BAB II
TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Uraian Kloramfenikol
Saat ini telah diketahui macam-macam antibiotik serta pemakaiannya dalam bidang kedokteran, peternakan, pertanian, dan beberapa bidang yang lain. Walaupun demikian, tidak semua antibiotik dikenal masyarakat umum. Hanya antibiotik-antibiotik yang penting dan banyak digunakan yang dikenal oleh masyarakat (Sumardjo, 2009).
Kloramfenikol merupakan suatu antibiotik berspektrum luas yang berasal dari beberapa jenis streptomyces misalnya S. Venezuelae, S. phaeochromogenes var. chloromycetius dan S. omiyanensis. Setelah para ahli berhasil mengelusidasi strukturnya, maka sejak tahun 1950 kloramfenikol sudah dapat di sintesis secaratotal. S. Venezuelae petama kali diisolasi oleh Burkholder pada tahun 1947 dari contoh tanah yang diambil di Venezuela. Filtrat kultur cair organisme menunjukkan aktivitas terhadap bakteri gram negatif dan rikestia. Bentuk kristal antibiotik ini diisolasi oleh Bartz pada tahun 1948 dan dinamakan kloromisetin karena adanya ion klorida dan didapat dari suatu aktinomisetes (Wattimena dkk, 1991).
Chloramphenicol; D-threo-(-)-2,2-dichloro-N- 𝛽𝛽-hydroxy-𝛼𝛼-(hydroxy-methyl)-p-nitrophenethyl acetamide.
Berat molekul: 323,13 Rumus bangun:
Jarak lebur 149 sampai 153℃
Kelarutan: 1 g larut dalam kira-kira 400 ml air; sangat mudah larut alkohol, aseton, butanol, propilen glikol, dan etil asetat; sukar larut dalam eter dan kloroform; tidak larut dalam benzoat dan petroleum eter (Connors, 1986).
Senyawa ini termasuk antibiotika yang paling stabil. Larut dalam air pada pH 6 menunjukkan kecenderungan terurai yang paling rendah. Dalam basa akan terjadi penyabunan ikatan amida dengan cepat (Schunack dkk, 1990).
Bentuk-bentuk yang ada yaitu Kloramfenikol; kloramfenikol palmitat (C27H24Cl2N2O6); kloramfenikol natrium suksinat (C15H15C12N2NaO8) (Connors,
1986).
Menurut Dirjen POM (1995), kloramfenikol memiliki sifat fisikokimiayaitu:
Rumus Molekul: C11H12Cl2N2O5
Nama Umum : Kloramfenikol
hingga putih kelabu atau putih kekuningan; larutan praktis netral terhadap lakmus P; stabil dalam larutan netral atau larutan agak asam.
Kelarutan : Sukar larut dalam air, mudah larut dalam etanol, dalam propilen glikol, dalam aseton dan dalam etil asetat.
Persyaratan : Pada sediaan kapsul kloramfenikol mengandung kloramfenikol, C11H12Cl2N2O5, tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih
dari120,0% dari jumlah yang tertera pada etiket.
Kloramfenikol adalah salah satu antibiotik yang secara kimiawi diketahui paling stabil dalam segala pemakaian. Dia memiliki stabilitas yang sangat baik pada suhu kamar dan kisaran pH 2 sampai 7, stabilitas maksimumnya dicapaipada pH 6. Pada suhu 25℃ dan pH 6, memiliki waktu paruh hampir 3 tahun. Yang menjadi penyebab utama terjadinya degradasi kloramfenikol dalam media air adalah pemecahan hidrolitik pada pemecahan amida. Laju reaksinya berlangsung dibawah orde pertama dan tidak tergantung pada kekuatan ionik media (Connors, 1986).
2.1.1 Mekanisme KerjaKloramfenikol
Kloramfenikol bekerja dengan menghambat sintesis protein kuman. Obat ini terikat pada ribosom subunit 50s dan menghambat enzim peptidil tansferase sehingga ikatan peptida tidak terbentuk pada proses sintesis protein kuman (Setiabudy, 2007).
Kloramfenikol terikat pada ribosom sub unit 50s dan menghambat enzim peptidil transferase. Ini merintangi pembentukan ikatan peptida antara asam amino-tRNA pada sisi aminoasil. Selain itu juga dirintangi rantai peptida yang sedang memanjang pada sisi peptidil pada ribosom sehingga translasi terhenti (Nogrady, 1992).
