpang tindih24. Beberapa sel tumor dapat berbentuk spindel. Dijumpai infiltrat sel radang dalam jumlah banyak, khususnya limfosit, sehingga dikenal juga sebagai lymphoepithelioma. Dapat juga dijumpai sel-sel radang lain, seperti sel plasma, eosinofil, epitheloid dan multinucleated giant cell (walaupun jarang)4,5.
Terdapat dua bentuk pola pertumbuhan tipe undifferentiated yaitu tipe Regaud, yang terdiri dari kumpulan sel-sel epithelial neoplastik dengan batas yang jelas yang dikelilingi oleh jaringan ikat fibrous dan sel-sel limfosit. Yang kedua tipe Schmincke, yang terdiri dari sel-sel epitelial neoplastik tumbuh difus dan bercampur dengan sel-sel radang. Tipe ini sering dikacaukan dengan large cell malignant lymphoma 4,5.
2.10.2.3. Basaloid Squamous Cell Carcinoma
Bentuk mikroskopis lain yang jarang dijumpai adalah basaloid squamous cell carcinoma2,4. Tipe ini memiliki dua komponen yaitu sel-sel basaloid dan sel-sel squamous. Sel-sel basaloid berukuran kecil dengan inti Gambar 8. Undifferentiated Carcinoma terdiri dari sel-sel yang membentuk sarang-sarang padat ( “Regaud type”). (Dikutip dari: Rosai J. Rosai and Ackermans Surgical Pathology,Volume I, Philadelphia: Mosby, 2004(9)).
hiperkhromatin dan tidak dijumpai anak inti dan sitoplasma sedikit. Tumbuh dalam pola solid dengan konfigurasi lobular dan pada beberapa kasus dijumpai adanya peripheral palisading. Komponen sel-sel squamous dapat in situ atau invasif. Batas antara komponen basaloid dan squamous jelas2.
2.11.Stadium Klinik
Untuk karsinoma nasofaring pembagian TNM adalah sebagai berikut : T menggambarkan keadaan tumor primer, besar dan perluasannya
TX : Tumor primer tidak bisa dinilai
TO :Tidak ditemukan bukti adanya tumor primer. Tumor dijumpai insitu T1 : Tumor terbatas pada nasofaring
T2 : Tumor meluas ke jaringan lunak
T2a : Tumor meluas ke orofaring dan atau kavum nasi tanpa perluasan ke parafaring
T2b : Dengan perluasan ke parafaring
T3 : Invasi ke struktur tulang dan atau sinus paranasal
T4 : Tumor meluas ke intrakranial dan atau mengenai syaraf otak, fossa infratemporal, hipofaring atau orbita
N menggambarkan keadaaan kelenjar limfe regional
NX : Keterlibatan kelenjar limfe regional tidak dapat dinilai N0 : Tidak ada metastasis ke kelenkar limfe regional
N1 : Terdapat metastase pada kelenjar limfe unilateral dengan ukuran < 6 cm ,diatas supraklavikular
N2 : Terdapat metastase pada kelenjar limfe bilateral dengan ukuran ‹ 6 cm , diatas supraklavikula.
N3 : Terdapat pembesaran kelenjar > 6 cm atau ekstensi ke supraklavikula N3a : Ukuran pembesaran kelenjar > 6 cm
M menggambarkan metastase jauh MX : Metastase jauh tidak bias dinilai
M0 : Tidak ada metastase jauh M1 : Terdapat metastase jauh
Berdasarkan TNM tersebut diatas, stadium penyakit dapat ditentukan : Stadium 0 : Tis, N0, M0
Stadium I : T1, N0, M0 Stadium IIA : T2a, N0, M0
Stadium IIB : T1, N1, M0, T2a, N1, M0 atau T2B, N0-1, M0 Stadium III : T1-2, N2, M0, T2a T2b, N2, M0 atau T3, N0-2, M0 Stadium IVA: T4, N0-2, M0
Stadium IVB: Tiap T, N3, M0
StadiumIVC: Tiap T, Tiap N, M11,2,4,29
2.12.Penatalaksanaan
Pengobatan standar dengan menggunakan radioterapi, dengan angka ketahan hidup sekitar 50-70%, tetapi beberapa penulis menganjurkan untuk mengkombinasikan dengan kemoterapi24,27.
