APLIKASI SPEKTROFOTOMETRI INFRAMERAH DEKAT
UNTUK KUANTIFIKASI EUGENOL, MENTOL, DAN METIL
SALISILAT DALAM OBAT NYERI OTOT
NURTIYAS LUTHFIANI
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
ABSTRAK
NURTIYAS LUTHFIANI. Aplikasi Spektrofotometri Inframerah Dekat untuk
Kuantifikasi Eugenol, Mentol, dan Metil Salisilat dalam Obat Nyeri Otot.
Dibimbing oleh SRI MULIJANI dan RUDI HERYANTO.
Campuran eugenol, mentol, dan metil salisilat dapat dianalisis menggunakan
spektrofometri inframerah dekat (NIRS) dan dibandingkan dengan analisis
kromatografi gas. Tahapan penentuan NIRS sebagai alat analisis suatu zat ialah
uji kesesuaian alat, pembuatan model kalibrasi, uji prediksi, dan uji validasi. Uji
kesesuaian alat menghasilkan gangguan yang rendah untuk alat NIRS FOSS
Rapid Content Analyzer. Pembuatan model kalibrasi menggunakan teknik
kalibrasi multivariat (kuadrat terkecil parsial) pada kurva turunan kedua. Uji
prediksi menghasilkan nilai galat baku prediksi (SEP) untuk eugenol, mentol, dan
metil salisilat berturut-turut sebesar 0.019, 0.09, dan 0.145. Uji validasi campuran
eugenol, mentol, dan metil salisilat berturut-turut menghasilkan linearitas sebesar
0.858, 0.973, dan 0.891. Nilai kisaran (%) sebesar 67
–
119 untuk eugenol, 60
–
110
untuk mentol, dan 69
–
120 untuk metil salisilat. Nilai akurasi, keterulangan, presisi
intermediet, dan spesifisitas untuk ketiga zat aktif berturut-turut sebesar SEP > 1.4
× SEL, RSD < 2%, tidak berbeda nyata, dan > 0.900. Berdasarkan hasil uji
prediksi dan validasi, NIRS dapat digunakan untuk pengukuran campuran
eugenol, mentol, dan metil salisilat.
ABSTRACT
NURTIYAS LUTHFIANI. Aplication of Near Infrared Spectrophotometry for
Quantification of Eugenol, Menthol, and Methyl Salycilate in Analgesic Balm.
Supervised by SRI MULIJANI and RUDI HERYANTO.
APLIKASI SPEKTROFOTOMETRI INFRAMERAH DEKAT
UNTUK KUANTIFIKASI EUGENOL, MENTOL, DAN METIL
SALISILAT DALAM OBAT NYERI OTOT
NURTIYAS LUTHFIANI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Skripsi : Aplikasi
Spektrofotometri
Inframerah
Dekat
untuk
Kuantifikasi Eugenol, Mentol, dan Matil Salisilat dalam Obat
Nyeri Otot
Nama
: Nurtiyas Luthfiani
NIM
: G44096004
Disetujui
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr Sri Mulijani, MS
Rudi Heryanto, MSi
NIP 196304011991032001
NIP 19760428 2005011002
Diketahui
Ketua Departemen Kimia
Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS
NIP 195012271976032002
PRAKATA
Puji dan syukur ke hadirat Allah SWT atas rahmat dan karunia-Nya yang
berlimpah sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Penelitian ini
dilaksanakan dari bulan Februari sampai Agustus 2011 bertempat di Laboratorium
PT Taisho Pharmaceutical Indonesia, Tbk Depok.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada yang terhormat Ibu Dr Sri
Mulijani, MS selaku pembimbing pertama dan Bapak Rudi Heryanto, MSi selaku
pembimbing kedua atas petunjuk dan bimbingan yang telah diberikan kepada
penulis selama penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Terima kasih kepada
seluruh staf Departemen
Quality Operation
PT Taisho Pharmaceutical Indonesia,
Tbk dan PT Haes Brother.
Ungkapan terima kasih kepada seluruh keluarga atas dukungan dan kasih
sayangnya. Ucapan terima kasih kepada mahasiswa Ekstensi Kimia IPB yang
telah memberikan semangat, motivasi, dan dorongan dalam menyusun karya
ilmiah ini.
Semoga tulisan ini dapat bermanfaat bagi penulis maupun bagi pembaca.
Bogor, Februari 2012
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Tegal pada tanggal 9 Agustus 1986 dari Ayah Ahmad
Subekhi dan Ibu Nurjanah. Penulis merupakan putri ketiga dari empat bersaudara.
Tahun 2004 penulis lulus dari SMAN 1 Slawi dan pada tahun yang sama
lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis
memilih Program Studi D3 Analisis Kimia, Departemen Kimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Tahun 2009 penulis kembali lulus
seleksi masuk IPB untuk Program Ekstensi Departemen Kimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
vi
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ... vii
DAFTAR GAMBAR ... vii
DAFTAR LAMPIRAN ... vii
PENDAHULUAN... 1
METODE
Bahan dan Alat ... 2
Lingkup Kerja ... 2
HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji Kesesuaian Alat ... 3
Pembuatan Model Kalibrasi Eugenol, Mentol, dan Metil Salisilat ... 4
Uji Prediksi ... 6
Penentuan Standar Galat Laboratorium ... 7
Uji Validasi ... 7
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ... 8
Saran ... 9
DAFTAR PUSTAKA ... 9
vii
DAFTAR TABEL
Halaman
1
Data kalibrasi campuran eugenol, mentol, dan metil salisilat ... 5
2
Uji prediksi terhadap model kalibrasi eugenol, mentol, dan metil salisilat ... 7
3
Nilai SEL dan spesifikasinya ... 7
4 Uji parameter validasi ... 8
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Spektrum (a) dan gangguan
(b) yang dihasilkan pada uji kesesuaian alat
menggunakan NIRS FOSS Smart Probe ... 4
2 Spektrum (a) dan turunan kedua spektrum
(b) yang dihasilkan pada uji
kesesuaian alat menggunakan NIRS FOSS Rapid Content Analyzer ... 4
3 Persamaan matematika pada PLS ... 5
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Bagan alir penelititan ... 11
2 Data komposisi matriks campuran mentol, eugenol, dan metil salisilat ... 12
3 Data penentuan model kalibrasi eugenol, mentol, dan metil salisilat ... 13
4 Data dan grafik nilai PRESS eugenol, mentol, dan metil salisilat ... 15
5 Data prediksi eugenol, mentol, dan metil salisilat ... 18
6 Data SEL eugenol, mentol, dan metil salisilat ... 21
7 Kriteria nilai SEP dan
R
2... 21
8 Data akurasi ... 21
PENDAHULUAN
Proses analisis pengawasan mutu pada industri farmasi mencakup analisis bahan baku dan produk akhir. Teknik analisis kromatografi umumnya digunakan, yaitu kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) dan kromatografi gas (GC). Teknik analisis menggunakan HPLC dan GC tergolong mahal, waktu analisisnya lama, dan menghasilkan limbah bahan kimia yang berbahaya bagi lingkungan (Blanco & Alcala 2006). Hal ini menyebabkan perlunya pengembangan suatu teknik analisis pengawasan mutu yang cepat, murah, meminimumkan tingkat galat manusia dan limbah bahan kimia, dengan ketepatan dan ketelitian analisis yang tinggi (Blanco et al. 2000). Spektroskopi inframerah dekat/near infrared spectroscopy (NIRS) merupakan alternatif teknik analisis yang dapat digunakan untuk pengawasan mutu suatu zat atau campuran pada industri farmasi dengan proses analisis yang cepat, sederhana, mudah, tanpa preparasi sampel, tanpa bahan kimia, menghasilkan sedikit limbah, dan takdestruktif(USP Convention 2011).
