Laporan Miktek Hewan Embedding Ginjal

PREPARA

PREPARAT IRISAN UNTT IRISAN UNTUK HEWAN (METODE PARAFIN)UK HEWAN (METODE PARAFIN)

Oleh : Oleh :

Oleh Oleh :: N

Naammaa : : DDyynna a RRaattnnaassaarri i PPllaasshhiinnttaanniiaa N

NIIMM : : !!""##!!$$%%##$$ R&m'&nan

R&m'&nan : : II K

Keell&&mm**&&++ : : %%

,APORAN

,APORAN PRAKTIKUM PRAKTIKUM MIKROTEKNMIKROTEKNIKIK

KEMENTERIAN RISET- TEKNO,O.I- DAN PENDIDIKAN TIN..I KEMENTERIAN RISET- TEKNO,O.I- DAN PENDIDIKAN TIN..I

UNIERSITAS "ENDERA, SOEDIRMAN UNIERSITAS "ENDERA, SOEDIRMAN

FAKU,TAS IO,O.I FAKU,TAS IO,O.I PURWOKERTO PURWOKERTO %#!/ %#!/

I0 PENDAHU,UAN

!0! ,atar ela+an

Ginjal adalah organ yang mengatur komposisi kimia dari lingkungan dalam, melalui proses majemuk yang melibatkan filtrasi, absorbsi aktif, absorbsi pasif, dan sekresi. Selain itu ginjal juga mengatur tekanan darah dan volume darah dalam tubuh. Ginjal terletak pada dinding posterior abdomen terutama didaerah lumbal, disebelah kanan dan kiri tulang belakang dibungkus lapisan lemak, dibelakang  peritorium (Price & Wilson, !!"#.

Ginjal diperdarahi oleh arteri renalis yang dipercabangkan dari aorta abdominalis. $ena renalis bermuara ke vena kavea inferior. %ari setiap ginjal, suatu  pembuluh yang dinamakan ureter membaa kemih ke dalam kandung kemih. 'andungan kemih berfungsi sebagai tempat penyimpanan kemih yang dikosongkan secara berskala melalui uretra. 'emih dibentuk dari darah melalui proses filtrasi yang diikuti penyerapan kembali secara selektif (Green, ))! #

*da tiga tahap pembentukan urin yaitu + # Proses filtrasi merupakan proses yang terjadi dalam glomerulus, terjadi karena permukaan aferent lebih besar dari  permukaan eferent maka terjadi penyerapan darah, sedangkan sebagian tersaring adalah bagian cairan darah kecuali protein, cairan yang tersaring ditampung oleh simpauni baman yang terdiri dari glukosa, air, sodium, klorida, sulfat, bikarbonat diteruskan ke tubulus seminiferos. # Proses reabsorpsi + terjadi penyerapan kembali sebagian dari glukosa, sodium, kloroda dan fospat dan beberpa ion bikarbonat. Prose ini terjadi secara pasif yang dikenal obligator reapsorbsi terjadi pada tubulus atas. #  proses sekresi + sisanya penyerapan kembali yang terjadi pada tubulus dan diteruskan

ke piala ginjal selanjutnya diteruskan keluar (Syaifuddin, !!-#.

Glomerulus adalah suatu organ epiteliovaskuler yang dirancang untuk filtrasi ultra dari plasma. 'apiler glomerulus dilapisi oleh lapisan endotelium, berlubang  poripori dengan diameter karang lebih )) nm dan terletak pada membran basalis (Silvia et al , )#. Glomerulus pada setiap nefron menyaring darah dan membiarkan unsurunsur darah dengan berat molekul kurang dari /0.))) masuk kedalam  pembuluh, tetapi menahan setiap molekul dan partikel yang lebih besar dalam

Sebagian besar dari air yang disaring pada glomerulus (0)0"1# tidak harus diserap kembali dalam tubuh proksimal. 2erbagai jumlah dari sisanya diserap kembali dalam tubuh distal dan saluran pengumpul sesuai dengan keperluan air  dalam tubuh. Penyerapan kembali air dan dengan demikian mengurangi volume urin yang terbentuk. 'arena tindakanya ini maka hormon itu dinamakan hormon anti diurectik (*%3#. *%3 ialah suatu nonpeptida yaitu suatu polipeptida dengan ! asam amino, jika darah mulai menjadi terlalu cair (misalnya setelah banyak minum air# maka sekresi *%3 terhalang ('imball, !!)#.