2.13.Prognosis
Angka ketahanan hidup dipengaruhi oleh usia (lebih baik pada pasien usia muda), staging klinik dan lokasi dari metatase regional ( lebih baik pada yang homolateral dibandingkan pada metastase kontralateral dan metastase yang terbatas pada leher atas dibandingkan dari leher bawah)27. Studi terakhir dengan menggunakan TNM Staging System menunjukkan 5 years survival rate untuk stage I 98%, stage II A-B 95%, stage III 86%, dan stage IV A-B 73%24. Secara mikroskopis, prognosis lebih buruk pada keratinizing squamous cell carcinoma dibandingkan dengan yang lainnya. Untuk nonkeratinizing squamous cell carcinoma, prognosis buruk bila dijumpai :
1.Anaplasia dan atau plemorfism.
2.Proliferasi sel yang tinggi ( dihitung dari mitotik atau dengan proliferasi yang dihubungkan dengan marker imunohistokimia ).
3.Sedikitnya jumlah sel radang limfosit.
4.Tingginya densitas dari S-100 protein yang positif untuk sel-sel dendritik. 5.Dijumpai banyak pembuluh darah kecil.
6.Dijumpai ekspresi c-erb B-24.
2.14.Matrix metalloproteinases
utama yang berperan dalam degradasi matriks ekstraselular. Matrix metalloproteinases (MMPs) mampu untuk mendegradasi molekul ekstraselular secara luas7,8,9. Matrix metalloproteinases (MMPs) memegang peranan penting dalam proliferasi sel, migrasi, diferensiasi, angiogenesis, apoptosis dan pertahanan tubuh. Disregulasi dari matrix metalloproteinases (MMPs) memiliki implikasi dalam berbagai penyakit termasuk arthritis, ulkus kronik, encephalomyelitis dan kanker. Invasi tumor, metastasis dan angiogenesis terjadi melalui degradasi dari matrik ekstraselular dan peningkatan ekspresi dari matrix metalloproteinase.
Matrix metalloproteinase berhubungan dengan invasi dan metastase dari tumor ganas dengan asal histogenetik yang berbeda. Secara umum, matrix metalloproteinase memiliki satu sinyal peptide, satu propeptida, satu katalitik domain dengan ikatan kuat dengan zinc dan satu domain hemopexinlike yang berhubungan dengan domain katalitik pada region hinge8.
Famili matrix metalloproteinases (MMPs) terdiri dari lebih dari 20 related zinc dependent enzymes. Enzim ini memiliki nama deskripsi berdasarkan substrat dan sistem penomoran matrix metalloproteinases (MMPs) berdasarkan pada urutan ditemukan. Matrix metalloproteinases (MMPs) memiliki karakteristik memiliki kemampuan mendegradasi protein matrix ekstraselular termasuk kolagen, laminin, fibronektin, vitronektin, aggrecan, enactin, tenascin, elastin dan proteoglycans. Sekarang ini, dikatakan bahwa matrix metalloproteinases (MMPs) dapat memecah banyak tipe dari peptida dan protein dan memiliki kemampuan penting lain berupa aktivitas proteolitik yang bebas34.
Pembagian Matrix metalloproteinase 1.Collagenases (MMP-1, -8 and -13) 2.Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) 3.Stromelysins (MMP-3, -10 and-11) 4.Matrilysin (MMP-7 and MMP-26)
5.Membrane-type (MT)-MMPs (MMP-14, -15, -16, -17, -24 and -25) 6.Lainnya (MMP-12, -19, -20, -21, -23, -27 and -28)7.
fokus pada berbagai penelitian dengan kerusakan pada jaringan ikat ( seperti rheumatoid atritis, kanker dan penyakit-penyakit periodontal). Leukosit terutama makrofag, merupakan sumber utama penghasil matrix metalloproteinases (MMPs). Matrix metalloproteinase (MMPs) yang dikeluarkan oleh leukosit memegang peranan penting dalam perpindahan leukosit dari pembuluh darah dan penetrasi ke jaringan, merupakan kunci dari penyakit radang. Opdenakker menunjukkan bahwa kerja matrix metalloproteinases (MMPs) tidak hanya mengizinkan emigrasi leukosit ke jaringan dan menyebabkan kerusakan jaringan, namun juga menghasilkan fragmen imunogenik dari protein normal yang dapat memperhebat penyakit autoimun. Dengan cara yang sama, metastase sel-sel kanker juga menggunakan MMPs untuk keluar dari jaringan dan untuk pembentukan pembuluh darah9.
matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) dari bentuk aktif ke laten berhubungan dengan progresi tumor pada kanker-kanker invasif. Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) dan anggota famili yang lain juga menyebabkan angiogenesis ( proses penting dalam pertahanan tumor) dengan mendegradasi membran basal interstitium dan juga mengeluarkan VEGF, yang diketahui sebagai molekul angiogenik. Lokasi matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) pada permukaan sel dibutuhkan untuk meningkatkan invasi tumor dan angiogenesis12.