Kloramfenikol diabsorpsi cepat dan hampir sempurna dari saluran cerna, karena obat ini mengalami penetrasi membran sel secara cepat. Setelah absorpsi, kloramfenikol didistribusikan secara luas ke seluruh jaringan dan cairan tubuh. Metabolit utama kloramfenikol adalah glukuronida–nya yang bekerja antibiotik, yang dibuat di hati dan diekskresikan melalui ginjal (Katzung, 2004).
2.1.2 Penggunaan Kloramfenikol
Berhubung risiko anemia aplastis fatal, kloramfenikol di negara Barat sejak tahun 1970-an jarang digunakan lagi per oral untuk terapi manusia. Dewasa ini hanya dianjurkan pada beberapa jenis infeksi bila tidak ada kemungkinan lain, yaitu pada infeksi tifus (salmonella typhi) dan meningitis (khusus akibat H. influenzae), juga obat, khususnya abses otak oleh B.fragilis. Untuk infeksi tersebut sebetulnya juga tersedia antibiotika yang lain yang lebih aman dengan efektivitas sama (Tjay, 2007).
Kloramfenikol sangat berguna dalam menangani meningitis pada anak yang alergi pada penisilin, menderita abses otak atau infeksi anaerobik lainnya, dan juga pada infeksi intraokular akibat organisme yang sensitif. Kecuali itu juga
bersifat bakteriostatik terhadap banyak baksil gram negatif lainnya (Skach dkk, 1988).
2.1.3 Efek Samping
Efek samping umum berupa gangguan lambung-usus, neuropati optis dan perifer, radang lidah dan mukosa mulut. Tetapi yang sangat berbahaya adalah depresi sumsum tulang (myelodepresi) yang dapat berwujud dalam dua bentuk anemia, yakni sebagai:
a. Penghambatan pembentukan sel-sel darah (eritrosit, trombosit, dan granulosit) dalam waktu 5 hari sesudah dimulainya terapi. Gangguan ini tergantung lamanya terapi dan bersifat reversibel.
b. Anemia aplastis, yang timbul sesudah beberapa minggu sampai beberapa bulan pada penggunaan oral, parenteral dan okuler, maka tetes mata tidak boleh digunakan lebih dari 10 hari (Tjay, 2007).
Supresi sumsum tulang merupakan efekyang ada kaitannya dengan dosis dan dapat dipulihkan kembali, terlihat dari tanda-tanda pansitopenia dengan pemulihan kembali 1-2 minggu setelah obat dihentikan. Ada kaitannya dengan kadar diatas 20-25 𝜇𝜇𝜇𝜇/ml (Skach dkk, 1988).
2.2 Metode Penetapan Kadar Kloramfenikol
Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli botani rusia Michael Tswett pada tahun 1903 untuk memisahkan pigmen berwarna dalam
tanaman dengan cara perkolasi ekstrak petroleum eter dalam kolom gelas yang berisi kalsium karbonat (CaCo3). Saat ini kromatografi merupakan teknik
pemisahan yang paling umum dan paling sering digunakan dalam bidang kimia analisis dan dapat dimanfaatkan untuk melakukan analisis, baik analisis kualitatif, kuantitatif, atau preparatif dalam bidang farmasi, lingkungan industri dan sebagainya. Kromatografi merupakan teknik pemisahan yang menggunakan fase diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile phase) (Rohman, 2007).
2.2.1 Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi cair tingkat tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal awal tahun 1970-an. Saat ini, KCKT merupakan teknik pemisahan yang terima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel dalam sejumlah bidang, antara lain: farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri-industri makanan. Beberapa perkembangan KCKT terbaru antara lain: miniaturisasi sistem KCKT, penggunaan KCKT untuk analisis asam-asam nukleat, analisis protein,analisis karbohidrat, dan analisis senyawa-senyawa kiral (Rohman, 2007).
HPLC adalah salah satu teknik analisis yang penting yang mempunyai tingkatan otomatisasi pada tahun-tahun terakhir ini. Ini menunjukkan HPLC telah mengalami perkembangan dan merupakan alat yang sangat baik. Yang terbaru
dilengkapi dengan mikrokomputer dan mikroprosesor yang dapat memberikan perhitungan data sekaligus (Lachman dkk, 1994).