!0% T121an

4ujuan dari praktikum ini adalah mengetahui cara pembuatan sediaan organ ginjal ayam dengan metode parafin dan untuk mengamati struktur mikroskopis organ ginjal ayam.

II0 MATERI DAN METODE

%0! Materi

*latalat yang digunakan diantaranya yaitu alat bedah, botol sampel, beaker   glass, oven inkubator dengan thermostat, hot plate, cetakan dari kertas karton, blok  kayu sebagai holder, mikrotom putar, kuas dan mangkuk air hangat, alumunium foil, object glass, cover glass, staining jar, mikroskop, kamera, pensil dan label.

2ahanbahan yang digunakan diantaranya yaitu organ ginjal ayam ( Gallus  gallus#, Neutral Buffered Formalin (526#, alkohol -)1, 0)1, !)1, ))1, akuades,

7ylol, gelatin 1, pearna haemato7ylin dan eosin 1 serta entelan ne.

A0 Met&3e

8etode yang dialakukan dalam praktikum ini adalah+ A0 Penam'ilan Sam*el

. *yam disembelih dengan menggunakan pisau.

. *yam dibedah menggunakan alat bedah yang telah disediakan.

. *ngkat organ ginjal kemudian dibersihkan dari darah dan difiksasi dengan larutan 526 di dalam botol sampel selama minimal 9 jam. $olume fiksatif minimal ) kali volume sampel jaringan.

0 Pemr&sesan Oran 1nt1+ Em'e33in  %ehidrasi.

Sampel direndam dalam larutan alkohol bertingkat mulai dari -)1, 0)1 !)1 dan akhohol absolut dua kali masingmasing selama 9" menit.

 Penjernihan : clearing .

Sampel direndam dalam campuran alkohol+7ylol (+#, alkohol+7ylol (+#, ;ylol < dan ;ylol << masingmasing selama 9" menit.

 <nfiltrasi.

%ilakukan di dalam oven inkubator pada temperatur "//))_{=. Sampel}

direndam dalam campuran 7ylol+parafin (+#, 7ylol+parafin (+#, 7ylol+parafin (+# masingmasing selama 9" menit. Parafin murni < dan  parafin murni << masingmasing selama /) menit.

9  Embedding.

%isiapkan cetakan dari kertas karton kurang berukuran 7 cm. Paraffin cair  dituangkan ke dalam cetakan sekitar 9:" tinggi cetakan. >aringan ditanam dalam paraffin dan posisinya diatur sesuai dengan orientasi pengirisan  jaringan yang diinginkan, kemudian holder dari blok kayu yang telah diberi

40 Penirisan sam*el

 8ikrotom disambungkan dengan  power supply,  switch tombol mikrotom ke  posisi on.

 Posisi hendle pemutar kromotom diubah ke posisi tak terkunci dan diputar  untuk memastikan baha mikrotom dalam keadaan baik dan operasional.  Posisi hendle pemutar kromotom dikembalikan ke posisi terkunci, ketebalan

irisan diatur deengan memutar tombol pengatur ukuran irisan.

9 Sudut kemiringan (elevasi# pemegang pisau diatur dan dilakukan uji coba dengan blok kosong.

" 'uas dan pinset disispkan untuk pemotongan dan pita paraffin dipindahkan ke air hangat untuk mengembangkan jaringan.

/ Sebelum diiris paraffin di sekeliling sampel dapat dikurangi melalui trimming .

-  older dipasang pada pemegang holder.

0 Posisi blok disesuaikan dengan pisau mikrotom dengan memajukan atau memundurkan pemegang sampel.

! 2lok diiris dengan kecepatan dan kekuatan putaran yang konstan.

) Pita berisi beberapa irisan sampel dipindahkan ke mangkuk berisi air hangat dengan kuas kecil dan pinset.

 <risan sampel ditempelkan pada gelas benda yang telah dilapisi gelatin atau 8ayeralbumin, ditiriskan dan ditata. Sampel yang telah kering disimpan. D0 Pe5arnaan

 >aringan yang akan diarnai disiapkan.  %eparafinasi.