Sebagian besar matrix metalloproteinases (MMPs) diproduksi oleh sel stroma di bandingkan sel kanker. Penjelasan untuk fenomena ini adalah sel-sel kanker memproduksi Extracellular MatrixMetalloproteinase Inducer (EMMPRIN), yang merupakan glikoprotein pada permukaan sel, yang distimulasi langsung oleh fibroblast (melalui kontak langsung) untuk memproduksi MMP1,2,3 dan MMP14. EMMPRIN juga meningkat pada sel-sel radang dan dapat diimplikasikan pada kerusakan jaringan8.
2.15.Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer (EMMPRIN)
ekstraselular yang mengandung dua immunoglobulin-like domain, satu transmembrane domain dan short cytoplasmic domain. Sel-sel tumor berhubungan dengan EMMPRIN akan merangsang pembentukan matrix metalloproteinase oleh fibroblas dengan perlekatan antara sel tumor dengan fibroblas. Walaupun demikian produksi dari EMMPRIN terlarut yang berasal dari sel-sel tumor telah dilaporkan pada beberapa penelitian36.
Guo et al telah melaporkan, untuk merangsang matrix metalloproteinases (MMPs), EMMPRIN membentuk komplek dengan matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) pada permukaan sel tumor dimana fungsinya tambahannya dapat meningkatkan mekanisme penting untuk memecah matriks ekstraselular untuk memungkinkan terjadinya invasi37.
Tang et al melaporkan, sel tumor mempengaruhi fibroblas tanpa
2.16.Matrix Metalloproteinase dan Kanker.
Untuk dapat melakukan metastase sel tumor harus berinteraksi dengan membrane ekstraselular dalam beberapa tahap yaitu :
• Terlepasnya sel tumor satu sama lain
Dalam metastase yang pertama terjadi adalah meregangnya sel tumor, hal ini disebabkan oleh karena perubahan pola ekspresi molekul perekat sel. Dimana fungsi E cadherin lenyap pada semua kanker epitel, baik akibat mutasi inaktivasi gen E cadherin maupun oleh aktivasi gen β cathenin.
• Melekatnya sel tumor ke komponen matriks
Melekatnya sel tumor ke berbagai komponen ECM, seperti laminin dan fibronektin. Sel epitel normal memiliki reseptor untuk laminin membrane basal yang terpolarisasi di permukaan basalnya, sebaliknya sel karsinoma memiliki lebih banyak reseptor, dan reseptor ini tersebar diseluruh membran sel.
• Penguraian matrik ekstraselular
• Migrasi sel tumor
Pada tahap akhir proses invasi dalah sel tumor berjalan menembus membran basal yang telah rusak dan matriks yang telah mengalami lisis. Migrasi tampaknya diperantarai oleh berbagai sitokin yang yang berasal dari sel tumor, selain itu juga diperantarai oleh produk penguraian matriks (misalnya. kolagen, laminin) dan sebagian faktor pertumbuhan ( misalnya, insulin like growth factor I dan II) yang memiliki aktivitas kemotaktik untuk sel tumor dan sel stroma juga menghasilkan efektor parakrin untuk motilitas sel6.
proliferasi sel. Matrix metalloproteinase (MMP) yang dirangsang oleh Fas ligand dari permukaan sel dapat meningkat atau mengganggu ketahanan sel. MMP 14 dan MMP 1 dapat juga terlibat dalam meningkatkan migrasi dari sel-sel kanker8.
2.17.Matrix Metalloproteinase dan Angiogenesis
Angiogenesis merupakan proses komplek pembentukan pembuluh darah baru yang berasal dari pembuluh darah yang telah ada, yang terjadi melalui berbagai interaksi antara sel-sel endotelial, sekitar perisit dan sel-sel otot polos, matrik ekstraselular dan sitokin angiogenik faktor pertumbuhan35.
