ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTAT DARI PRODUK PANGAN HASIL FERMENTASI (SAYUR ASIN DAN YOGURT)
I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang
Bakteri asam laktat merupakan jenis mikrobia yang berperan dalam fermentasi makanan. Bakteri ini memiliki kemampuan untuk mengubah karbohidrat atau gula yang terdapat dalam makanan menjadi asam laktat yang ditunjukkan oleh penurunan pH, perubahan rasa, aroma, tekstur, dan warna. Asam laktat yang dihasilkan dapat menghambat pertumbuhan mikrobia patogen dan penyebab kerusakan makanan yang tidak tahan asam. Selain menghasilkan asam laktat, bakteri ini juga menghasilkan CO2, asetat, atau etanol. Spesies bakteri asam laktat yang umum ditemukan pada fermentasi makanan antara lain: Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides, Streptococcus thermophilus, dan Lactobacillus bulgaricus. Isolasi bakteri asam laktat pada praktikum ini dilakukan melalui inokulasi bakteri dari sampel makanan hasil fermentasi, yaitu sayur asin dan yogurt, ke dalam medium MRS-CaCO3. Karakterisasi bakteri dilakukan melalui pengamatan sel, bentuk, warna, tepi, dan elevasi koloni bakteri, pengujian katalase, dan pengecatan.
B. Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk mengisolasi dan karakterisasi bakteri asam laktat dari sampel makanan hasil fermentasi (sayur asin dan yogurt).
II. METODE A. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan antara lain: sampel sayur asin, yogurt, medium MRS-CaCO3, NaCl 0,85%, sodium azida, cat Gram, cat methylene blue, H2O2 3%.
B. Alat
C. Cara Kerja
a. Isolasi bakteri asam laktat
Sampel sayur asin dan yogurt masing-masing sebanyak 10 gram dimasukkan ke dalam NaCl 0,85% kemudian diencerkan dari pengenceran 10-1 sampai 10-6. Selanjutnya, 1 ml hasil pengenceran 10-4, 10-5, dan 10-6 masing-masing diinokulasi secara pour plate ke dalam medium MRS-CaCO3 yang telah ditambah sodium azida 1 ppm. Medium diinkubasi pada suhu 370 C selama 72 jam.
b. Pengamatan morfologi koloni
Zona jernih di sekitar koloni bakteri diamati. Selain itu, morfologi koloni bakteri yang meliputi bentuk, warna, tepi, dan elevasi koloni pada medium diamati dan dicatat.
c. Pengecatan bakteri
Gelas benda dibersihkan dengan alkohol 70% dan dipanggang di atas lampu Bunsen. Selanjutnya, 1 ose koloni bakteri dari sampel diambil dan diratakan di atas gelas benda. Gelas benda difiksasi kemudian cat Gram A diteteskan pada gelas benda dan didiamkan selama 1 menit. Gelas benda dicuci dengan akuades kemudian cat Gram B diteteskan dan didiamkan selama 1 menit. Gelas benda dicuci dengan cat Gram C, didiamkan selama 30 detik, dan dicuci kembali dengan akuades. Cat Gram D diteteskan pada gelas benda dan didiamkan selama 2 menit, kemudian dicuci dengan akuades. Bakteri hasil pengecatan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10x10 dan 40x10.
d. Pengecatan sel
Gelas benda dibersihkan dengan alkohol 70% dan akuades diteteskan di atas gelas benda. Selanjutnya, 1 ose koloni bakteri dari sampel diletakkan di atas gelas benda dan larutan
methylene blue diteteskan 2 tetes di bagian tengah permukaan gelas benda. Suspensi dicampur kemudian ditunggu selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibersihkan dengan akuades dan dilewatkan di atas lampu Bunsen. Bakteri hasil pengecatan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10x10 dan 40x10.
e. Uji katalase
III. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil
Tabel 2. Karakterisasi bakteri pada sampel sayur asin dan yogurt
Koloni bakteri pada sampel dapat menghidrolisis CaCO3 dan ditunjukkan dengan terbentuknya zona jernih (hasil positif) (Tabel 1). Koloni bakteri pada sampel sayur asin berbentuk irregular, curled, dan circular; elevasi berbentuk convex, effuse, dan low convex; tepi berbentuk undulate dan entire; dan warna koloni krem. Koloni bakteri pada sampel yogurt berbentuk circular; elevasi berbentuk low convex dan convex; tepi berbentuk lobate dan undulate; warna koloni putih dan putih kekuningan (Tabel 2). Bakteri pada sampel sayur asin adalah bakteri Gram negatif kecuali pada pengenceran 10-6 menunjukkan bakteri Gram positif. Bakteri pada sampel yogurt adalah bakteri Gram negatif (Tabel 3). Koloni bakteri pada sampel sayur asin dan yogurt dapat mengkatalisis H2O2 dan ditunjukkan dengan terbentuknya gelembung (hasil positif), kecuali pada sampel sayur asin pengenceran 10-4 tidak terbentuk gelembung (hasil negatif) (Tabel 4).
