BAB V. KESIMPULAN, SARAN DAN RINGKASAN V.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian, dapat diambil kesimpulan bahwa :
1. Ekspresi P-glycoprotein meningkat sebanyak 21% pada sel Raji/Dox dibandingkan sel Raji Parental (0%).
2. miR-451 tidak terekspresi pada sel Raji/Dox dan sel Raji Parental.
3. Terdapat hubungan antara microRNA dan P-glycoprotein pada resistensi sel Raji terhadap DOX. Hubungan P-glycopretein dengan resistensi sel Raji terhadap DOX berkorelasi dengan kenaikan nilai IC50.
V.2 Saran Saran untuk penelitian selanjutnya :
1. Penelitian lanjutan mengenai ekspresi miR-451 pada sel Raji dengan menggunakan limfosit sebagai pembanding.
2. Perlu dilakukan penelitian mengenai ekspresi miR-451 pada sel lini yang resisten terhadap agen kemoterapi yang tidak terinfeksi virus Epstein-Barr.
3. Perlu dilakukan penelitian mengenai ekspresi miRNA-miRNA lain pada sel Raji, e.g miR-21 yang pada diketahui berhubungan dengan mekanisme resisten pada kanker melalui PTEN sebagai targetnya.
V.3 Ringkasan V.3.1.Latar Belakang
Limfoma merupakan suatu kelompok tumor padat ganas yang muncul pada sistem limfatik (Nogai et al., 2011). Limfoma secara garis besar terbagi menjadi limfoma Hodgkin’s (LH) dan non-Hodgkin’s (LNH). Etiologi LNH sebagian besar belum diketahui. Akan tetapi terdapat beberapa faktor resiko yang menyebabkan dan mempengaruhi perkembangan LNH, yaitu faktor genetik, kelainan sistem imun, lingkungan, dan infeksi patogen (Bilodeau & Fessele, 1998). Salah satu patogen yang diketahui terlibat dalam perkembangan LNH adalah Epstein Barr Virus (EBV) (Au et al., 2004).
Virus EB merupakan salah satu jenis virus yang banyak ditemukan pada penderita kanker (Richardson, 2005). Virus EB mengkode beberapa protein yang mempengaruhi perkembangan host cell. Selain itu, virus EB juga mengkode microRNA virus yang mempengaruhi ekspresi beberapa protein pada host cell maupun microRNA selular. Limfosit B merupakan sel target dari virus EB.
Kemoterapi kombinasi merupakan salah satu standar terapi yang diberikan pada penderita kanker. Doxorubicin (DOX) merupakan salah satu obat kemoterapi kombinasi yang biasanya diberikan bersamaan obat-obat kanker yang lain (Roschewski & Wilson, 2011). DOX bekerja dengan cara mengikat enzim yang terikat pada DNA (e.g enzim topoisomerase I dan II), menginterkalasi dirinya pada DNA (Tacar et al., 2012) dan membentuk suatu kompleks yang dapat memicu pembentukan radikal bebas.
Kasus resistensi terhadap kemoterapi obat banyak ditemukan pada penderita kanker. Adanya over ekspresi P-glycoprotein diketahui menjadi salah satu mekanisme resistensi sel kanker terhadap DOX. Protein P-gp merupakan salah satu protein transporter pengeluaran obat keluar sel. Salah satu faktor yang diketahui mempengaruhi regulasi ekpresi P-gp adalah microRNA yang bekerja dengan mentarget gen MDR-1.
miRNA ditemukan terlibat pada fisiologi maupun proses patofisiologi seperti apoptosis atau kanker. miRNA memiliki kemampuan memainkan peran fungsional yang penting pada perkembangan kanker (Rodrigues et al., 2011). Salah satu miRNA seluler yang mulai dikembangkan sebagai kandidat biomarker untuk kanker adalah microRNA-451 (miR-451). Beberapa penelitian memperlihatkan adanya keterlibatan miR-451 pada perkembangan kanker. Salah satunya adalah keterlibatan miR-451 terhadap mekanisme resistensi terhadap kemoterapi obat antikanker Doxorubicin pada sel lini MCF-7.