Beberapa matrix metalloproteinases (MMPs), terutama matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) dan MT1-MMP1 merupakan regulator penting dalam angiogenesis38. Matrix metalloproteinases (MMPs) tidak dijumpai atau hanya sedikit diproduksi oleh sel endotelial, tetapi protease ini sangat kuat menginduksi aktivasi pada capillary sprout selama penyembuhan luka, peradangan dan pertumbuhan tumor dan dalam mengaktivasi sel-sel endotelial in vitro38.
Angiogenesis dapat dirangsang oleh pengeluaran faktor proangiogenik, (misalnya, VEGF, bFGF dan tumor nekrosis faktor-α) dari sel-sel radang, sel mast, makrofag atau sel-sel tumor. Faktor ini berikatan ke reseptor permukaan sel (Y shape receptor) pada sel-sel endotelial, yang meningkatkan aktivasi proliferasi sel, peningkatan ekspresi dari molekul adhesi sel (misalnya, integrin,
kemampuan afinitas untuk αvß3 integrin, yang meningkatkan terjadinya
angiogenesis8.
2.18.Matrix Metaloproteinase- 9
Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) ( 92-Kd Type IV collagenase/gelatinase B), memiliki fungsi mendegradasi kolagen tipe IV, yang merupakan komponen utama dari matrik ekstraselular, yang dilaporkan berhubungan dengan invasi dan metastases sel-sel tumor10,11. Protein matrix metalloproteinase-9 terdiri dari satu N terminal signal sequence ( pre domain) yang mengeluarkan protein langsung ke retikulum endoplasma. Pre domain diikuti oleh propeptide-pro domain yang merupakan enzyme maintains-latensi sebelum pecah, dan domain katalitik yang terdiri dari conserved zinc binding region. Juga dijumpai hemopexin/vitronectin-like domain , yang berhubungan dengan domain katalitik dengan hinge atau linker region. Seperti enzim proteolitik lainnya, matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) pertama kali di sintesis sebagai inactive proenzime atau zymogen. Aktivasi dari pro matrix metalloproteinase-9 (pro MMP-9) dimediasi oleh system plasminogen activator/Plasmin (PA/plasmin). Regulasi dari aktivitas matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) juga dikontrol oleh TIMP-312.
termasuk interleukin, interferon, EGF (Epidermal Growth Faktor), NGF (Nerve Growth Faktor), basic FGF (Fibroblast Growth Faktor), VEGF (Vaskular Endotelial Growth Faktor), PDGF (Platelet Derived GrowthFactors), TNF-a (Tumor Necrosis Faktor), TGF-b (Transforming Growth Faktor), Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer (EMMPRIN), Osteopoitin dan Tumor Nekrosis Faktor Alpha. Disamping itu matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) juga diinduksi oleh protein Z, yang dikode oleh EBV immediate early gene BZLF1 yang diperantarai oleh cellular transcriptional faktor seperti NF-Kb, SP-1 dan AP-1. LMP1 juga merupakan salah satu faktor yang menginduksi matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)10,12.
Peningkatan matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) dijumpai pada karsinoma payudara, karsinoma endometrium, karsinoma kolorektal, karsinoma papilari tiroid dan karsinoma sel skuamous pada kepala dan leher14. Banyak penelitian melaporkan bahwa matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) dan matrix metalloproteinase-9 ( MMP-9) rensponsibel untuk invasi sel-sel tumor39.
dengan matrix metalloproteinases (MMPs) yang lain, memegang peranan dalam remodeling jaringan normal seperti pertumbuhan neurite, pembentukan embrio, angiogenesis, ovulasi, involusi dari kelenjar payudara dan penyembuhan luka12.
2.19.Matrix metalloproteinase-9 dan Karsinoma nasofaring
LMP1 berfungsi mengaktivasi reseptor Tumor Necrosis Factor (TNF) dan terutama untuk imortalisasi sel B dan transformasi dari fibroblas tikus. LMP1 meningkatkan ekspresi Matrix metalloproteinase -9 (MMP-9) dan vaskular endotelial growth factor (VEGF) dan menekan ekspresi E cadherin pada sel epitelial in vitro dan pada jaringan tumor pada karsinoma nasofaring. Sehingga LMP1 dianggap berpengaruh pada invasif, angiogenesis dan metastasis tumor pada karsinoma nasofaring14.
Horikawa et al. terdapat korelasi positif dari ekspresi protein matrix
metalloproteinase-9 (MMP-9) dengan LMP1 pada penderita karsinoma nasofaring. LMP1 dan matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) dominan pada sarang-sarang sel kanker. Secara umum, matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) diproduksi tidak hanya pada sel-sel tumor tetapi juga bervariasi pada sel-sel stroma10.