Fenomena interaksi materi dengan gelombang elektromagnetik bersifat spesifik, baik absorpsi maupun emisi. Interaksi tersebut menghasilkan sinyal yang disadap sebagai alat analisis kualitatif dan kuantitatif. Panjang gelombang NIRS terdiri atas 2 wilayah, yaitu panjang gelombang pendek di sekitar 780– 1100 nm dan panjang gelombang panjang di sekitar 1100–2500 nm. Absorpsi yang menonjol terjadi pada wilayah inframerah tengah yang berhubungan dengan efek
overtone molekul dan vibrasi kombinasi gugus fungsi -CH, -NH, dan -OH (Luypaert et al. 2007). Sebagian besar senyawa kimia dan biokimia menunjukkan pita serapan yang khas pada wilayah spektrum inframerah dekat sehingga dapat digunakan untuk pengukuran kualitatif dan kuantitatif pada senyawa tersebut (USP Convention 2011).
Adanya tumpang-tindih spektrum dan sensitivitas yang rendah pada NIRS menyebabkan NIRS tidak dapat digunakan untuk pengukuran secara langsung dan diperlukan teknik regresi multivariat untuk mencapai pengukuran yang selektif. Teknik-teknik kalibrasi statistis multivariat yang dapat digunakan untuk pengukuran antara lain regresi linear ganda (MLR), analisis komponen utama (PCA), dan kuadrat terkecil parsial (PLS) (Rajalahti & Kvalheim 2011).
Salah satu analisis spektrum yang penting adalah membentuk model kalibrasi melalui metode pengenalan pola untuk mengidentifikasi kemiripan dan pola utama data. Metode ini menghitung persamaan regresi berdasarkan data spektrofotometri dan informasi analit yang diketahui. Selanjutnya, model ini dapat digunakan untuk memprediksikan konsentrasi sampel yang tidak diketahui. Selisih antara konsentrasi yang dibuat dan konsentrasi dugaan dari model dipakai sebagai parameter kebaikan model (Saragih 2007). Parameter kebaikan model kalibrasi tersebut meliputi R2 (koefisien determinasi), prediksi jumlah-kuadrat galat sisa (PRESS), galat baku kalibrasi (SEC), galat baku prediksi (SEP), dan simpangan nisbah kinerja (RPD).
Koefisien determinasi/R2 adalah nilai kelinearan antara prediktor dan respons. Nilai
R2 yang sangat baik adalah 0.9975 sampai 1.000. Nilai PRESS adalah ukuran kebaikan model dalam mencocokkan konsentrasi yang diperoleh dari model dengan konsentrasi yang dibuat. Nilai SEC dihasilkan dari rataan kuadrat selisih konsentrasi dugaan himpunan kalibrasi, sedangkan SEP dihasilkan dari rataan kuadrat selisih konsentrasi dugaan himpunan prediksi. Nilai PRESS, SEC, dan SEP yang semakin mendekati nol menunjukkan model yang semakin baik. Kisaran/SEP merupakan nilai kisaran konsentrasi dibandingkan dengan nilai SEP. Nilai yang baik adalah lebih dari 5. RPD adalah nisbah standar deviasi metode pembanding terhadap nilai SEP. Nilai RPD yang baik adalah lebih dari 10 (EMEA 2009).
Aplikasi NIRS dalam industri farmasi ialah untuk identifikasi bahan aktif dan bahan tambahan pada obat, mengukur kadar air, mengukur kadar bahan aktif dan bahan tambahan, serta mengukur keseragaman kandungan suatu zat pada obat (Luypaert et al. 2007). Campuran mentol, eugenol, dan metil salisilat yang terkandung pada obat nyeri otot yang diteliti pada penelitian ini merupakan senyawa organik yang dapat dianalisis secara kualitatif dan kuantitatif menggunakan NIRS.
METODE
Bahan dan Alat
Alat-alat yang digunakan pada percobaan adalah NIRS FOSS Rapid Content Analyzer, NIRS FOSS Smart Probe, wadah sampel yang berupa reflectance sample vessel, reflektor yang terbuat dari emas (gold reflector), GC Shimadzu 2010, neraca analitik, pipet volumetrik 1 mL, pipet volumetrik 20 mL, labu ukur 50 mL, labu ukur 100 mL, dan corong pemisah.
Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan adalah matriks campuran mentol, eugenol, dan metil salisilat sebanyak 27 matriks, standar pembanding mentol, eugenol, dan metil salisilat USP, o -metoksimetilbenzoat, kloroform, natrium sulfat, dan asam sulfat.
Lingkup Kerja
Penelitian terdiri atas beberapa tahap (Lampiran 1). Tahap pertama adalah pembuatan campuran eugenol, mentol, dan metil salisilat sebanyak 27 sampel. Tahap kedua adalah uji kesesuaian alat dengan menggunakan NIRS FOSS Rapid Content Analyzer dan NIRS FOSS Smart Probe. Tahap ketiga adalah analisis 27 matriks dengan NIRS dan GC. Tahap keempat adalah pembuatan model kalibrasi dengan metode PLS, tahap kelima adalah prediksi terhadap model kalibrasi dengan menggunakan sampel produksi sebanyak 100, tahap keenam adalah menentukan standar galat laboratorium (SEL), dan tahap ketujuh adalah uji parameter validasi sesuai dengan parameter validasi untuk pengukuran kandungan senyawa pada obat berdasarkan USP Convention (2011). Pembuatan Matriks Campuran Mentol, Eugenol, dan Metil Salisilat
Campuran eugenol, mentol, dan metil salisilat yang digunakan untuk pembuatan model kalibrasi dibuat di laboratorium dengan kisaran sebesar 70–120% dari kadar mentol, eugenol, dan metil salisilat dalam campuran (USP Convention 2011). Komposisi untuk masing-masing zat tersaji pada Lampiran 2. Uji Kesesuaian Alat (FOSS 2009)
Matriks nomor 2 dan 3 yang telah dibuat diukur dengan menggunakan NIRS FOSS Rapid Content Analyzer dengan cara sampel dimasukkan ke dalam wadah sampel yang berupa reflectance sample vessel, dipadatkan, kemudian ditekan dengan gold reflector
sampai tidak ada gelembung, dan diukur. Selain itu, matriks untuk nomor 1–5 diukur dengan menggunakan NIRS FOSS Smart Probe dengan cara probe dimasukkan ke dalam sampel, kemudian sampel diukur. Spektrum yang dihasilkan oleh masing-masing alat dibandingkan.
Pengukuran Matriks dan Sampel Produksi dengan NIRS untuk Pembuatan Model Kalibrasi
Sebanyak 27 matriks dan sampel produksi dianalisis dengan menggunakan NIRS FOSS Rapid Content Analyzer. Matriks diukur seperti dijelaskan pada Uji Kesesuaian Alat. Pengukuran Matriks dan Sampel Produksi dengan Metode Pembanding (GC) untuk Pembuatan Model Kalibrasi
Standar internal disiapkan dengan cara melarutkan sebanyak 1 mL o- metoksimetilbenzoat dengan kloroform ke dalam labu ukur 50 mL. Larutan kemudian ditera dengan kloroform dan dikocok hingga larut sempurna.
Larutan standar disiapkan dengan cara melarutkan sebanyak 33.5 mg eugenol dan 135 mg mentol dengan sekitar 20 mL kloroform, lalu larutan dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL. Larutan kemudian ditera dengan kloroform dan dikocok hingga larut sempurna.
Larutan standar kerja disiapkan dengan cara sebanyak 100 mg metil salisilat dilarutkan dengan 20 mL kloroform, lalu dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL. Ke dalamnya ditambahkan 20 mL larutan standar dan 1 mL standar internal, kemudian ditera dengan kloroform dan dikocok hingga larut sempurna.