V.3.2.Tinjauan Pustaka 1. Limfoma
Limfoma merupakan tumor padat yang muncul pada sistem limfatik (National Cancer Institute, 2007). WHO mengkategorikan limfoma menjadi limfoma Hodgkins dan non-Hodgkins (Sel B dan Sel T. Pada LNH, limfosit mengalami pembelahan yang lebih cepat dibandingkan dengan limfosit normal. Akibatnya limfosit tidak memerankan perannya untuk melindungi tubuh dari infeksi atau patogen. LNH dapat muncul dibeberapa bagian tubuh, diantaranya pada kelenjar getah bening, sum-sum tulang, limpa, darah ataupun organ tubuh yang lain.
Etiologi LNH sebagian besar belum diketahui. Akan tetapi terdapat beberapa faktor resiko yang menyebabkan LNH, yaitu faktor genetik, penurunan sistem imun, infeksi patogen, dan lingkungan (Bilodeau & Fessel 1998). Di beberapa negara, sejumlah LNH perkembangannya lebih disebabkan oleh infeksi virus (Longo 2010). Beberapa virus yang diketahui terlibat dalam perkembangan LNH adalah Human Immunodeficiency Virus (HIV), Human T-cell Lymphotropic Virus (HTLV), Human Herpes Virus 8 (HHV8), dan Epstein Barr Virus (EBV) (Au et al., 2004).
Virus EB merupakan suatu virus DNA dari genus Lymphocryptoviridae, subtipe gamma-1 dari sub-famili Gammaherpesvirinae (McLaughlin-Drubin dan Munger 2008,
Ocheni et al., 2010). Virus EB terlibat pada perkembangan keganasan dari beberapa penyakit (Ocheni et al., 2010). Salah satunya pada limfoma Burkitt. Potensi keganasan penyakit ditingkatkan dengan adanya protein LMP-1 dan EBNA-1 virus EB. Adanya infeksi virus EB juga diketahui mempengaruhi aktifitas dan ekspresi dari microRNAs selular yang terlibat pada patogenesis beberapa penyakit. Selain limfoma Burkitt, beberapa penyakit yang terkait dengan virus EB meliputi karsinoma nasofarings, Hodgkin disease, Lymphoproliverative disease, dan Oral hairy leukoplakia.
Genom virus EB mengkode kurang lebih 80 protein (Straus et al., 1993), Virus EB selain mengkode protein fungsional juga menkode 40 microRNA (Amoroso et al., 2011). Fungsi dari kebanyakan miRNAs virus EB belum banyak diketahui. miRNA yang dikode oleh virus dapat bekerja sebagai regulator ekpresi gen virus atau mengganggu ekpresi host gene (Lagana et al., 2010). miRNAs virus mungkin mengkontrol proliferasi host cell melalui mentarget siklus sel dan regulator apoptosis.
3. Raji-Burkitt’s Lymphoma cell line
Raji-Burkitt’s Lymphoma cell line (Sel Raji) adalah sel yang mirip dengan sel limfoblast. Sel Raji merupakan sel yang terinfeksi EBV. Sel Raji merupakan tipe suspension cell dengan bentuk spheric (bulat). Inti sel dari sel Raji memiliki bentuk irregular (Das et al., 2002). Epstein et al. (1966) menjelaskan dari hasil penelitiannya menunjukkan sel Raji memiliki karakteristik diferensiasi yang kurang yang diperlihatkan dengan pembentukan agregasi yang besar yang berisi ratusan individu, diameter yang relatif besar, inti yang tidak teratur, dan sitoplasma yang cukup besar dengan ribosom bebas yang cenderung menggumpal 4. MicroRNA
MicroRNA (miRNA) merupakan famili dari small RNA (RNAs) endogen yang diturunan dari perkusor besar yang membentuk struktur stem-loop yang tidak sempurna. miRNA memiliki panjang ~22 nukleotida dan berperan penting sebagai molekul pengatur gen pada organisme multiseluler, kontrol stabilitas, translasi mRNA pengkode protein dan mempengaruhi hasil protein yang dikode oleh mRNA (Bartel, 2004; Bueno dan Malumbers, 2011).