>aringan dicelupkan ke dalam 7ylol < dan 7ylol << selama  menit.  ?ehidrasi.

>aringan dimasukkan ke dalam alkohol absolut <, absolut <<, alkohol !)1, 0)1, -)1 dan akuades masing masing ) celupan. >aringan dicelupkan ke dalam larutan haemato7ylin selama " menit, kemudian dicuci dengan air  kran selama  menit.

9 %irendam dalam eosin selama  menit " %ehidrasi.

>aringan dicelupkan ke dalam larutan alkohol -)1, !)1, alkohol absolut < dan alkohol absolut << masingmasing ) celupan.

/ !learing .

>aringan dijernihkan dalam larutan 7ylol  dan 7ylol << selama  menit. -  "ounting.

>aringan ditetesi dengan  tetes mounting agent (entelan new# dan ditutup dengan gelas penutup.

III0 HASI, DAN PEMAHASAN $0! Hasil

$0% Pem'ahasan

8etode parafin adalah suatu cara pembuatan sediaan histologi, baik hean atau tumbuhan dengan menggunakan parafin. 8etode ini sekarang banyak digunakan karena hampir semua macam jaringan dapat dipotong dengan baik dengan menggunakan metode ini. 8etode parafin adalah suatu metode pembuatan preparat dengan melakukan penanaman jaringan di dalam blok parafin untuk menghasilkan  preparat jaringan yang tipis (5urliani, ))-#. 'elebihan metode ini ialah irisan yang dihasilkan jauh lebih tipis dari pada menggunakan metode beku atau metode seloidin. 4ebal irisan ratarata dengan metode beku yaitu diatas ) mikron, akan tetapi dengan metode parafin tebal irisan dapat mencapai ratarata / mikron. Selain itu, irisanirisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan metode ini. 'elemahan dari metode ini ialah jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah. >aringanjaringan yang besar tidak dapat dikerjakaan, bila menggunakan metode ini. Sebagian besar en@im yang terdapat pada jaringan akan larut dengan menggunakan metode ini (Suntoro, !0#.

Arutan cara kerja pembuatan sediaan irisan dengan metode parafin secara umum yaitu fiksasi, pencucuian (washing #, dehidrasi, penjernihan (clearing #, infiltrasi parafin, penanaman (embedding #, pengirisan ( section#, penempelan (afi#ing #, deparafinisasi, pearnaan ( staining #, penutupan (mounting #, dan labelling .  Embedding   menggunakan parafin sangat baik digunakan untuk studi embriologi, anatomi dan sitologi. 8edium embedding  merupakan media yang memudahkan untuk merubah dari bentuk cair ke bentuk padat ('urniaati, )9#.

Prosedur pembuatan sediaan menggunakan metode parafin yang pertama adalah organ yang akan dijadikan preparat diisolasi terlebih dahulu, kemudian difiksasi dengan 526 selama 9 jam. 6iksasi berfungsi untuk mempertahankan  bentuk jaringan sedemikian rupa, sehingga perubahan bentuk atau struktur sel atau  jaringan yang mungkin terjadi hanya sedikit. Selain itu, fiksasi berguna untuk 

meningkatkan indeks bias jaringan sehingga jaringan dapat terarnai dengan baik. 4ahap selanjutnya adalah dehidrasi menggunakan alkohol dengan konsentrasi  bertingkat. Prinsip dari dehidrasi adalah karena jaringan hidup mengandung 0"1 air, sedangkan air tidak dapat bercampur dengan media parafin, sehingga dibutuhkan tahapan dehidrasi jaringan untuk menarik molekul air yang ada di dalam jaringan, dengan demikian, jaringan akan lebih teraetkan dan ruang antarsel dalam jaringan dapat diisi dengan media lain sesuai keperluan sediaan mikroskopis (Suntoro, !0#.

Proses yang dilakukan setingkat demi setingkat, karena untuk menjaga tidak terjadi  perubahan yang tibatiba terhadap sel jaringan, hingga perubahan struktur selsel yang sekecil mungkin (Schichnes et al., ))"#. Presentase alkohol yang digunakan dalam praktikum adalah alkohol -)1, alkohol 0)1, alkohol !/1, alkohol absolut ())1# <, dan alkohol absolut <<.