Matriks dan sampel produksi ditimbang sebanyak 0.9–1.10 g, dimasukkan ke dalam corong pisah 125 mL, lalu ditambahkan 15 mL larutan natrium sulfat jenuh dan 5 mL asam sulfat. Larutan kemudian diekstraksi dengan 20 mL kloroform sebanyak 3 kali. Hasil ekstraksi dikumpulkan pada labu ukur 100 mL, ditambahkan 1 mL standar internal, lalu ditera dengan kloroform dan dikocok hingga larut sempurna. Larutan matriks dan sampel produksi serta larutan standar disaring dengan filter 0.45 µm. Hasil saringan ditampung pada vial GC untuk diinjeksikan. Pembuatan Model Kalibrasi (FOSS 2009)
Lampiran 3. Model kalibrasi ditentukan menggunakan perangkat lunak Vission dengan teknik PLS menggunakan kurva turunan kedua.
Prediksi Hasil Analisis NIRS (FOSS 2009)
Untuk memprediksi model kalibrasi, sampel dianalisis menggunakan NIRS dan metode pembandingnya. Analisis menggunakan NIRS dilakukan terhadap 100 sampel produksi yang tidak termasuk dalam himpunan kalibrasi, dengan prosedur seperti dijelaskan pada Uji Kesesuaian Alat. Prediksi dengan metode pembanding GC dilakukan terhadap 100 sampel produksi yang telah dianalisis dengan NIRS tersebut. Penyiapan standar internal, larutan standar, dan larutan standar kerja, serta pengukuran GC dilakukan seperti telah dijelaskan di atas.
Penentuan Galat Baku Prediksi
Prediksi sampel produksi dengan NIRS dan GC digunakan untuk menentukan nilai SEP dengan rumus sebagai berikut:
n n
i yv,iYV,i
1
2 SEP
Keterangan:
SEP = Galat baku prediksi
yv = Nilai analisis NIRS
YV = Nilai analisis GC
n = Jumlah sampel
Penentuan Linearitas, Akurasi, Presisi,
Spesifisitas, dan Kisaran(Mark et al. 2002)
Linearitas, akurasi, dankisaran ditentukan menggunakan perangkat lunak Vission pada saat pembuatan model kalibrasi. Spesifisitas dilakukan dengan cara mengukur sampel yang komposisinya mirip dengan campuran mentol, eugenol dan metil salisilat, kemudian spesifisitas ditentukan dengan perangkat lunak. Presisiterdiri dari atas 2 macam, yaitu keterulangan dan presisi intermediet. Keterulangan dilakukan dengan cara mengukur sampel konsentrasi 100% sebanyak 13 kali. Presisi intermediet juga dilakukan dengan cara mengukur sampel pada konsentrasi 100% sebanyak 13 kali, tetapi pengukuran dilakukan pada hari yang berbeda dengan analis yang berbeda.
Analisis dengan Metode Pembanding (BMS 1997)
Untuk memperoleh nilai SEL, matriks nomor 1, 2, 6, 15, 20, 27 (Lampiran 2)
dianalisis oleh 2 analis dengan menggunakan instrumen GC yang sama. Penyiapan standar internal, larutan standar, dan larutan standar kerja, serta pengukuran GC dilakukan seperti telah dijelaskan diatas. Hasil yang diperoleh dari pengukuran dengan GC digunakan untuk menghitung nilai SEL dengan rumus sebagai berikut:
n n
i y ,iy ,i
1 1 2
2 SEL
Keterangan:
SEL = Galat baku laboratorium
y1/2 = Nilai pengukuran metode pembanding pada kondisi yang berbeda
n = Jumlah sampel
HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji Kesesuaian Alat
Tahapan penggunaan NIRS sebagai alat analisis ialah uji kesesuaian alat/feasibility study, pembuatan model kalibrasi, uji prediksi, dan uji validasi (FOSS 2009). Uji kesesuaian alat pada NIRS mencakup pengecekan gangguan secara visual pada spektrum yang dihasilkan (EMEA 2009). Uji ini dilakukan dengan cara menganalisis matriks campuran eugenol, mentol, dan metil salisilat pada 2 model alat NIRS, yaitu NIRS FOSS Smart Probe dan NIRS FOSS Rapid Content Analyzer, kemudian melihat gangguan yang dihasilkan pada 2 model alat tersebut (FOSS 2009).
5
sedangkan sisanya adalah sampel produksi (Blanco & Alcala 2006). Model kalibrasi dibuat dengan perangkat lunak Vission menggunakan teknik kalibrasi multivariat PLS (Broad et al. 2002; Luypaert et al. 2007). Pembuatan kalibrasi ini diawali dengan pemrosesan awal spektrum untuk menghilangkan pengaruh kuat dari hamburan spektrum dan untuk meminimumkan baseline offsets. Spektrum yang digunakan adalah turunan kedua/2nd derivative (Broad et al.
2002; Blanco & Alcala 2006).
PLS dapat memprediksikan serangkaian peubah takbebas dari peubah bebas yang jumlahnya sangat banyak, memiliki struktur sistematik linear dan nonlinear dengan atau tanpa data yang hilang, serta memiliki kolinearitas yang tinggi. PLS dapat memprediksi sampel yang tidak diketahui dengan ketepatan lebih baik dibandingkan dengan teknik kalibrasi multivariat lainnya (Hopke 2003).
Gambar 3 menunjukkan persamaan yang digunakan dalam PLS. A menunjukkan data spektrum, S dan U menunjukkan skor, Fa dan Fc menunjukkan nilai loading, Ea dan Ec merupakan galat, sedangkan C menunjukkan konsentrasi data (FOSS 2009). Hasil kali Fa dan S mendekati data spektrum, sedangkan hasil kali U dan Fc mendekati konsentrasi sebenarnya. Tujuan algoritma PLS adalah meminimumkan galat dengan terus menjaga korelasi A dan C dalam hubungan dalam, U = S B (Brereton 2000).
A= S.Fa + Ea U= S.B C= U.Fc + Ea C= S.B.U +E
Gambar 3 Persamaan matematika pada PLS. Tabel 1 menunjukkan data kalibrasi campuran eugenol, mentol, dan metil salisilat. Sampel produksi untuk kalibrasi eugenol lebih banyak daripada sampel untuk kalibrasi mentol dan metil salisilat karena kadar eugenol dalam campuran lebih rendah dibandingkan dengan kadar mentol dan metil salisilat yaitu 1.370%, sedangkan kadar mentol dan metil salisilat berturut-turut 5.430 dan 10.200% (FOSS 2009).
Tabel 1 Data kalibrasi campuran eugenol, mentol, dan metil salisilat
Parameter
kalibrasi Eugenol Mentol
Metil salisilat Pemrosesan awal pektrum Turunan kedua Turunan kedua Turunan kedua Panjang gelombang (nm)
400–300, 1500–
800, 2000 –
2200
400–500 400– 2500
Jumlah faktor PLS
9 9 5 Jumlah Sampel
laboratorium
27 27 27 Jumlah sampel
produksi
40 33 33 Rerata (%) 1.386 5.191 9.562 SDa 0.174 0.699 1.223
SECb 0.065 0.116 0.389
SECVc 0.075 0.154 0.426
asimpangan baku, bgalat baku kalibrasi, cgalat baku
validasi silang
Panjang gelombang yang digunakan pada penentuan model kalibrasi eugenol adalah 400–1300, 1500–1800, dan 2000–2200 nm dengan menggunakan faktor 9. Penentuan nilai faktor merupakan hal yang sangat krusial agar diperoleh model kalibrasi yang tepat. Nilai faktor ini ditentukan berdasarkan nilai minimum dari PRESS yang menunjukkan prediksi jumlah kuadrat galat sisa yang terkecil (FOSS 2009; Septaningsih 2008). Nilai PRESS terkecil pada model kalibrasi eugenol diperoleh pada faktor 9, yaitu sebesar 0.8584 (Lampiran 4). Semakin besar nilai faktor, nilai R2 akan semakin tinggi, tetapi menurut FOSS (2009) nilai maksimum faktor yang boleh digunakan pada proses kalibrasi menggunakan perangkat lunak Vission adalah 10. Nilai faktor yang terlalu besar akan menyebabkan overfits pada model kalibrasi, sedangkan nilai yang terlalu kecil akan menyebabkan underfits (EMEA 2009). Parameter kalibrasi lainnya seperti SEC menunjukkan nilai yang baik karena mendekati nol, yaitu sebesar 0.065. Nilai SEC sebesar 0.065 maknanya ialah selisih antara nilai analisis NIRS dan nilai metode pembandingnya pada eugenol saat penentuan model kalibrasi sebesar 0.065. SEC diperoleh menggunakan rumus sebagai berikut:
p n n
i yC,i YC,i
1 2 SEC Keterangan:
YC = Nilai analisis NIRS pada set kalibrasi
yC = Nilai analisis GC pada set kalibrasi
n = jumlah sampel
6
Nilai SECV yang diperoleh untuk eugenol sebesar 0.075. SECV adalah galat baku yang terjadi pada saat validasi silang (USP Convention 2011). Nilai ini juga sangat baik karena mendekati nol. Nilai SECV diperoleh dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
p n n
i yCV,i YCV,i
1 2 SECV Keterangan:
YCV = Nilai analisis NIRS
yCV = Nilai analisis GC
n = Jumlah sampel
Rerata yang diperoleh pada kalibrasi eugenol sebesar 1.386%, dengan simpangan baku (SD) sebesar 0.174.