Bartel (2004) mengungkapkan bahwa setiap miRNA melakukan fungsi molekularnya dengan mengarahkan komplek RISC (RNA-induced silencing complex) ke arah mRNA target yang menyebabkan penghambatan translasi atau degradasi mRNA target. Oleh karena itu penurunan atau penghambatan miRNA umumnya memicu peningkatan ekspresi dari mRNA target. miRNA banyak ditemukan terlibat dalam perkembangan beberapa kanker (Ferracin et al., 2011). miRNA mempengaruhi proses yang berkaitan dengan perkembangan kanker seperti proliferasi, kontrol siklus sel, apoptosis, diferensiasi, migrasi dan metabolisme.
5. MicroRNA-451
MikroRNA-451 (miR-451) merupakan salah satu jenis miRNA yang ditemukan terlibat pada beberapa perkembangan kanker. Berdasarkan pada alignment dari sekuens miR-451 yang mature dengan sekuens genomiknya, miR-miR-451 dipetakan pada kromosom 17q11.2 dengan koordinat genomik (GRCh37): 17:27,188,386 - 27,188,457. miR-451 mengatur pengaktifan dari beberapa ekspresi gen dan proses yang berhubungan dengan apoptosis, pengaturan migrasi serta proliferasi sel (Godlewski et al. 2010), mekanisme resistensi terhadap obat anti kanker (Kovalchuk et al., 2008), mempengaruhi sinyal, regulasi jalur beberapa gen serta memungkinkan adanya adaptasi terhadap stress metabolik (Gao, 2011). 6. Doxorubicin
Doxorubicin (DOX) termasuk kelompok obat antrasiklin kemoterapi yang paling banyak digunakan dalam pengobatan penyakit kanker. Bodley et al. (1989) menjelaskan
bahwa DOX memiliki kemampuan untuk berinterkalasi di antara pasangan basa double-helix DNA di dalam inti sel sehingga merusak fungsi dari DNA, dan mengikat enzim yang berhubungan dengan DNA (e.g topoisomerase I dan II). DOX dapat memicu adanya radikal bebas yang menyebabkan kerusakan DNA lebih lanjut, penghambatan, produksi makromolekul, unwinding / pemisahan DNA dan peningkatan alkilasi. Radikal bebas yang terbentuk memungkinkan terjadinya peningkatan efek samping toksisitas dari penggunaan obat.
7. Multidrug Resistance (MDR) pada Kanker
Resistensi sel kanker terhadap pengobatan dengan obat-obatan antikanker dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu penurunan uptake obat, peningkatan perbaikan kerusakan DNA, penurunan apoptosis, perubahan metabolisme obat, perubahan membran lipid, induksi respon berbahaya pada gen, peningkatan atau perubahan target obat dan peningkatan pompa pengeluaran obat (Szakacs et al., (2006), Gottesman (2002)).
Sel kanker yang resisten terhadap pengobatan membuat tumor kurang sensitif terhadap efek sitotoksik atau sitostatika obat-obat anti kanker sehingga memungkinkan perkembangan tumor yang lebih ganas (Wiemer, 2010). Resistensi terhadap pengobatan menyebabkan sel kanker mampu bertahan dan menghindari pengobatan kemoterapi (Gao 2011).
V.3.3 Landasan Teori
Limfoma merupakan salah satu tumor ganas yang muncul pada sistem limfatik. Limfoma terjadi akibat dikategorikan menjadi limfoma non-Hodgkins dan limfoma Hodkins. Dibandingkan limfoma Hodgkins, limfoma non-Hodgkins lebih banyak ditemukan kejadiannya di beberapa negara di dunia. Limfoma non-Hodgkins merupakan jenis kanker padat. Perkembangannya dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya adalah faktor genetik, gangguan sistem imun, infeksi patogen dan lingkungan. Salah satu faktor yang
ditemukan pada pasien LNH adalah adanya infeksi dari virus Epstein-Barr (virusEB). Virus EB mengkode beberapa protein seperti EBNA, EBER, LMP dan microRNA virusyang mempengaruhi host cell. Virus EB menyerang limfosit B. Limfoma Burkitt merupakan salah satu limfoma sel B yang perkembangannya dipengaruhi oleh virus EB.