Brgan selanjutnya di clearing  dengan larutan campuran 7ylol dan alkohol dengan perbandingan tertentu yaitu +, +, + dan 7ylol murni. 4ujuannya adalah untuk membersihkan sisasisa alkohol dari organ dan membantu proses penyerapan  parafin. 4ahapan berikutnya yaitu infiltrasi atau perendaman dalam parafin,

dilakukan di dalam inkubator agar saat organ dimasukkan dalam parafin, maka  parafin tersebut tidak mudah membeku. 4ahapan perendaman dalam parafin diulangi sebanyak  kali dengan tujuan agar parafin meresap sempurna dan pada saat  pemotongan akan didapat hasil yang baik. Selain itu tahapan perendaman dalam  parafin yang sempurna juga turut mempengaruhi struktur organ yang digunakan.4ahapan selanjutnya adalah penanaman atau embedding  organ ke dalam  blok parafin. Penanaman dilakukan pada hari yang sama setelah dilakukan tahap infiltrasi. Brgan yang sudah berada dalam blok parafin akan dipotong dengan menggunakan mikrotom dengan ketebalan hasil " mikron. 4ahapan pemotongan memerlukan kesabaran dan ketelitian. *da beberapa jenis mikrotom yang dapat digunakan sebagai alat pemotong sediaan antara lain hand microtom, rocking  microtom, rotary microtom, free$ing microtom, dan sliding microtom. 2eberapa kesukaran pada saat pemotongan sediaan parafin antara lain pita tidak terbentuk  sempurna. 3al ini kemungkinan karena pisau yang tumpul. Pita melengkung atau  bengkok, hal ini kemungkinan karena tepi pisaunya yang tidak rata. Sayatan tertekan,

mengkerut, atau berdempet, hal ini kemungkinan karena sudut pisau yang terlalu kecil dan mata pisau yang terlapis dengan sisa parafin. Sayatan remuk dan cenderung lepas dari parafin, hal ini kemungkinan karena proses dehidrasi  dan clearing yang tidak sempurna (>unCuera et al., !!0#.

Pita hasil pemotongan kemudian dilekatkan pada object glass, kemudian dilakukan tahap deparafinisasi dengan 7ylol. 6ungsinya adalah untuk menghilangkan  parafin pada jaringan. 4ahapan selanjutnya adalah pearnaan dengan pearna

3emato7ilinDosin. Pearnaan dilakukan untuk memudahkan pengamatan dan menemukan bagianbagian dari organ yang ingin diamati atau dikaji (Schichnes et  al., ))"#. 4ahapan berikutnya adalah pencucian dengan akuades agar sisasisa

arna yang menempel tidak sempurna bisa hilang. 'emudian perendaman dalam alkohol bertingkat. 3al ini bertujuan untuk mengurangi kemungkinan lunturnya arna, untuk menghilangkan kandungan air yang mungkin saja masih tersisa setelah  proses pencucian dan mencegah hal lainnya yang tidak diinginkan ('hasim, ))#.

Earutan yang dipakai dalam praktikum metode parafin yaitu 526, sebagai larutan fiksatif. Brgan ginjal ayam difiksasi dalam larutan 526 selama 9 jam, kemudian dilanjutkan dengan tahap dehidrasi dengan menggunakan larutan alkohol  bertingkat mulai dari -)1, 0)1, !/1 dan 7))1 masingmasing selama 9" menit, dilanjutkan dengan tahap clearing  dengan menggunakan larutan campuran alkohol+7ylol (+#, alkohol+7ylol (+#, alkohol+7ylol (+#, dua kali 7ylol murni masingmasing selama ) menit. Setelah tahap clearing  yaitu tahap infiltrasi dengan larutan campuran 7ylol+paraffin (+#, 7ylol+paraffin (+#, 7ylol+paraffin (+# masing selama ) menit, kemudian dua kali dalam paraffin murni masingmasing selama  jam (%ellman dan 2ron, !!#.