Berbeda dengan eugenol, panjang gelombang yang digunakan mentol adalah 400–2500 nm. Jumlah faktor yang digunakan ialah 9 karena nilai minimum log PRESS sebesar 1.8709 menunjukkan faktor 9. Himpunan sampel yang digunakan pada kalibrasi mentol menggunakan 27 matriks laboratorium dan 33 sampel produksi. Nilai rerata yang diperoleh sebesar 5.191% dengan SD sebesar 0.699. Nilai SEC juga baik karena nilainya yang mendekati nol, yaitu sebesar 0.116, tetapi belum sebaik nilai SEC eugenol. Sama halnya dengan nilai SEC, nilai SECV mentol yang diperoleh sebesar 0.154, kurang baik jika dibandingkan dengan nilai SECV eugenol. Hal ini disebabkan pengukuran mentol menggunakan seluruh panjang gelombang dari 400 sampai 2500 nm, sehingga terdapat lebih banyak matriks pengganggu dalam pembuatan model kalibrasi.
Panjang gelombang yang digunakan untuk pembuatan model kalibrasi metil salisilat sama dengan mentol, yaitu 400– 2500 nm (FOSS 2009). Jumlah faktor yang digunakan ialah 5 karena nilai minimum log PRESS sebesar 13.597 menunjukkan faktor 5. Himpunan sampel yang digunakan ialah 27 matriks laboratorium dan 33 sampel produksi. Nilai rerata yang diperoleh sebesar 9.562% dengan SD sebesar 1.233. Nilai SEC yang diperoleh 0.389, sedangkan nilai SECV 0.426. Nilai parameter uji yang diperoleh pada model kalibrasi metil salisilat ini kurang baik dibandingkan dengan eugenol dan mentol karena pada metil salisilat, selain terdapat matriks pengganggu, digunakan semua kisaran panjang gelombang dari 400 sampai 2500 nm, faktor yang dipakai juga terlalu kecil, yaitu 5, sehingga kemungkinan terjadi
underfits pada spektrum yang digunakan untuk pembuatan model kalibrasi.
Uji Prediksi
Model kalibrasi yang telah diperoleh perlu diuji prediksi untuk membuktikan kebaikannya. Menurut Blanco & Alcala (2006), uji prediksi dilakukan menggunakan 2 himpunan sampel, yaitu sampel produksi dan laboratorium, yang tidak digunakan untuk proses kalibrasi. Uji prediksi pada penelitian ini dilakukan hanya dengan menggunakan sampel produksi sebanyak 100 batch karena model kalibrasi akan digunakan untuk analisis sampel produksi saja. Proses prediksi akan menghasilkan nilai SEP, yang merupakan ukuran ketepatan dari suatu model kalibrasi yang dibuat (USP Convention 2011). Nilai SEP semakin baik jika semakin mendekati nol (Septaningsih 2008). Selain nilai SEP, pada proses prediksi dapat diketahui nilai rerata galat pengukuran analisis NIRS dan GC yang disebut bias (EMEA 2009). Nilai bias dapat ditentukan dengan rumus sebagai berikut:
n n
i (yi Yi)
1
Bias
Keterangan:
Y = Nilai analisis NIRS
y = Nilai analisis GC
n = Jumlah sampel
7
Tabel 2 Uji prediksi terhadap model kalibrasi eugenol, mentol, dan metil salisilat
Parameter
kalibrasi Eugenol Mentol
Metil salisilat Jumlah sampel
laboratorium
- - - Jumlah sampel
produksi
100 100 100 Rerata (%) 1.425 5.384 10.085 SDa 0.018 0.085 0.137
RSD (%)b 1.263 1.579 1.358
Bias 0.001 0.034 0.035 SEP 0.019 0.090 0.145
a
simpangan baku, bsimpangan baku relatif
Prediksi yang dilakukan terhadap model kalibrasi mentol menghasilkan rerata kadar sebesar 5.384% dengan nilai SD 0.085 dan nilai RSD 1.579%. Nilai rerata yang diperoleh sesuai dengan spesifikasi kadar mentol, yaitu 4.89–6.24% (BMS 1997). Nilai SD lebih besar dibandingkan dengan eugenol, begitu juga dengan nilai RSD. Meskipun nilai RSD eugenol lebih baik dibandingkan dengan mentol, nilai ini masih sesuai dengan spesifikasi karena kurang dari 2% (TPI 2010). Nilai SEP yang diperoleh 0.090 (Lampiran 5). Menurut Septaningsih (2008), nilai ini juga sangat baik karena mendekati nol, tetapi karena nilai SEL-nya 0.069 (Lampiran 6), nilai SEP ini lebih dari 1.4×SEL. Menurut spesifikasi EMEA (2009), nilai SEP yang baik adalah kurang dari 1.4×SEL. Menurut Cuadrado et al. (2004), nilai SEP yang diperoleh menunjukkan presisi yang baik karena besarnya 3 × nilai SEL-nya (Lampiran 7). Secara keseluruhan, hasil uji parameter prediksi pada mentol kurang baik dibandingkan dengan uji prediksi eugenol. Hal ini disebabkan penggunaan semua kisaran panjang gelombang dari 400 sampai 2500 nm, sehingga terdapat lebih banyak matriks pengganggu.
Prediksi yang dilakukan terhadap model kalibrasi metil salisilat menghasilkan rerata kadar sebesar 10.085% dengan nilai SD 0.137 dan nilai RSD 1.358%. Nilai rerata yang diperoleh sesuai dengan spesifikasi kadar metil salisilat, yaitu 9.18–11.7% (BMS 1997). Nilai SD tergolong baik karena mendekati nol. Begitu juga dengan nilai RSD yang kurang dari 2% (TPI 2010). Nilai SD yang dihasilkan pada uji prediksi metil salisilat ini lebih besar dibandingkan pada uji prediksi eugenol dan mentol. Demikian pula dengan nilai SEP yang diperoleh, yaitu 0.145 (Lampiran 5). Menurut Septaningsih (2008), nilai SEP ini sangat baik karena mendekati nol, tetapi karena nilai SEL-nya 0.030 (Lampiran 6), nilai SEP ini belum memenuhi spesifikasi EMEA (2009), yakni
harus kurang dari 1.4×SEL. Menurut Cuadrado et al. (2004), nilai SEP yang diperoleh menunjukkan presisi menengah karena besarnya 2.1 × nilai SEL (Lampiran 7). Secara keseluruhan, uji parameter prediksi pada metil salisilat menunjukkan nilai yang kurang baik dibandingkan dengan nilai uji prediksi eugenol dan mentol, kecuali untuk nilai RSD. Nilai RSD metil salisilat lebih kecil daripada nilai RSD mentol.