Kemoterapi kombinasi dengan menggunakan obat-obat anti kanker banyak dimanfaatkan dalam pengobatan kanker, salah satunya adalah dengan menggunakan obat doxorubicin (DOX). DOX merupakan obat antrasiklin yang memiliki kemampuan melawan sel-sel yang membelah secara cepat. Terapi kombinasi DOX banyak digunakan pada pasien kanker termasuk limfoma non-Hodgkins dengan mengkombinasikannya dengan obat yang lain.
Meskipun DOX sangat efektif digunakan untuk kemoterapi, pada beberapa kasus ditemukan adanya resistensi terhadap kemorapi yang diberikan pada penderita kanker. Salah satu faktor yang diketahui memperngaruhi resistensi terhadap DOX adalah adanya peningkatan protein transporter pengeluaran obat keluar sel, P-glycoprotein (P-gp). MicroRNA (miRNA) merupakan famili dari small RNA (RNAs) yang memiliki panjang ~22 nukleotida dan berperan penting sebagai molekul pengatur gen pada organisme multiseluler, kontrol stabilitas, translasi mRNA pengkode protein dan mempengaruhi hasil protein yang dikode oleh mRNA. miRNA mampu mempengaruhi stabilitas mRNA targetnya dan bereaksi sebagai regulator post-transkripsi melalui mekanisme penghambatan translasi mRNA, peningkatan degradasi mRNA, atau peningkatan translasi mRNA pada kondisi stress.
MicroRNA (miRNA) banyak ditemukan terlibat pada perkembangan kanker. Deregulasi miRNA juga terlibat dalam mekanisme resistensi obat doxorubicin pada beberapa sel kanker melalui pengaturannya terhadap gen targetnya. Salah satu miRNA yang diketahui terlibat pada MDR adalah miR-451. Melalui pengaturannya terhadap gen targetnya (MDR-1), miR-451 mempengaruhi ekspresi dari P-gp (protein transporter obat). Deregulasi miR-451
menyebabkan peningkatan ekspresi dari MDR-1 dan protein P-gp. Doxorubicin merupakan substrat dari P-gp, apabila terjadi peningkatan ekpresi P-gp maka akan menyebabkan peningkatan jumlah Doxorubicin yang dikeluarkan dari dalam sel sehingga sel kanker menjadi resisten terhadap kemoterapi yang diberikan.
V.3.3.Cara Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian ekperimental murni, dengan “Post test with control group design”. Subyek penelitian berupa dua jenis sel Raji, yaitu sel Raji Parental dan sel Raji/Dox. Kedua sel dikulturkan pada media komplit RPMI 1640 tanpa doxorubicin dan diinkubasi pada suhu 37oC dengan CO2 5%. Resistensi sel terhadap doxorubicin dianalisis dengan menggunakan uji MTT dengan melihat nilai IC50. Ekpresi P-gp pada kedua sel dideteksi dengan metode imunositokimiawi sedangkan jumlah sel yang terekspresi dihitung pada 10 lapang pandang dengan jumlah sel minimal 20 sel/lapang pandang. Analisis microRNA 451 dilakukan dengan menggunakan quantitative Real Time-PCR.
V.3.4. Hasil Penelitian dan Pembahasan 1. Pengamatan Morfologi Sel Raji
Hasil pengamatan pertumbuhan pada sel Raji Parental dan sel Raji/Dox di bawah mikroskop memperlihatkan bahwa sel Raji merupakan tipe suspension cell dengan bentuk spheric (bulat). Hasil pengamatan pertumbuhan memperlihatkan karakteristik morfologi dari sel Raji, yaitu sel Raji yang hidup terlihat tembus cahaya. Sedangkan sel Raji yang mati terlihat memiliki bentuk membulat dengan ukuran yang lebih kecil dan tampak lebih gelap jika dibandingkan dengan sel Raji Parentalnya.
Aktivitas proliferasi pada sel Raji/DOx menurun dibandingkan sel Raji Parental. Penurunan aktifitas proliferasi pada sel yang memperlihatkan fenotip resisten terhadap obat disebabkan oleh adanya perubahan ekspresi pada beberap protein yang mengkontrol siklus
sel (Lukyanova et al., 2009). Pop et al., (2008) mengemukakan bahwa pada sel yang resisten terjadi proliferasi yang lebih lambat sebagai mekanisme adaptasi terhadap lingkungan.