8enurut 8untiha ())#, jaringan direndam dalam larutan 526 )1, yang  berfungsi sebagai bahan pengaet agar terhindar dari pencernaan jaringan oleh en@imen@im (otolisis# atau bakteri dan untuk melindungi struktur fisik sel. 2ahan  pengaet yang rutin digunakan adalah larutan  Neutral Buffered Formalin  (526# )1 dengan p3 berkisar antara /," F -,". p3 ideal adalah -,). *gar fiksasi jaringan dengan larutan tersebut berlangsung sempurna, maka perbandingan antara organ dan larutan yaitu +), sedangkan lamanya fiksasi minimal 9 jam.

4ahap pearnaan jaringan hean dalam praktikum menggunakan pearna haemato7ylineosin yang diaali dengan tahap deparafinisasi menggunakan larutan 7ylol dua kali masingmasing selama  menit. Earutan yang digunakan dalam rehidrasi yaitu alkohol 7))1, !/1, 0)1, -)1, akuades masingmasing ) celupan selama ) detik, kemudian direndam dengan larutan haemato7ylin " menit. Earutan untuk dehidrasi menggunakan alkohol bertingkat mulai dari -)1, !)1 dan 7))1 masingmasing selama ) celupan ) detik, kemudian tahap clearing  menggunakan larutan 7ylol dua kali masingmasing selama  menit. 4eknik   pearnaan terbaru yang digunakan untuk mengevaluasi jaringan secara histologis

yaitu 8assons trichrome dan hemato7ylin eosin protokol. 4eknik tersebut lebih efektif dalam mengidentifikasi sel dan struktur jaringan daripada teknik yang telah  berkembang sebelumnya (2et@ et al., )#.

8enurut 'urniaati ()9#, pemrosesan dan pearnaan jaringan diaali dengan fiksasi kemudian diikuti dengan proses dehidrasi dengan alkohol bertingkat sebelum dilakukan embedding dalam parafin. >aringan dipotong sebesar " Hm selanjutnya diproses dengan pearnaan umum haemato7ylin eosin (3D#. Pearnaan umum 3D dilakukan untuk mengetahui morfologi umum jaringan ginjal. 3asil  penelitiannya menunjukan baha morfologi umum pada jaringan ginjal tikus kelompok kontrol negatif yang diarnai dengan 3D menunjukkan inti sel tubuli renalis mengambil arna basofilik, sedangkan bagian sitoplasmanya mengambil arna asidofilik.

2erdasarkan hasil praktikum, preparat histologi ginjal ayam tampak jelas, namun yang terlihat hanya bagian sel asinus yang berfungsi untuk menghasilkan en@im pencernaan. <risan blok parafin menghasilkan pita irisan yang kurang baik, sehingga jaringan pada irisan sedikit mengkerut. *pabila terlalu lama direndam dalam agen penjernih maka akan mudah mengkerut. Pearnaan hemotoksilin yang telah dilakukan diperoleh hasil yaitu organ ginjal terarnai dengan baik. Sayatan organ dalam hematoksilin dan eosin, sitoplasma sel mendapat arna merah namun inti selnya kurang terlihat. Sitoplasma mengandung matriks protein yang berlebihan, dan pada P3 yang biasanya digunakan untuk mearnai jaringan, banyak dari protein ini yang cukup mempunyai kelompok basa (yang bermuatan positif# untuk   bergabung dengan eosin, suatu @at arna asam yang arnanya disebabkan oleh

anionanion bermuatan negatif. 2ahan pearna hemato7ylin sendiri bukan arna yang basa, tetapi dapat dibuat melekat pada tempattempat yang bermuatan negatif.  5ukleus (inti sel# mengandung asamasam nukleat dengan kelompok asam fosfat yang dapat bergabung dengan hemato7yilin dengan bantuan suatu mordan (3offbrand, !!/#.

Pembuatan preparat dengan metode paafin dapat diterapkan pada organ atau  jaringan hean yang akan diteliti atau diamati. =ontoh jaringan yang dapat digunakan dalam pembuatan preparat dengan metode parafin adalah pankreas, hepar, jantung, intestin, ataupun ginjal. Pembuatan preparat dapat dimanfaatkan untuk mendukung kajian bidang embriologi maupun untuk diagnosis suatu penyakit ('urniaan, ))#.