Zen Liu et al melaporkan bahwa matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)
memegang peranan dalam progresivitas karsinoma nasofaring, termasuk invasi tumor dan metastasis17.
2.20.Tissue Inhibitor of MMPs (TIMPs)
2.21.Kerangka Konsepsional
Undifferentiated carcinoma
Kemampuan Invasi dan Metastase
Tipe Regaud Tipe Schmincke
BAB 3
BAHAN DAN METODA
3.1. Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian berupa penelitian deskriptif analitik dengan pendekatan secara cross sectional.
3.2. Tempat dan Waktu Penelitian
3.2.1 Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan di Sentra Diagnostik Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara, Instalasi Patologi Anatomi RS. H. Adam Malik Medan dan Laboratorium Patologi Anatomi swasta dan pribadi di Medan.
3.2.2 Waktu Penelitian
3.3. Subjek Penelitian
3.3.1. Populasi
Populasi dalam penelitian ini adalah sediaan blok parafin yang berasal dari jaringan nasofaring yang didiagnosa sebagai karsinoma nasofaring pada sentra diagnosis Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran USU, Instalasi Patologi Anatomi RS. H. Adam Malik Medan dan Laboratorium Patologi Anatomi Swasta dan Pribadi kota Medan.
3.3.2. Sampel
Sampel dalam penelitian ini adalah sediaan blok parafin dari jaringan nasofaring yang sesuai dengan kriteria inklusi dan sesuai dengan besar sampel penelitian.
3.4. Jumlah Sampel
kemaknaan yang dipergunakan pada penelitian ini adalah 0,05 dengan interval kepercayaan 95%. Dari tabel didapat Zα = 1,96
Jumlah sampel dihitung dengan rumus :
n = besar sampel p = proporsi penelitian q = 100% - p
α = tingkat kemaknaan
Tingkat kemaknaan yang dipergunakan pada penelitian ini adalah 0,05 dengan interval kepercayaan 95%. Dari tabel didapat Zα = 1,96
d = tingkat kesalahan (15%) Sehingga :
(1,96)2 (0,5) (0,5) (0,15)2
= 42,68 ≈ 43
Jumlah sampel minimal 43 sampel 53 sampel.
zα2 PQ
d2 n =
3.5. Kriteria Penelitian 3.5.1. Kriteria Inklusi:
Yang termasuk kriteria inklusi adalah sediaan blok parafin jaringan nasofaring dengan slide pulasan Hematoksilin Eosin yang didiagnosa dengan undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan tipe Schmincke.
3.5.2. Kriteria Eksklusi:
1.Sediaan blok parafin yang didiagnosa dengan keratinizing squamous cell carcinoma, differentiated type nonkeratinizing squamous cell carcinoma dan basaloid squamous cell carcinoma.
2. Sediaan blok paraffin dari undifferentiated carcinoma yang tidak bisa dibedakan tipenya.
3..Sediaan blok parafin yang rusak dan tidak dapat diproses lebih lanjut dengan pulasan Matrix metalloproteinase 9.
3.6. Cara Kerja
1. Semua slide yang berasal dari nasofaring yang telah didiagnosa sebagai carcinoma.
carcinoma, differentiated type non keratinizing squamous cell carcinoma, undifferentiated type non keratinizing squamous cell carcinoma (undifferentiated carcinoma) dan basaloid squamous cell carcinoma (Diagnosa berdasarkan pada klasifikasi WHO tahun 2005). 3. Kemudian undifferentiated carcinoma nasofaring dipisahkan kembali
menjadi tipe Regaud dan tipe Schmincke (pembagian Ackerman) 4. Dilakukan pemotongan ulang blok paraffin.
5. Pewarnaan dengan imunohistokimia Matrix Metalloproteinase-9. 6. Tampilan dari Matrix Metalloproteinase-9.
3.6.1. Pembuatan Sediaan Mikroskopis
Sediaan mikroskopis dibuat dengan cara sebagai berikut :
1.Blok parafin yang telah dikumpulkan, disimpan dalam freezer sampai cukup dingin, selanjutnya dipotong tipis dengan menggunakan mikrotom dengan tebal 4 µm. Setiap blok parafin, dipotong ulang 1 kali untuk pulasan imunohistokimia matrix metalloproteinase-9 (MMP-9).