Sayur asin dan yogurt merupakan jenis makanan hasil fermentasi bakteri asam laktat. Isolasi bakteri asam laktat dari makanan tersebut dilakukan melalui inokulasi bakteri asam laktat ke dalam medium MRS-CaCO3 yang telah ditambah sodium azida. Selanjutnya, medium tersebut diinkubasi dan hasil positif berupa adanya zona jernih di sekitar koloni bakteri diamati. Karakterisasi bakteri asam laktat dilakukan melalui pengamatan bentuk, warna, tepi, dan elevasi koloni pada medium; pengamatan morfologi bakteri melalui pengecatan Gram dan methylene blue; dan pengujian katalase.
Bakteri asam laktat dapat diisolasi melalui: pengayaan (enrichment) sampel di broth
culture kemudian diinokulasi ke medium agar; inokulasi sampel secara langsung ke medium
agar; dan filtrasi membran sampel kemudian membran diinkubasi ke medium agar. Metode yang umum digunakan adalah inokulasi sampel secara langsung ke medium agar karena pertumbuhan koloni bakteri dapat dienumerasi, dibedakan berdasarkan kenampakan, dan diisolasi untuk identifikasi. Medium yang biasa digunakan antara lain: agar de Man Rogosa Sharpe (MRS), agar jus tomat, agar Irrman, agar ekstrak yeast, dan agar MRS yang dimodifikasi melalui penambahan larutan tertentu (Soni, 2007). Metode isolasi bakteri asam laktat yang digunakan pada praktikum ini adalah inokulasi sampel secara langsung ke medium MRS yang mengandung CaCO3 dan telah ditambah sodium azida.
Medium MRS mengandung laktosa, pepton, ekstrak daging, ekstrak yeast, Na-asetat, ammonium sitrat, MgSO4, MnSO4, KH2PO4, dan Tween-80 (Li et al., 2015). CaCO3 yang terdapat dalam medium berperan sebagai indikator adanya bakteri asam laktat yang ditunjukkan oleh zona jernih di sekitar koloni karena solubilisasi CaCO3 menjadi H2CO3 oleh bakteri asam laktat (Soni, 2007). Sodium azida yang ditambahkan pada medium berperan sebagai larutan penghambat pertumbuhan bakteri Gram negatif atau bakteri bukan asam laktat sehingga koloni yang akan tumbuh hanya koloni bakteri asam laktat (Corry et al., 2012).
homofermentatif hanya menghasilkan asam laktat melalui jalur EMP ( Embden-Meyerhoff-Parnas) (Lahtinen et al., 2012). Suhu yang dibutuhkan dalam fermentasi sayur adalah 160 – 350 C, dengan suhu optimal 150 – 200 C (Hui et al., 2004).
Strain bakteri asam laktat yang umum berperan dalam fermentasi sayur adalah
Leuconostoc mesenteroides yang bersifat heterofermentatif dan Lactobacillus plantarum
yang bersifat homofermentatif (Hui et al., 2004). Leu. mesenteroides merupakan bakteri Gram positif, sel berbentuk bulat (spherical) sampai oval dengan diameter 0,9 – 1,2 μm, dan katalase-negatif. Lb. plantarum merupakan bakteri Gram positif, sel berbentuk batang dan panjang dengan ukuran 0,7 – 1 μm, dan katalase-negatif (Chinte-Sanchez, 2008). Strain bakteri asam laktat yang berperan dalam fermentasi yogurt adalah Streptococcus thermophilus dan Lactobacillus bulgaricus. S. thermophilus merupakan bakteri Gram positif, berbentuk coccus, anaerob, katalase-negatif, tidak tumbuh di suhu 100 C tetapi tumbuh baik di suhu 450 C. Bakteri ini dapat menfermentasi laktosa dan sukrosa pada susu, memiliki ß-galaktosidase sehingga hanya menggunakan laktosa, serta menghasilkan asam secara cepat.
Lb. bulgaricus merupakan bakteri Gram positif, berbentuk batang, anaerob, homofermentatif akrotoleran, katalase-negatif, menghasilkan D-(-) laktat (1,8%) dan hidrogen peroksida, serta memiliki ß-galaktosidase (Hui et al., 2004).