I0 KESIMPU,AN DAN SARAN

60! Kesim*1lan

2erdasarkan hasil dan pembahasan dapat disimpulkan baha+

. Prosedur kerja pembuatan preparat organ ginjal ayam dengan metode parafin yaitu fiksasi, pencucuian (washing #, dehidrasi, penjernihan (clearing #, infiltrasi  parafin, penanaman (embedding #, pengirisan ( sectioning #, penempelan (afi#ing #,

deparafinisasi, pearnaan ( staining #, penutupan (mounting #, dan labelling.

. Preparat organ ginjal ayam yang dihasilkan dengan metode parafin dan  pearnaan hematoksilineosin menjadikan struktur organ ginjal ayam terarnai

merah dan yang terlihat adalah bagian sel asinus.

60% Saran

Sebaiknya dalam melaksanakan praktikum, alatalatnya ditambah supaya lebih efektif dalam pelaksanaannya.

DAFTAR REFERENSI

2et@, %. 3., Dpperson, ?. 4. 2rian, 8. 3., and ?oy %. 2. ). * ne trichrome techniCue for P88* embedded percutaneous implants for the study and characteri@ation of epithelial integration. %ournal of istotechnology. " (9# + /9-).

%ellman 3. % and 2ron D. !!.  Buku &eks istologi 'eteriner (( dan ((( . Penerbit Aniversitas <ndonesia. >akarta.

Ganong W.6. !!". Buku )jar Fisiologi *edokteran (?evie of 8edical Physiology. Ddisi 9. *lih 2ahasa + *drianto P. DG=. >akarta.

Green, >. 3. ))!. +engantar Fisiologi &ubuh "anusia. %i terjemahkan oleh %r. 3. 8. %jauhari Widjadjakusuma. Penerbit 2inarupa *ksara+ 4angerang.

3offbrand, *.$. !!/.  Essential aemotology. 2lackell Scientific Publications. Penerbit 2uku 'edokteran DG=, >akarta.

>unCuera E.=, =arneiro >, dan ?obert B.'. !!0.  istologi asar. Dd ke0. Penerbit 2uku 'edokteran 3ean. >akarta.

'hasim, S.8. )). *nimal  "icrotechni-ue +rinciples and +ractice. =apital Publishing =ompany, 5e %elhi.

'imball. !!). Biologi. Drlangga+ >akarta

'urniaan, W. )).  +embuatan /ediaan (risan %aringan ewan engan "etode  +arafin. Aniversitas Eambung 8angkurat, 2anjarbaru.

'urniaati, 8., =hanif 8., and *ulanniam *. )9. 4he Dffect of >uice 8angosteen ?ind (Garcinia "angostana 0.# to 2lood Sugar Eevels and 3istological of Pancreatic ?ats With 4he <nduction of Strepto@otocin.  %. +ure  )pp. !hem. 1es.,  (# pp.

_‐

/

8untiha, 8. )). 4eknik Pembuatan Preparat 3istopatologi dari >aringan 3ean dengan Pearnaan 3ematoksilin dan Dosin (3&D#. &emu &eknis  Fungsional Non +eneliti, 2ogor.

 5urliani, *. ))-.  +etunjuk +raktikum &eknik 0aboratorium. %epartemen Pendidikan 5asional Aniversitas Eambung 8angkurat.

?oss, 8.3., E.> ?omell and G.< 'aye. !!".  istology.  * 4e7t and *tlas 4hird Ddition. Williams and Wilkins. * Waerly =ompany, AS*.

Price, S. * and E. 8 Wilson, !!". +atofisiologi konsep klinis edisi 2. *lih bahasa  peter anugerah. >akarta+ DG

Schichnes %., >.*. 5emson, and S.D. ?u@in. ))". 8icroave Protocol 4echniCues for Plant and *nimal Paraffin 8icrotechniCues. &he 3niversity of !alifornia at Berkeley, !N1 Biological (maging Facility. ")".

Suntoro, S.3. !0. "etode +ewarnaan. 2hatara 'arya *ksara, >akarta.

Weather, P.?., 3.G. 2urkitt, and $.G %aniels. !-!. 6unctional 3istology. Eong Group Eimited, Eondon.