Metodespektrofotometri tidak dapat membedakan antara kloramfenikol dan produk degradasinya 1-(4’-nitrofenil)-3-amino-1,3-propandiol. Metode KCKT telah dikembangkan untuk menetapkan kadar kloramfenikol dan produk degradasinya (Sudjadi dan Rohman, 2008).
Kolom yang digunakan adalah fase terbalik (C18, 25 cm x 0,46 cm i.d.,
dengan ukuran partikel 10 mikron) dan dioprasikan pada suhu ruangan. Dektektor yang digunakan adalah spektrofotometer UV pada panjang gelombang 254 nm dan diatur pada AUFS 0,05. Fase gerak yang digunakan adalah campuran bufer kalium monobasik fosfat 0,01M-metanol dengan perbandingan 58:42 v/v dihantarkan secara isokratik dengan kecepatan alir fase gerak 1,5 ml/menit. Semua bahan diinjeksikan dengan volume 5 𝜇𝜇𝜇𝜇 (Sudjadi dan Rohman, 2008).
Larutan baku timbang seksama lebih kurang 25 mg kloramfenikol BPFI, masukkan kedalam labu tentukur 200-ml, tambahkan 10 ml air dan panaskan diatas tangas uap hingga larut sempurna. Dinginkan hingga suhu kamar, encerkan dengan fase gerak sampai tanda. Saring melalui penyaring dengan porositas 0,5 𝜇𝜇𝜇𝜇 atau lebih halus, dan gunakan filtrat yang jernih sebagai larutan baku (Dirjen POM RI, 1995).
Penyiapan sampel untuk kapsul, sejumlah tertentu kapsul yang setara dengan 25 mg kloramfenikol ditimbang secara seksama lalu ditambah dengan
10,0 ml larutan standar internal A dan volume dibuat 25,0 dengan metanol (sudjadi dan Rohman, 2008).
2.2.2 Instrumentasi KCKT
Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas delapan komponen pokok yaitu: wadah fase gerak, sistem penghantar fase gerak, alat untuk memasukkan sampel, kolom, detektor, wadah, penampung buangan fase gerak, tabung penghubung dan suatu komputer atau integrator atau perekam (Rohman, 2007).
Sistem instrumen standar untuk elusi isokratik terdiri atas: (i) Reservoir pelarut.
(ii) Sebuah pompa yang mampu memompa pelarut dengan tekanan sampai 4000 psi dan aliran hingga 10 ml/menit.
(iii) Suatu injektor lengkung yang, pas dengan lengkung bervolume tetap antara 1 dan 200 𝜇𝜇𝜇𝜇 (20 𝜇𝜇𝜇𝜇 sering digunakan sebagai baku).
(iv) Suatu kolom, yang biasanya berupa tabung baja dikemas, biasanya dengan gel silika tersalut oktadesilsilan (salut-ODS) dengan diameter partikel rata-rata (3,5 atau 10 𝜇𝜇m).
(v) Suatu detektor, yang biasanya berupa detektor UV/visible meskipun untuk penerapan khusus tersedia berbagai macam detektor.
(vi) Sistem penangkap data, yang dapat berupa suatu integrator komputisi atau sebuah komputer dengan piranti lunak yang sesuai memproses data kromatografi.
(vii) Kolom dihubungkan pada injektor dengan tabung berdiameter dalam yang sempit lebih kurang 0,2 mm, untuk meminimalkan ‘volume mati’, yaitu ruang kosong didalam sistem ketika kromatografi tidak terjadi dan pelebaran pita dapat terjadi melalui difusi longitudinal. (viii) Instrumen-instrumen memiliki injeksi sampel yang lebih canggih
memiliki injeksi sampel otomatis dan oven kolom serta mampu mencampur dua pelarut atau lebih dalam berbagai perbandingan terhadap waktu untuk menghasilkan gradien fase gerak (Watson, 2009).
a. Wadah Fase Gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembap (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum di gunakan harus dilakukan degassing (penghilang gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul pada komponen lain terutama di pompa dan didetektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat membuat pelarut pada fase gerak, maka sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut,bufer, dan reagen dengan kemunian yang sangat tinggi, dan lebih terpilih lagi jika pelarut-pelarut yang digunakan untuk KCKT berderajat KCKT (HPLC grade). Adanya pengotor dalam reagen dapat menyebabkan gangguan pada sistem
kromatografi. Adanya partikel yang kecil dapat terkumpul dalam kolom atau dalam tabung yang sempit, sehingga dapat mengakibatkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung tersebut. Karenanya, fase gerak sebelumdigunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini (Rohman, 2007).
b. Fase Gerak
Fase gerak pada eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut (Rohman, 2007).
c. Fase Diam
Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak di modifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzene. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya gugus silanol (Si-OH) (Rohman, 2007).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsianol yang lain (Rohman, 2007).