2. Uji Aktivitas Sitotoksik Doxorubicin
Hasil uji resistensi sel terhadap DOX dengan uji MTT memeperlihatkan bahwa sel Raji/Dox memiliki nilai IC50 dua kali lebih besar dibandingkan sel Raji Parental. Nilai IC50 untuk sel Raji Parental sebesar 8.82 μg/mL dan sel Raji/Dox sebesar 17.15 μg/mL. Peningkatan nilai IC50 pada sel yang resisten terhap DOX terjadi karena adanya peningkatan kemampuan sel untuk beradaptasi terhadap dosis DOX yang diberikan. Selain itu adanya peningkatan protein P-glycoprotein yang menyebabkan pemompaan keluar obat dari dalam ke luar sel sehingga akumulasi obat di dalam sel menurun (Shen et al., 2007). DOX juga dapat mengaktifkan pengikatan DNA dengan p53, dimana p53 memerankan peran penting dalam sitotoksisitas terhadap DOX (Minotti et al., 2004). Zhang et al. (1995) mengemukakan bahwa aktifasi p53 oleh DOX berkontribusi terhadap resistensi melalui induksi produk gen WAF1/CIP1 p21.
Grafik viabilitas sel Raji. Viabilitas sel Raji parental dan Raji/Dox setelah diberi perlakuan doxorubicin konsentrasi bertingkat dengan metode MTT assay. Nilai IC50 untuk sel Raji Parental sebesar 8.824092 μg/mL dan sel Raji/Dox sebesar 17.15686 μg/mL 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 V ia b il it a s se l (% ) Konsentrasi (ug/mL) Raji Sensitif Raji/DOX
3. Ekpresi Protein P-glycoprotein (P-gp) pada Sel Raji
Hasil analisis ekpresi P-glycoprotein pada kedua sel memperlihatkan bahwa ekpresi P-glycoprotein hanya ditemukan pada sel Raji/Dox. Sedangkan pada sel Raji Parental tidak ditemukan adanya ekpresi P-glycoprotein. Hasil perhitungan memperlihatkan bahwa pada Sel Raji Parental tidak ditemukan sel yang mengekspresikan P-gp (persentase 0%), sedangkan pada sel Raji/Dox 1% terlihat adanya ekspresi P-gp (21%).
Ekspresi P-gp pada sel Raji Parental. Sel Raji Parental tidak mengekspresikan P-gp, ditandai dengan tidak terbentuknya warna cokelat pada membran sitoplasmanya, (x 400).
Ekspresi P-gp pada sel Raji/Dox. Sel Raji/Dox mengekspresikan P-gp, ditandai dengan terbentuknya warna cokelat pada membran sitoplasmanya (panah warna merah), (x 400 dan x 1000).
Broxterman et al. (2009) menjelaskan bahwa P-gp merupakan salah satu transporter pengeluaran obat antikanker yang berperan dalam mekanisme resistensi kemoterapi pada pasien kanker. Salah satu fenotip yang menunjukkan adanya resistensi terhadap obat kemoterapi adalah adanya penurunan akumulasi obat dan overekspresi dari P-glycoprotein (P-gp). Adanya overekpresi P-gp banyak ditemukan pada sel-sel yang resisten terhadap kemoterapi (Zhang et al., 2009).
Penelitian oleh Fardel et al. (1997) menyebutkan bahwa pada sel yang diberikan perlakuan doxorubicin memperlihatkan adanya overekspresi P-glycoprotein melalui peningkatan ekspresi gen MDR1. Terjadinya overekspresi P-gp dapat dipengaruhi oleh adanya perubahan pada jumlah gen atau transkripsi. Sedangkan pada sel-sel kultur, terjadinya overekpresi P-gp dapat disebabkan oleh beberapa stimulus seperti radiasi UV, heat shock, serta agen-agen kemoterapi (Martinez et al., 2007). McCubrey et al., (2006) menjelaskan bahwa DOX dapat menghasilkan ROS yang memicu stress oksidatif yang berperan dalam efek antitumor. Peningkatan P-gp terjadi akibat ROS memicu perubahan fungsi enzim fosfatase yang berperan dalam penghambatan p53 sehingga menyebabkan terganggunya regulasi ekpresi protein Raf yang dapat mempengaruhi ekspresi dari gen MDR1.