Nilai SEP dari suatu model kalibrasi yang mendekati nol dapat diartikan sebagai kedekatan antara hasil analisis NIRS dan analisis GC. Berdasarkan nilai SEP yang diperoleh untuk eugenol, mentol, dan metil salisilat, nilai analisis NIRS sangat dekat dengan nilai analisis GC.
Penentuan Standar Galat Laboratorium
Kebaikan nilai SEP ditentukan dengan membandingkannya dengan nilai SEL. SEL ditentukan dengan menganalisis sampel dalam 2 variasi pengukuran yang berbeda (Cuadrado
et al. 2004). Variasi pengukuran dapat menggunakan analis yang berbeda, instrumen analisis yang berbeda, dan waktu analisis yang berbeda (FOSS 2009). Pengukuran SEL pada campuran eugenol, mentol, dan metil salisilat dalam penelitian ini menggunakan variasi analis.
Tabel 3 menunjukkan nilai SEL untuk masing-masing zat aktif beserta spesifikasi-nya menurut EMEA (2009), yaitu 1.4 kali nilai SEL zat aktif tersebut. Terlihat bahwa nilai SEL eugenol paling kecil dibandingkan dengan lainnya. Hal ini menunjukkan tingkat galat laboratorium untuk eugenol sangat rendah.
Tabel 3 Nilai SEL dan spesifikasi-nya
Zat aktif SEL Spesifikasi Eugenol 0.012 0.017 Mentol 0.069 0.097 Metil salisilat 0.030 0.042 Sumber: EMEA (2009)
Uji Validasi
Tabel 4 Uji parameter validasi
Parameter Eugenol Mentol Metil salisilat
Linearitas dan kisaran
R2 0.858 0.973 0.891
Kisaran (%) 67-119 60-110 69-120
Akurasi
SEP 0.019 0.090 0.145 SEL 0.012 0.030 0.069 1.4×SEL 0.017 0.042 0.097 Kisaran/SEP 39.421 30.222 36.386 RPD 9.157 7.768 8.435
Presisi Keterulangan
Rerata 1.412 5.444 10.233 SD 0.008 0.037 0.030 RSD 0.567 0.680 0.293
Presisi Intermediet
F hitung 0.979 0.686 0.497 F tabel 2.687 2.687 2.687
Spesifisitas
Sampel 1 0.696 0.696 0.696 Sampel 2 0.700 0.700 0.700 Sampel 3 0.732 0.732 0.732 Sampel 4 0.669 0.669 0.669 Sampel 5 0.691 0.691 0.691 Sampel 6 0.999 0.999 0.999 Sampel 7 0.998 0.998 0.998 Sampel 8 0.998 0.998 0.998 Sampel 9 0.998 0.998 0.998 Sampel 10 0.998 0.998 0.998
Tabel 4 menunjukkan nilai regresi untuk eugenol, mentol, dan metil salisilat berturut-turut sebesar 0.858, 0.973, dan 0.891. Nilai regresi mentol paling baik karena paling mendekati satu, sehingga paling menunjukkan kedekatan antara nilai analisis NIRS dan GC. Nilai kisaran untuk ketiga zat aktif menunjukkan, hanya kisaran metil salisilat memenuhi spesifikasi 70–120%; ±2% (BMS 1997). Mentol dan eugenol tidak memenuhi spesifikasi untuk kisaran, diduga karena pada saat proses pengukuran sebagian zat atsiri tersebut menguap (USP Convention 2011). Uji akurasi ditunjukkan dengan nilai SEP dan merupakan kedekatan nilai analisis yang diperoleh dengan nilai sebenarnya (ICH 1996; USP Convention 2011). Menurut EMEA (2009), kriteria penerimaan nilai SEP sebesar 1.4×SEL. Nilai SEP yang diperoleh tidak masuk dalam kriteria tersebut, tetapi dapat dijustifikasi dengan nilai nisbah kisaran terhadap SEP serta nilai RPD (Lampiran 8). Nisbah kisaran terhadap SEP harus lebih besar dari 10 (EMEA 2009), dan hasil penelitian untuk eugenol, mentol, dan metil salisilat seluruhnya memenuhi kriteria. RPD merupakan nisbah SD metode pembanding terhadap nilai SEP. Menurut EMEA (2009), kriteria penerimaan nilai RPD harus lebih besar dari 5. Nilai RPD untuk eugenol, mentol, dan metil salisilat juga memenuhi kriteria tersebut.
Uji presisi terdiri atas uji keterulangan dan presisi intermediet. Uji keterulangan adalah presisi yang dihasilkan pada kondisi pengoperasian yang sama pada waktu yang pendek. Sampel dianalisis minimum 6 kali ulangan pada konsentrasi 100%. Uji keterulangan pada penelitian ini dilakukan dengan analisis sampel konsentrasi 100% sebanyak 13 kali ulangan (ICH 1996; USP Convention 2011). Nilai RSD yang diperoleh berturut-turut untuk eugenol, mentol, dan metil salisilat sebesar 0.567, 0.680, dan 0.293%. Nilai ini memenuhi kriteria penerimaan RSD menurut TPI (2010).
Uji presisi intermediet dilakukan dengan cara melakukan analisis NIRS untuk sampel yang sama dengan menggunakan 2 analis yang berbeda (ICH 1996). Terhadap hasil analisis yang diperoleh dilakukan uji statistika, yaitu uji F, dan dilihat perbedaan di antara kedua pengukuran tersebut. Berdasarkan uji statistika yang dilakukan, nilai F hitung lebih kecil daripada F tabel sehingga tidak ada perbedaan yang nyata di antara 2 pengukuran yang dilakukan oleh 2 analis (Lampiran 9).
Spesifisitas adalah kemampuan suatu metode analitik untuk mengukur analit tanpa adanya gangguan dari komponen lainnya (ICH 1996; USP Convention 2011). Uji spesifisitas dilakukan dengan pengukuran sampel yang komposisinya mirip, tetapi berbeda zat aktifnya, yaitu sampel nomor 1–5 dan 6–10 (Lampiran 2). Spesifikasi untuk sampel yang diuji menunjukkan nilai identifikasi (ID) lebih dari 0.900, sedangkan untuk sampel yang komposisinya sama, tetapi berbeda zat aktifnya menunjukkan ID kurang dari 0.900 (FOSS 2009). Uji spesifisitas yang dilakukan pada penelitian telah menunjukkan komponen pada matriks adalah eugenol, mentol, dan metil salisilat, dengan ditunjukkan nilai ID lebih dari 0.900.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
analisis NIRS sangat dekat dengan nilai analisis GC. Uji validasi campuran eugenol, mentol, dan metil salisilat menghasilkan linearitas masing-masing sebesar 0.858, 0.973, dan 0.891. Nilai kisaran (%) menunjukkan nilai sebesar 67–119 untuk eugenol, 60–110 untuk mentol, 69–120 untuk metil salisilat. Uji keterulangan untuk ketiga zat aktif menghasilkan nilai RSD kurang dari 2%, yaitu 0.567% untuk eugenol, 0.680% untuk mentol, dan 0.293% untuk metil salisilat. Uji presisi intermediet dengan uji F menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata, dan uji spesifisitas menunjukkan nilai ID lebih besar dari 0.900.
Saran
Penelitian lebih lanjut dibutuhkan untuk menyempurnakan model kalibrasi, proses prediksi NIRS, dan proses pembandingan dengan metode pembandingnya agar diperoleh nilai linearitas yang sangat baik, yaitu antara 0.9975 dan 1.0000, nilai bias yang mendekati nol, dan nilai SEP sekitar 1– 1.5 kali nilai SEL.
DAFTAR PUSTAKA
Blanco M, Alcala M. 2006. Simultaneous quantitation of five active principles in a pharmaceutical preparation: Development and validation of a near infrared spectroscopic method. Eur J Pharmaceut Sci 27: 280-286.