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak
digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi yang disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan (Rohman, 2007).
d. Detektor
Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks biasdan detektor spektrofotometri massa dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif seperti detektor UV-Vis, deteksi fluoresensi, dan elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut: • Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel
• Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada
• Stabil dalam pengoperasiaannya
• Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan
pelebaran pita. Untuk kolom konvensional, selnya bervolume 8 𝜇𝜇𝜇𝜇 atau lebih kecil, sementara kolom mikrobor selnya bervolume 1 𝜇𝜇𝜇𝜇 atau lebih kecil lagi
• Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan dengan konsentrasi solut
pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier)
• Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase
gerak(Rohman, 2007).
Detektor KCKT yang paling peka didasarkan pada fluoresensi, tetapi sudah tentu dapat dipakai untuk senyawa yang berfluoresensi. Untuk mencapai kepekaan itu, yakni agar senyawa yang jumlahnya kecil dapat dideteksi atau agar dapat diperoleh data kuantitatif yang sahih, kadang-kadang linurat diubah menjadi turunan senyawa yang berfluoresensi sebelum dikromatografi (Gritter, 1991). e. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut, yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa gelas, baja tahan
karat, teflom, dan batu nilam. Pompa yang yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan 5000psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3ml/menit. Tujuan penggunaan pompa adalah untuk untuk menjamin proses penghataran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan (Rohman, 2009).
f. Injektor
Cuplikan harus dimasukkan ke dalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan agar sedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Ada tiga jenis dasa injektor, yaitu: a. Aliran henti; b. Septum; c. Katup jalan kitar (Johnson E. dan Stevenson, R, 1991).
2.2.3 Profil Kromatogram KCKT
Idealnya profil kromatogram KCKT merupakan suatu garis tegak lurus bagi masing-masing linarut. Akan tetapi keadaan demikian tidak akan dijumpai pada pelaksana analisis dengan KCKT (Satiadarma, 1995).
Kromatogram KCKT merupakan relasi antara tanggapan detektor sebagai ordinat dan waktu sebagai absis pada sistem koordinat Cartesian, dimana titik nol dinyatakan sebagai saat dimulainya injeksi sampel. Sampel yang diinjeksikan menuju kolom analisis tidak langsung secara serempak molekul-molekulnya berkumpul di satu titik (Satiadarma, 1995).
2.2.4 Cara kerja Kromatografi Cair Tingkat Tinggi (KCKT)
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati
suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi salut dalam fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair secara suksesterhadap suatu massa-lah yang dihadapi membutuhkan penggunakan secata tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel. Untuk tujuan memilih kombinasi kondisi kromatografi yang terbaik, maka dibutuhkan pemahaman yang mendasar tentang berbagai macam faktor yang mempengaruhi pemisahan pada kromatografi cair (Rohman, 2007).
HPLC dengan prinsip kromatografi adsorpsi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida. Zat-zat dengan kepolaan berbeda, yaitu industri farmasi dan pestisida. Zat-zat dengan kepolaran berbeda, yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahakan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair (Khopkar, 2007).
2.2.5 Keuntungan dan Keterbatasan KCKT
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) mempunyai beberapa keuntungan bila dibandingkan dengan sistem pemisahan lain, diantaranya:
a. Cepat
b. Daya pisahnya baik c. Peka dan detektor unik
e. Ideal untuk molekul besar dan ion.
f. Mudah memperoleh kembali (Johnson dan Stevenson, 1991).
KCKT paling sering digunakan untuk: menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis, menetukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintetis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi; monitor sampel-sampel yang berasal dari lingkungan; memurnikan senyawa dalam suatu campuran; memisahkan polimer dan menentukan distribusi berat molekulnya dalam suatu campuan; kontrol kualitas; dan mengikuti jalannya reaksi sintesis (Rohman, 2007).
Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali KCKT dihubungkan dengan senyawa Spektropfotometer Massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh (Rohman, 2007).