Hasil isolasi menunjukkan bahwa terdapat zona jernih di sekitar koloni bakteri pada semua pengenceran di medium MRS-CaCO3 (Tabel 2). Tetapi, pengujian katalase menunjukkan hasil positif berupa terbentuknya gelembung (Tabel 4). Hal ini tidak sesuai teori karena seharusnya bakteri yang berperan dalam fermentasi sayur asin (Leu. mesenteroides dan Lb. plantarum) dan yogurt (Lb. bulgaricus dan S. thermophilus) menunjukkan hasil negatif pada uji katalase karena tidak dapat mengkatalisis H2O2. Sampel kemungkinan mengandung bakteri asam asetat yang dapat menghidrolisis CaCO3 dan dapat mengkatalisis H2O2. Adanya bakteri ini juga ditunjukkan melalui hasil pengecatan Gram, yaitu sel berwarna merah yang menunjukkan bakteri Gram negatif (Tabel 3).
Bakteri asam asetat merupakan bakteri Gram negatif, katalase-positif, tidak membentuk spora, sel berbentuk elips hingga batang dalam pasangan, tunggal, atau rantai pendek. Bakteri ini dapat melakukan fermentasi oksidatif glukosa, arabinosa, fruktosa, galaktosa, mannosa, ribosa, sorbosa, dan xylosa yang menghasilkan aldehid, keton, dan asam organik. Peran bakteri ini adalah dalam pembuatan cuka, palm wine, cocoa powder, nata de coco, dan
kombucha. Pertumbuhan optimal adalah pada pH 5 – 6,5 dengan pH minimal 3 – 4, suhu
CaCO3 sehingga dapat membentuk zona jernih melalui netralisasi AcOH yang dihasilkan bakteri asam asetat oleh CaCO3 (Mamlouk & Gullo, 2013).
Keberadaan bakteri Gram negatif menunjukkan bahwa sampel kemungkinan juga telah terkontaminasi. Hal ini tidak sesuai teori karena produksi senyawa penghambat dan lingkungan medium yang sangat asam oleh bakteri asam laktat seharusnya dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram negatif. Pertumbuhan bakteri Gram negatif pada sampel dapat disebabkan karena pH lingkungan (sampel) yang semakin tinggi atau mendekati netral sehingga lebih mendukung pertumbuhan bakteri ini (Hervert et al., 2017). Selain itu, bakteri asam asetat dapat mengoksidasi asam laktat yang dihasilkan bakteri asam laktat pefermentasi sayur asin dan yogurt. Asam laktat diubah menjadi piruvat kemudian didekarboksilasi menjadi asetaldehid dan dioksidasi menjadi asam asetat (Moens et al., 2014).
IV. KESIMPULAN
Isolasi bakteri asam laktat dari sampel sayur asin dan yogurt ke medium MRS-CaCO3 menunjukkan zona jernih di sekitar koloni sebagai hasil positif. Pengujian katalase dan pengecatan Gram menunjukkan kemungkinan kontaminasi oleh bakteri Gram negatif pada sampel, yaitu bakteri asam asetat.
V. DAFTAR PUSTAKA
Chinte-Sanchez, P. 2008. Philippine Fermented Foods: Principles and Technology. The University of the Philippines Press. Quezon City, p. 218.
Corry, J. E. L., G. D. W. Curtis, R. M. Baird. 2012. Handbook of Culture Media for Food and
Water Microbiology. RSC Publishing. Cambridge, p. 179.
Hervert, C. J., N. H. Martin, K. J. Boor, M. Wiedmann. 2017. Survival and detection of coliforms, Enterobacteriaceae, and gram-negative bacteria in Greek yogurt. J. Dairy Sci 100(2): 950-960.
Hui, Y. H., L. Meunier-Goddik, Å. S. Hansen, J. Josephsen, W. Nip, P. S. Stanfield, F. Toldrá. 2004. Handbook of Food and Beverage Fermentation Technology. Marcel Dekker, Inc. New York, pp. 151-154, 599.
Li, M., H. Zhu, H. Qin, Y. Zhang, H. Yang. 2015. Optimization of a whey containing medium for ß-galactosidase production by Lactobacillus reuteri. In: Advances in Applied Biotechnology. Springer. New York, p. 600.
Moens, F., T. Lefeber, L. D. Vuyst. 2014. Oxidation of metabolites highlights the microbial interactions and role of Acetobacter pasteurianus during cocoa bean fermentation. Appl. Environ. Microbiol. 80(6): 1848-1857.
Mamlouk, D., and M. Gullo. 2013. Acetic acid bacteria: physiology and carbon sources oxidation. Indian J Microbiol. 53(4): 377-384.
Paramithiotis, S. 2017. Lactic Acid Fermentation of Fruits and Vegetables. CRC Press. Florida.
Soni, S. K. 2007. Microbes: a Source of Energy for 21st Century. New India Publishing