Blanco M, Eustaquio A, Gonzales JM, Serrano D. 2000. Identification and quantitation assays for intact tablets of two related pharmaceutical preparations by reflectance near-infrared spectroscopy: Validation of the procedure. J Pharm Biomed Anal 22:13-48.
BMS [Bristol Myers Squibb]. 1997. Assay for Methyl Salicylate, Eugenol, dan Menthol
(GC). 1997. Jakarta: BMS.
Brereton RG. 2000. Introducing to multivariate calibration in analytical chemistry. Analyst 126:2125-2154. Broad NW, Jee RD, Moffat AC, Smith MR.
2001. Application of transmission near-infrared spectroscopy to uniformity of content testing of intact steroid tablets.
Analyst 126: 2207-2211.
Buchi. 2011. How NIR Can Help GMP? Jakarta: Buchi Indonesia.
Cuadrado MU, Luque de Castro MD, Perez-Juan PM, Garcia-Olmo J, Gomez-Nieto MA. 2004. Near infrared reflectance spectroscopy and multivariate analysis in
enology, determination or screening of fifteen parameters in different types of wines. Anal Chim Acta 527:81-88.
[EMEA] European Medicines Agency. 2009.
Guideline on The Use of Near Infrared Spectroscopy by The Pharmaceutical Industry and The Data Requirements for New Submissions and Variations. London: EMEA.
FOSS. 2009. A Guide to Near-infrared Spectroscopic Analysis of Industrial Manufacturing Processes. Jakarta: FOSS Indonesia.
Hopke Pk. 2003. The evolution of chemometrics. Anal Chim Acta 500:365-377.
[ICH] International Conference on Harmonisation. 1996. Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2 (R1). Jenewa: ICH. Luypaert J, Massart DL, Heyden YV.
Near-infrared spectroscopy applications in pharmaceutical analysis. Talanta 72:865-883.
Mark H, Ritchie GE, Roller RW, Ciurczak EW, Tso C, MacDonald SA. 2002. Validation of a near-infrared transmission spectroscopic procedure, part A: Validation protocols. J Pharm Biomed Anal 28:251-260.
Rajalahti T, Kvalheim OM. 2011. Multivariate data analysis in pharmaceutics: A tutorial review. Int J Pharm 417:280-90.
Reich G. 2005. Near-infrared spectroscopy and imaging: Basic principles and pharmaceutical applications. Adv Drug Delivery Rev 57:1109-1143.
Saragih MA. 2007. Metode analisis simultan natrium benzoat dan kalium sorbat menggunakan kombinasi spektrofotometri dan kalibrasi multivariat [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Septaningsih DA. 2008. Penentuan simultan natrium benzoat dan kalium sorbat dengan pendekatan kalibrasi multivariat secara spektrofotometri UV [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
TPI [Taisho Pharmaceutical Indonesia]. 2010.
Validasi Metode Analisa. Jakarta: TPI. [USP Convention] United States
11
Lampiran 1 Bagan alir penelititan
Preparasi matriks
dan sampel produksi Analisis GC Analisis NIRS
Sampel Produksi Pembuatan model
kalibrasi
Prediksi model kalibrasi
12
Lampiran 2 Data komposisi matriks campuran mentol, eugenol, dan metil salisilat
Nomor Sampel Mentol (%) Eugenol (%) Metil salisilat (%)
1 70 70 70
2 70 90 110
3 70 110 120
4 80 100 100
5 80 100 120
6 80 110 70
7 80 110 90
8 80 110 100
9 90 70 120
10 90 100 80
11 90 120 100
12 100 80 100
13 100 80 120
14 100 100 80
15 100 100 100
16 100 100 120
17 100 120 80
18 100 120 100
19 100 120 110
20 110 80 90
21 110 90 70
22 110 90 100
23 120 70 90
24 120 70 100
25 120 80 110
26 120 100 100
27 120 120 120
Keterangan:
13
Lampiran 3 Data penentuan model kalibrasi eugenol, mentol, dan metil salisilat
Nomor Peubah bebas (Spektrum NIRS) Peubah takbebas (Respons)
Sampel λ
1 λ2 λ3 ….. λn Eugenol Mentol Metil
salisilat
1 ……. ……. ……. ……. ……. 0.9700 3.7720 6.9160
2 ……. ……. ……. ……. ……. 1.2840 3.8470 10.6090
3 ……. ……. ……. ……. ……. 1.5730 3.8900 11.5590
4 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4150 4.3570 9.7590
5 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4420 4.3700 11.6100
6 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4630 4.0510 6.3630
7 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4930 4.1190 8.0750
8 ……. ……. ……. ……. ……. 1.5030 4.1040 8.8590
9 ……. ……. ……. ……. ……. 1.3220 4.2440 6.7700
10 ……. ……. ……. ……. ……. 0.9800 4.4440 9.6360
11 ……. ……. ……. ……. ……. 1.6220 4.4300 8.4470
12 ……. ……. ……. ……. ……. 1.1240 5.0180 8.6780
13 ……. ……. ……. ……. ……. 1.0880 4.7760 9.8180
14 ……. ……. ……. ……. ……. 1.3810 4.9940 7.0870
15 ……. ……. ……. ……. ……. 1.3450 4.8210 8.4450
16 ……. ……. ……. ……. ……. 1.3730 5.0820 10.6460
17 ……. ……. ……. ……. ……. 1.6530 5.3050 7.7780
18 ……. ……. ……. ……. ……. 1.6960 5.3740 9.7810
19 ……. ……. ……. ……. ……. 1.6910 5.4370 10.8210
20 ……. ……. ……. ……. ……. 1.1610 5.9100 8.9360
21 ……. ……. ……. ……. ……. 1.2710 5.9030 7.1610
22 ……. ……. ……. ……. ……. 1.2760 5.8770 9.7020
23 ……. ……. ……. ……. ……. 1.0360 6.3610 8.8140
24 ……. ……. ……. ……. ……. 1.0280 6.4140 9.5780
25 ……. ……. ……. ……. ……. 1.1540 6.4570 10.7370
26 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4160 6.4070 9.7080
27 ……. ……. ……. ……. ……. 1.7150 6.4670 11.6010
1A1561 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4300 5.3300 9.9100
1A0761 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4500 5.4700 10.0500
1A1801 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4200 5.3100 9.9600
1A0201 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4200 5.3600 10.1800
1A0511 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4700 5.4600 10.1800
1A0811 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4300 5.4000 10.2800
1A1811 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4400 5.3700 10.1300
1A0031 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4500 5.3700 10.0800
1A0641 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4700 5.4900 10.2600
1A0741 ……. ……. ……. ……. ……. 1.3900 5.2700 9.9800
1A0771 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4400 5.4700 10.0300
1A0011 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4300 5.3500 10.0300
1A0681 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4100 5.3500 10.1400