Pada pulasan imunohistokimia MMP-9 digunakan kaca objek yang telah dicoating dengan poly-L-lysine atau Silanized slide agar jaringan dapat menempel pada kaca objek selama proses pulasan imunohistokimia.
Cara menempelkan potongan tipis pada kaca objek coated adalah menggunakan ujung pisau atau pinset yang runcing. Potongan tipis dipisahkan dan diratakan dengan memasukkannya ke dalam air hangat. Setelah mengembang, pindahkan ke atas kaca objek. Selanjutnya, kaca objek diletakkan di atas alat pemanas (hot plate) 50-60⁰C. Setelah parafin melunak, kaca objek dikeringkan dan potongan jaringan siap untuk dipulas.
3.6.2. Prosedur sebelum pulasan antibodi primer.
1.Siapkan preparat berupa potongan tipis jaringan 4 µm yang sudah ditempelkan pada kaca objek silanized.
2.Deparafinisasi dengan mencelupkan preparat ke dalam cairan xylol sebanyak 3 kali, masing-masing 5 menit.
3.Rehidrasi dengan cara mencelupkan secara berurutan dalam etanol 98% sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit, kemudian alkohol 90%, 80% dan 70% masing-masing selama 5 menit.
4.Bilas dengan air mengalir selama 5 menit.
5. Blocking preparat dengan mencelupkannya kedalam Endogen Peroksidase 0,5% (Methanol + H2O2) selama 30 menit.
7. Masukkan preparat ke dalam buffer sitrat dan dipanaskan kedalam microwave:
• Cook I, power level 8 selama 5 menit. • Cook II, power level 1 selama 5 menit. 8. Dinginkan ± 30 menit dalam suhu ruangan.
9. Bilas dalam PBS pH 7,4 selama 3 menit dan keringkan air disekitar potongan jaringan.
10. Tandai di sekeliling jaringan yang ingin dipulas dengan Pap Pen. 11. Blocking preparat dengan meneteskan Normal Horse Serum 5% dan dibiarkan selama 15 menit didalam bak inkubasi.
3.6.3. Protokol Pemulasan Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) dengan menggunakan The Envision+ Dual Link System dari Dako
• Bersihkan preparat dari Normal Horse Serum.
• Teteskan preparat dengan antibodi primer matrix metalloproteinase-9 dan biarkan selama 60 menit dalam rak inkubasi.
• Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 3 menit.
• Teteskan preparat dengan Dako REAL En Visison secukupnya dan dibiarkan selama 30 menit dalam rak inkubasi.
• Teteskan preparat dengan DAB + substrat buffer (Dako) dan biarkan selama 2-5 menit.
• Bilas dengan air mengalir selama 10 menit.
• Countrstain preparat dengan pewarnaan Hematoxillin selama 1-2 menit. • Bilas dengan air mengalir selama 5 menit.
• Masukkan preparat kedalam larutan lithium carbonat jenuh ( 5% dalam aquadest) selama 2 menit.
• Bilas dengan air mengalir selama 5 menit.
• Dehidrasi dengan cara mencelupkan preparat secara berurutan dalam etanol 70%,80%,96% dan etanol absolut, masing-masing selama 5 menit.
• Clearing dengan cara mencelupkan preparat ke dalam larutan xylol sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit.
• Lakukan mounting dan tutp dengan kaca penutup.
3.7.Alat dan Bahan Penelitian
3.7.1. Alat-Alat Penelitian
saring, pengukur waktu, gelas Erlenmeyer, gelas beker, tabung sentrifuge, microwave, thermolyte stirrer, entelan dan mikroskop cahaya.
3.7.2.Bahan Penelitian
• Blok parafin yang telah didiagnosa dengan pulasan Hematoksilin Eosin sebagai undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan tipe Schmincke
• Pulasan imunohistokimia menggunakan metode The EnVision+ Dual Link System kit, teknik pulasan imunohistokimia 2 langkah. Antibodi
primer yang digunakan adalah Rabbit Polyclonal Hu-antibody MMP-9 dengan pengenceran 1 : 100.