4. Ekpresi microRNA 451 (miR 451) pada Sel Raji
Hasil isolasi sel Raji Parental dan sel Raji/Dox dari frozen cell menunjukkan nilai konsentrasi RNA yang dihasilkan sebesar 119.4 μg dan 114.7 μg tiap mL sampel sel dan terbentuk dua pita pada gel agarose 2%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak ditemukan adanya ekspresi miR 451 baik pada sel Raji Parental maupun sel Raji/Dox. Grafik amplifikasi dan kurva hasil qRT-PCR memperlihatkan amplifikasi hanya terjadi pada U6
SnRNA dan UniSp6 di kedua sampel sel Raji. Selain itu, hasil elektroforegram pada gel agarose 2% juga menunjukkan tidak ditemukannya pita miR 451 baik pada sampel H2O, Raji Parental, maupun Raji/Dox.
Kurva amplifikasi dengan Biorad CFX ManagerTM Software. Adanya amplifikasi pada U6 SnRNA dan UniSp6 ditandai dengan terbentuknya kurva berbentuk geometri, sedangkan miR451 tidak teramplifikasi terlihat dari bentuk kurva berupa plateau.
Tidak terekpresinya microRNA 451 pada hasil penelitian kemungkinan dikarenakan karena adanya pengaruh dari virus Epstein-Barr. Adanya infeksi virus Epstein-Barr diketahui dapat mempengaruhi ekpresi microRNA seluler dari sel yang terinfeksi virus (Skalsky dan Cullen, 2010). Virus Epstein-Barr secara aktif meregulasi ekspresi microRNA selular dari host cell untuk menciptakan lingkungan yang sesuai untuk virus.
Cullen (2013) mengemukakan bahwa virus dapat mempengaruhi biogenesis microRNA seluler. Meskipun mekanisme interaksi secara langsung antara virus dengan microRNA seluler belum diketahui secara jelas, namun beberapa penelitian memberikan gambaran bagaimana virus dapat menurunkan ekpresi microRNA selular. Skalsky dan Cullen (2010) menjelaskan virus dapat mempengaruhi ekspresi microRNA seluler melalui kompetisi dengan pre-miRNAs seluler terhadap Exportin-5 di nukleus dan menghambat fungsi Dicer pada sitoplasma, overekspresi microRNA virus, menghasilkan protein atau RNA yang secara selektif menghambat fungsi dari microRNA selular.
Selain adanya pengaruh dari virus, tidak terekspresinya miRNA 451 mungkin dikarenakan adanya downregulasi ekspresi miRNA 451. Jannson dan Lund (2012) menjelaskan bahwa downregulasi ekspresi microRNAs dapat dipengaruhi oleh adanya deregulasi dari transkripsi gen microRNA melalui mekanisme genetik, epigenetic, dan faktor transkripsi. Adanya mutasi atau downregulasi dari protein-protein yang berperan dalam biogenesis microRNA (i.e Dicer, Drosha, XPO5, P53) juga dapat mempengaruhi deregulasi dari microRNA. Martello et al., (2010) menjelaskan bahwa adanya downregulasi ekspresi microRNA juga dapat dipengaruhi oleh microRNA yang lain. Salah satunya pada miRNA-103/107 family yang memperlihatkan mentarget Dicer yang menyebabkan penurunan jumlah microRNA.
V.3.5. Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian, dapat diambil kesimpulan bahwa :
1. Ekspresi P-glycoprotein meningkat sebanyak 21% pada sel Raji/Dox dibandingkan sel Raji Parental (0%).
2. miR-451 tidak terekspresi pada sel Raji/Dox dan sel Raji Parental.
3. Terdapat hubungan antara microRNA dan P-glycoprotein pada resistensi sel Raji terhadap DOX. Hubungan P-glycopretein dengan resistensi sel Raji terhadap DOX berkorelasi dengan kenaikan nilai IC50.