1A0691 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4200 5.3200 9.9300
1A1631 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4300 5.3500 10.0000
1A0331 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4300 5.3600 10.0500
1A0661 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4300 5.3000 9.9900
1A0711 ……. ……. ……. ……. ……. 1.3900 5.2900 10.0800
1A0721 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4200 5.4200 9.9400
1A0751 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4100 5.3300 9.7400
1C3471 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4200 5.3400 9.9200
1C3831 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4300 5.4400 10.0600
14
lanjutan Lampiran 3
Nomor Peubah bebas (Spektrum NIRS) Peubah takbebas (Respons)
Sampel λ
1 λ2 λ3 ….. λn Eugenol Mentol Metil
salisilat
1C3801 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4100 5.4500 10.2300
1C4261 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4400 5.4800 10.0800
1C4111 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4200 5.3100 10.0000
1C4121 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4300 5.3300 10.0400
1C3791 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4300 5.4400 10.2300
1C3781 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4200 5.3400 10.0700
1C4031 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4100 5.4100 10.0700
1C3761 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4200 5.4000 10.0100
1C3881 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4200 5.3200 10.0400
1C3841 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4100 5.4500 10.1400
0J9721 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4800 5.3600 9.9100
1A1551 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4400 5.4400 10.2100
1A0781 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4300 5.4800 10.0300
1A1121 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4400 5.3700 10.2200
1A1771 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4300 5.4200 10.1700
1A1581 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4200 5.3200 9.9000
1A1201 ……. ……. ……. ……. ……. 1.4100 5.3700 10.0400
15
Lampiran 4 Data dan grafik nilai PRESS eugenol, mentol, dan metil salisilat 1. Data nilai PRESS eugenol
Faktor R2 SEC PRESS SECV
Faktor 1 0.143 0.1516 2.2058 0.1602
Faktor 2 0.3219 0.1357 2.0542 0.1546
Faktor 3 0.4702 0.1206 1.4236 0.1287
Faktor 4 0.6157 0.1034 1.1414 0.1152
Faktor 5 0.6842 0.0943 1.0944 0.1128
Faktor 6 0.7841 0.0785 0.746 0.0931
Faktor 7 0.8358 0.0689 0.5803 0.0821
Faktor 8 0.8512 0.066 0.4895 0.0754
Faktor 9 0.8584 0.0648 0.4822 0.0749
Faktor 10 0.8651 0.0636 0.5273 0.0783
Faktor 11 0.8821 0.0599 0.6074 0.084
Faktor 12 0.8912 0.058 0.6218 0.085
Faktor 13 0.908 0.0537 0.6728 0.0884
Faktor 14 0.9191 0.0507 0.6642 0.0879
Faktor 15 0.9301 0.0474 0.7255 0.0919
Faktor 16 0.9408 0.044 0.7645 0.0943
16
lanjutan Lampiran 4
3. Data nilai PRESS mentol
Faktor R2 SEC PRESS SECV
Faktor 1 0.5388 0.456 18.901 0.4891
Faktor 2 0.6154 0.4192 16.9265 0.4629
Faktor 3 0.8839 0.2319 6.2581 0.2815
Faktor 4 0.9137 0.2012 4.6088 0.2415
Faktor 5 0.9355 0.1751 4.1203 0.2284
Faktor 6 0.9559 0.1458 2.9195 0.1922
Faktor 7 0.9606 0.1388 2.2737 0.1697
Faktor 8 0.9659 0.13 2.1832 0.1662
Faktor 9 0.9732 0.1161 1.8709 0.1539
Faktor 10 0.9787 0.1044 2.0147 0.1597
Faktor 11 0.9808 0.0997 2.0327 0.1604
Faktor 12 0.985 0.0888 2.3638 0.173
Faktor 13 0.9868 0.084 2.49 0.1775
Faktor 14 0.9893 0.0763 2.6741 0.184
Faktor 15 0.9906 0.072 2.878 0.1909
Faktor 16 0.9919 0.0672 3.055 0.1966
17
lanjutan Lampiran 4
5. Data nilai PRESS metil salisilat
Faktor R2 SEC PRESS SECV
Faktor 1 0.6014 0.7247 40.7506 0.7371
Faktor 2 0.831 0.4751 19.3365 0.5078
Faktor 3 0.8738 0.4134 15.8261 0.4594 Faktor 4 0.8796 0.4067 13.8619 0.4299
Faktor 5 0.8913 0.3893 13.5974 0.4258
Faktor 6 0.9005 0.3751 13.854 0.4298
Faktor 7 0.9098 0.3599 16.3679 0.4672
Faktor 8 0.92 0.3414 16.5219 0.4694
18
Lampiran 5 Data prediksi eugenol, mentol, dan metil salisilat
Nomor Eugenol Eugenol Mentol Metil salisilat
NIRS GC NIRS GC NIRS GC
1 1A1541-1 1.427 1.440 5.366 5.410 9.819 10.020
2 1A0501-1 1.410 1.490 5.397 5.460 9.929 10.200
3 1A1181-1 1.452 1.430 5.460 5.400 10.119 10.080
4 1A0791-1 1.426 1.430 5.394 5.490 10.122 10.040
5 1A0651-1 1.430 1.470 5.423 5.460 10.230 10.220
6 1A1151-1 1.425 1.420 5.459 5.390 10.168 10.080
7 1A1101-1 1.431 1.430 5.473 5.360 10.214 10.200
8 1A1171-1 1.433 1.410 5.472 5.380 10.166 10.060
9 1A1161-1 1.452 1.420 5.414 5.440 10.124 10.160
10 1A0671-1 1.401 1.430 5.348 5.390 10.112 10.200
11 1A1141-1 1.423 1.430 5.423 5.390 10.158 10.260
12 1A1131-1 1.445 1.430 5.447 5.360 10.196 10.210
13 1A1211-1 1.442 1.440 5.439 5.400 10.039 10.280
14 1A0801-1 1.453 1.430 5.408 5.470 10.144 10.020
15 1A1111-1 1.433 1.440 5.461 5.380 10.058 10.250
16 1A1191-1 1.445 1.420 5.466 5.410 10.085 10.080
17 1A1231-1 1.439 1.410 5.383 5.360 10.031 10.030
18 1A1531-1 1.434 1.420 5.514 5.400 10.160 10.080
19 1A0021-1 1.412 1.460 5.282 5.340 9.855 10.140
20 1A1241-1 1.442 1.420 5.403 5.310 9.944 10.060
21 1B2361 1.423 1.440 5.440 5.460 9.684 10.200
22 1B2331 1.430 1.420 5.475 5.450 10.194 10.180
23 1B2351 1.445 1.430 5.317 5.380 10.308 10.060
24 1B2601 1.455 1.410 5.418 5.420 10.165 10.140
25 1B2341 1.438 1.420 5.421 5.400 10.049 10.060
26 1B1961 1.434 1.420 5.416 5.300 9.989 10.090
27 1B2151 1.419 1.410 5.205 5.210 10.203 10.070
28 1B1951 1.435 1.410 5.439 5.320 10.162 10.130
29 1B2281 1.430 1.420 5.471 5.360 10.229 10.080
30 1B2161 1.428 1.420 5.518 5.410 10.160 10.000
31 1A1821 1.407 1.400 5.333 5.250 9.924 9.960
32 1B1881 1.397 1.430 5.346 5.350 10.042 10.140
33 1B1891 1.408 1.410 5.402 5.300 10.155 10.040
34 1B2291 1.422 1.420 5.481 5.410 10.232 10.090
35 1B2131 1.420 1.430 5.453 5.390 10.214 10.110