• Detection kit terdiri dari :
1 botol endogenous enzyme block 1 botol Normal Horse Serum 5% 1 botol Dako REAL En VISION 1 botol DAB+ substrat chromogen
• Larutan Buffer sitrat • Larutan PBS pH7,4 :
KH2PO4 : 2 gram Tambahkan aquadest : 1000 ml • Larutan Tweet 20
• Larutan DAB + substrat buffer (1 ml larutan cukup untuk 10 jaringan)
Langakah 1: masukkan 1 ml aliquot substrat buffer secukupnya kedalam countainer ( tergantung dari jumlah spesimen yang akan dikerjakan)
Langkah 2 : untuk setiap 1 ml buffer, tambahkan satu tetes (20 mikroliter )cairan DAB + substrat chromogen dan campurkan segera. • Larutan couterstain Mayers Haematoxillin
• Larutan lithium karbonas
50 gram lithium karbonas ditambah dengan aquadest 1000 ml • Etanol absolute 96%,80%,70%
• Larutan xylol.
3.8.Instrumen Penelitian
Instrumen penelitian yang digunakan adalah hasil pulasan imunohistokimia MMP-9 terhadap sampel sediaan jaringan nasofaring. Untuk penilaian terhadap pulasan imunohistokimia MMP-9 adalah sebagai berikut : • Kontrol positif : jaringan yang telah diketahui positif terhadap MMP- 9 pada
penelitian terdahulu (dalam hal ini limfoma) • Kontrol negatif : omit primary antibody
3.9. Kerangka Operasional Slide dari nasofaring yang
didiagnosa dengan carcinoma
3.10. Variabel Penelitian
Variabel yang diteliti adalah :
a. Variabel bebas adalah undifferentiated carcinoma nasofaring : tipe Regaud dan tipe Schmincke.
b.Variabel terikat adalah tampilan imunohistokimia matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) pada undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan
tipeSchmincke.
3.11. Definisi Operasional
1.Karsinoma nasofaring adalah tumor yang berasal dari sel-sel epitelial yang menutupi permukaan nasofaring.
3. Undifferentiated carcinoma nasofaring terdiri dari sel-sel yang uniform dengan inti vesikuler, inti yang menonjol dan batas sel yang tidak jelas sehingga membentuk pola pertumbuhan syncitial dengan stroma yang diinfiltrasi oleh sel-sel radang.
4. Tipe Regaud yaitu tipe dari undifferentiated carcinoma yang terdiri dari kelompokan sel-sel epithelial neoplastik dengan batas yang jelas yang dikelilingi oleh jaringan ikat fibrous dan sel-sel radang.
6.Imunohistokimia adalah metoda pewarnaan dengan perpaduan antara reaksi imunologi dan kimiawi, dimana reaksi imunologi ditandai adanya reaksi antara antigen dengan antibodi, dan reaksi kimiawi ditandai dengan adanya reaksi antara enzim dengan substrat.
7.Matrix metalloproteinase-9 adalah ZN2+ dependent endopeptidase yang memediasi degradasi dari protein matrix extracellular dan berhubungan dengan invasi tumor dan metastase.
8.Hasil pulasan immunohistokimia MMP-9 adalah tampilan pulasan warna coklat pada sitoplasma sel epitel dan stroma yang dinyatakan dengan :
• Negatif, bila tidak berhasil menampilkan warna coklat, dimana pada saat proses yang sama kontrol (+) menampilkan warna coklat dengan pewarnaan kromogen DAB.
• Positif, bila terlihat tampilan pulasan warna coklat pada sitoplasma sel epitel ataupun stroma dengan menggunakan mikroskop cahaya pembesaran 400X pada 5 lokasi lapangan pandang dan pada saat yang sama kontrol (+) juga menampilkan warna yang sama.
Yang dinilai pada jaringan yaitu : o Skor tampilan warna coklat : +1 = lemah
o Skor jumlah sel yang terwarnai 0 = Tidak ada sel yang terwarnai +1 = < 25% sel yang terwarnai +2 = 25%-75% sel yang terwarnai +3 = > 75% sel yang terwarnai
o Skor intensitas warna = skor jumlah sel yang terwarnai x skor tampilan warna
Interpretasi skor intensitas warna : Lemah : 1-3
Sedang : 4-6 Kuat : 7-9
Adapun cara menginterpretasikan tampilan imunohistokimia tersebut diatas adalah modifikasi dari Q score.42
3.12. Analisis Data.
1. Untuk melihat gambaran karakteristik penderita undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan tipe Schmincke disajikan dalam bentuk tabulasi dan dideskripsikan.