36 1B2621 1.435 1.420 5.575 5.400 10.228 10.070
19
lanjutan Lampiran 5
Nomor Eugenol Eugenol Mentol Metil salisilat
NIRS GC NIRS GC NIRS GC
38 1B2371 1.426 1.420 5.508 5.410 10.201 10.130
39 1B2611 1.414 1.410 5.441 5.410 10.099 10.120
40 1B2591 1.395 1.420 5.442 5.340 10.036 9.890
41 1B2621 1.404 1.420 5.424 5.400 9.911 10.070
42 1B2321 1.388 1.410 5.313 5.340 10.179 10.030
43 1B2141 1.435 1.420 5.539 5.390 10.281 10.130
44 1B2381 1.425 1.410 5.394 5.330 10.215 10.020
45 1B2811 1.408 1.430 5.403 5.370 9.894 10.120
46 1B2641 1.427 1.430 5.537 5.570 10.403 10.220
47 1B2841 1.435 1.440 5.549 5.420 10.279 10.270
48 1B2651 1.436 1.420 5.504 5.460 10.179 10.050
49 1B2781 1.412 1.440 5.429 5.320 9.981 10.080
50 1B2771 1.417 1.440 5.369 5.410 10.095 10.130
51 1B2801 1.429 1.420 5.351 5.390 10.036 10.080
52 1B2791 1.460 1.440 5.388 5.380 10.220 10.210
53 1B2761 1.426 1.410 5.479 5.470 10.304 10.140
54 1B3121 1.436 1.420 5.425 5.350 10.067 10.080
55 1B2831 1.425 1.440 5.367 5.390 10.149 10.220
56 1B2821 1.440 1.430 5.346 5.430 10.283 10.250
57 1B3111 1.434 1.430 5.305 5.350 10.117 10.070
58 1C3351 1.434 1.400 5.484 5.370 10.283 10.040
59 1C3231 1.426 1.410 5.373 5.300 10.116 9.920
60 1C3391 1.429 1.440 5.340 5.350 10.090 10.130
61 1C3381 1.408 1.430 5.304 5.350 9.998 10.130
62 1C3211 1.447 1.440 5.559 5.330 10.320 10.120
63 1C3241 1.431 1.410 5.417 5.340 10.056 10.060
64 1C3221 1.440 1.420 5.468 5.320 10.231 10.060
65 1C3361 1.444 1.420 5.384 5.310 10.112 10.020
66 1C3881 1.420 1.420 5.360 5.320 10.161 10.040
67 1C3841 1.407 1.410 5.415 5.450 10.152 10.140
68 1C4141 1.408 1.420 5.276 5.360 10.040 10.030
69 1C3871 1.399 1.400 5.360 5.320 10.079 9.920
70 1C3371 1.431 1.440 5.349 5.410 9.913 10.090
71 1C3771 1.413 1.430 5.456 5.330 10.169 10.090
72 1C3821 1.407 1.420 5.315 5.440 10.086 10.210
73 1C4271 1.433 1.430 5.413 5.410 10.285 10.040
20
lanjutan Lampiran 5
Nomor Eugenol Eugenol Mentol Metil salisilat
NIRS GC NIRS GC NIRS GC
75 1C4171 1.450 1.440 5.600 5.450 10.322 10.140
76 1C4161 1.414 1.440 5.390 5.410 10.157 10.070
77 1C4151 1.438 1.450 5.306 5.410 10.040 10.030
78 1C4281 1.425 1.420 5.431 5.360 10.196 10.010
79 1C4291 1.443 1.430 5.536 5.380 10.187 10.040
80 1C4301 1.407 1.420 5.384 5.360 9.982 10.000
81 1D4601 1.422 1.450 5.405 5.370 10.185 9.990
82 1D4611 1.411 1.410 5.413 5.310 10.153 9.960
83 1D4631 1.403 1.430 5.350 5.460 10.240 10.030
84 1C3811 1.418 1.410 5.487 5.400 10.108 10.130
85 1C3781 1.441 1.420 5.554 5.340 10.280 10.070
86 1A1221 1.410 1.420 5.462 5.350 10.222 10.040
87 1D4621 1.393 1.430 5.332 5.480 10.081 10.070
88 1C4121 1.454 1.430 5.616 5.350 10.096 10.040
89 1D4691 1.402 1.430 5.509 5.390 10.266 9.920
90 1D4701 1.408 1.470 5.341 5.340 10.168 9.980
91 1D4731 1.402 1.420 5.367 5.360 10.078 10.040
92 1C3761 1.451 1.420 5.279 5.400 10.158 10.010
93 1C3831 1.432 1.430 5.483 5.440 10.142 10.060
94 1C4261 1.382 1.440 5.458 5.480 9.974 10.080
95 1D5101 1.409 1.420 5.355 5.480 10.164 10.020
96 1C3471 1.426 1.420 5.388 5.340 10.150 9.920
97 1C4111 1.429 1.420 5.458 5.310 10.059 10.000
98 1C4131 1.411 1.430 5.533 5.380 10.094 10.060
99 1C3801 1.419 1.410 5.425 5.450 10.078 10.230
100 1C3791 1.423 1.430 5.386 5.440 9.948 10.230
Contoh perhitungan:
√
√
21
Lampiran 6 Data SEL eugenol, mentol, dan metil salisilat
Sampel
Eugenol Mentol Metil salisilat
Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 1 Ulangan 2
1 1.6545 1.6680 6.3465 6.4030 11.3570 11.4525
2 1.1615 1.1745 5.7750 5.8010 8.9840 9.0315
3 1.4035 1.3860 5.3155 5.3250 9.7420 9.6380
4 1.4340 1.4280 4.2655 4.2330 7.3155 7.2435
5 1.2970 1.3000 3.8865 3.8820 10.3805 10.3995
6 0.9670 0.9775 3.7245 3.7425 6.9295 6.9525
Contoh Perhitungan:
√
= 0.012
Lampiran 7 Kriteria nilai SEP dan R2
1. Kriteria nilai SEP
SEP Kriteria
1–1 .5 SEL Presisi sangat baik 2–3 SEL Presisi baik 4 SEL Presisi menengah 5 SEL Presisi rendah Sumber: Cuadrado et al. 2004 2. Kriteria nilai R2
R2 Kriteria
≥ 0.90 Presisi sangat baik
0.70–0.89 Presisi baik
0.59–0.69 Pemisahan yang baik di antara nilai rendah, tengah, dan tinggi 0.30–0.49 Pemisahan yang baik di antara nilai rendah dan tinggi
0.05–0.29 Lebih baik daripada tidak menganalisis Sumber: Cuadrado et al. (2004)
Lampiran 8 Data akurasi Zat aktif Konsentrasi
Minimum
Konsentrasi Maksimum
Kisaran SEP SD Kisaran
/SEP
RPD
Eugenol 0.970 1.719 0.749 0.019 0.174 39.421 9.157
Mentol 3.765 6.485 2.720 0.090 0.699 30.222 7.768
Metil salisilat 6.3570 11.633 5.276 0.145 1.223 36.386 8.435 Contoh perhitungan:
22
Lampiran 9 Data uji presisi 1. Data uji keterulangan
Sampel Eugenol (%) Mentol (%) Metil salisilat (%)
P1 1.4052 5.5024 10.2601
P2 1.4014 5.3961 10.1891
P3 1.4131 5.4479 10.2268
P4 1.4158 5.4181 10.2479
P5 1.4139 5.4836 10.2537
P6 1.4056 5.3790 10.1624
P7 1.3996 5.5020 10.2176
P8 1.4132 5.4516 10.1923
P9 1.4163 5.4379 10.2118
P10 1.4117 5.4505 10.2437
P11 1.4141 5.4451 10.2461
P12 1.4209 5.4393 10.2488
23
lanjutan Lampiran 9
2. Data uji presisi intermediet
No Eugenol Mentol Metil salisilat
Analis A Analis B Analis A Analis B Analis A Analis B
1 1.4052 1.4172 5.5024 5.3549 10.2601 10.2546
2 1.4014 1.4157 5.3961 5.3858 10.1891 10.2717
3 1.4131 1.4230 5.4479 5.3224 10.2268 10.2088
4 1.4158 1.4141 5.4181 5.3642 10.2479 10.1920
5 1.4139 1.4250 5.4836 5.4246 10.2537 10.2267
6 1.4056 1.4293 5.3790 5.3833 10.1624 10.2313
7 1.3996 1.4221 5.5020 5.3302 10.2176 10.1864
8 1.4132 1.4042 5.4516 5.3781 10.1923 10.2185
9 1.4163 1.4103 5.4379 5.3856 10.2118 10.1737
10 1.4117 1.4129 5.4505 5.3509 10.2437 10.1609
11 1.4141 1.4124 5.4451 5.3339 10.2461 10.1380
12 1.4209 1.4044 5.4393 5.4083 10.2488 10.2137
13 1.4270 1.4194 5.4231 5.4124 10.2035 10.2021
3. Data uji statistika presisi intermediet
Zat Aktif Uji F Kesimpulan
F Hitung F Tabel
Eugenol 0.9787 2.6870 Tidak berbeda nyata
Mentol 0.6862 2.6870 Tidak berbeda nyata