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Penelitian
Pemeriksaan imunohistokimia matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) dilakukan
terhadap 53 sediaan blok parafin jaringan histopatologi dari biopsi nasofaring yang sebelumnya telah didiagnosa dengan pulasan Hematoksilin & Eosin sebagai undifferentiated carcinoma nasofaring yang kemudian dikelompokkan menjadi tipe Regaud sebanyak 27 kasus (50,9%) dan tipe Schmincke sebanyak 26 kasus (49,1%). Karakteristik Penderita undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan tipe Schmincke adalah sebagai berikut :
Tabel 4.1. Distribusi Penderita Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Tipe
Regaud Berdasarkan Jenis Kelamin
Jenis Kelamin Jumlah (n) Presentase (%)
Laki-Laki 21 77,78
Perempuan 6 22,22
Jumlah 27 100,00
Tabel 4.2. Distribusi Penderita Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Tipe
Regaud Berdasarkan Umur
Umur Jumlah (n) Persentase(%)
<30 5 18,52
31-40 3 11,11
41-50 6 22,22
51-60 11 40,74
61-70 2 7,41
Jumlah 27 100
Tabel 4.2. memperlihatkan bahwa berdasarkan umur, penderita undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud paling banyak dijumpai pada kelompok umur 51-60 tahun yaitu 11 kasus (40,74%).
Tabel 4.3. Distribusi Penderita Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Tipe
Schmincke Berdasarkan Jenis Kelamin
Jenis Kelamin Jumlah (n) Presentase (%)
Laki-Laki 17 65,38
Perempuan 9 34,62
Jumlah 26 100,00
Tabel 4.4. Distribusi Penderita Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Tipe
Schmincke Berdasarkan Umur
Umur Jumlah (n) Persentase(%)
<30 2 7,70
Tabel 4.4. memperlihatkan bahwa berdasarkan umur, penderita undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Schmincke paling banyak dijumpai pada kelompok umur 41-50 tahun sebanyak 8 kasus (30,77% ) kemudian diikuti dengan kelompok umur 51-60 tahun sebanyak 7 kasus (26,92%).
Tabel 4.5. Proporsi Undifferentiated Carcinoma Nasofaring tipe Schmincke dan
Regaud dan Skor Jumlah Sel yang Terwarnai
Pada tabel 4.5 didapatkan pada undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Schmincke jumlah sel yang terpulas paling banyak adalah < 25% sebanyak 15 kasus (57,7%) dan tipe Regaud sebanyak 14 kasus (51,9%). Jumlah sel yang terpulas 25%-75% untuk undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Schmincke adalah sebanyak 3 kasus (11,5%) dan tipe Regaud sebanyak 5 kasus (18,5%). Sedangkan jumlah sel yang terpulas > 75% untuk undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Schmincke dan Regaud adalah sama yaitu masing-masing sebanyak 8 kasus (30,8% dan 29,6%).
Setelah diuji dengan Chi Square, secara statistik tidak ada perbedaan proporsi jumlah sel yang terwarnai antara undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan Schmincke, dengan nilai p value > 0,05.
Tabel 4.6. Proporsi Undifferentiated Carcinoma Nasofaring tipe Schmincke dan
Regaud dengan Skor Tampilan Warna.
Tabel 4.6. memperlihatkan tampilan warna lemah dijumpai pada undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Schimncke sebanyak 15 kasus (57,7%) dan tipe Regaud sebanyak 14 kasus (51,9%). Tampilan warna sedang pada undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Schmincke sebanyak 6 kasus (23,1%) dan tipe Regaud sebanyak 7 kasus (25,9%). Tampilan warna kuat dijumpai pada undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Schmincke sebanyak 5 kasus (19, 2%) dan tipe Regaud sebayak 6 kasus (22,2%).
Setelah diuji dengan Chi Square, secara statistik tidak ada perbedaan proporsi tampilan warna antara undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan Schmincke, dengan nilai p value > 0,05
Tabel 4.7 Proporsi Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Tipe Schmincke dan
Tipe Regaud dengan Interpretasi Intensitas Warna
Dari tabel diatas, berdasarkan interpretasi intensitas warna, didapatkan pada undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan Schmincke interpretasi yang paling banyak adalah interpretasi lemah yaitu masing-masing 22 kasus (81,5%) dan 24 kasus (92,4%), sedangkan untuk interpretasi kuat masing-masing hanya sebanyak 1 kasus (3,8% dan 3,7%) .
Setelah diuji dengan Chi Square, secara statistik tidak ada perbedaan interpretasi intensitas warna antara undifferentiated carcinoma nasofaring tipe Regaud dan Schmincke, dengan nilai p value > 0,05
4.2. Pembahasan
insidensi yang meningkat setelah usia 30 tahun dan insiden puncak pada usia 40-60 tahun.
