FUSI GEN KITINASE Aeromonas caviae WS7b DENGAN PROMOTOR sigb DARI Bacillus subtilis 168 DAN EKSPRESINYA PADA Escherichia coli ADE SAPUTRA

FUSI GEN KITINASE Aeromonas caviae WS7b DENGAN

PROMOTOR sigB DARI Bacillus subtilis 168 DAN

EKSPRESINYA PADA Escherichia coli

ADE SAPUTRA

DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN

FAKULTAS PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

ABSTRAK

ADE SAPUTRA. Fusi Gen Kitinase Aeromonas caviae WS7b dengan

Promotor sigB dari Bacillus subtilis 168 dan Ekspresinya pada Escherichia coli . Dibimbing oleh GIYANTO.

Hama dan penyakit adalah salah satu masalah yang dihadapi oleh petani dalam sistem pertanian. Banyak metode pengendalian yang dilakukan oleh petani untuk mengurangi kehilangan hasil yang disebabkan oleh hama dan penyakit, salah satunya adalah penggunaan agens antagonis. Di alam, banyak organisme yang berpotensi menjadi agens antagonis bagi patogen tanaman. Organsime yang memiliki potensi tersebut dan digunakan dalam penelitian ini adalah Aeromonas

caviae WS7b. Bakteri ini mampu mengendalikan beberapa cendawan patogen

tanaman. Bakteri ini memiliki gen yang mampu menghasilkan enzim kitinase, yaitu gen chiA. Enzim ini mendegradasi dinding sel cendawan yang tersusun dari kitin. Tetapi bakteri ini tidak dapat langsung dilepas di alam sebagai agens antagonis karena bakteri ini bersifat patogen pada manusia. Sehingga perlu dilakukan rekayasa genetik terhadap gen chiA tersebut. Gen chiA ini akan digabung dengan promotor gen sigB yang terdapat pada Bacillus subtilis 168, gen

sigB ini akan terekspresi sebagai respon terhadap cekaman lingkungan secara

umum. Sehingga gen chiA ini akan terekspresi saat bakteri berada dalam cekaman lingkungan. Tahap awal penelitian ini adalah ekstraksi DNA total dari Bacillus

subtilis 168 dan Aeromonas caviae WS7b dengan metode yang berbeda untuk

masing-masing bakteri. Kemudian dilakukan amplifikasi terhadap gen chiA dan promotor gen sigB menggunakan metode polymerase chain reaction (PCR). Fragmen promotor sigB dan chiA berhasil diamplifikasi dengan PCR. Tahap berikutnya adalah penyiapan plasmid pDL2 yang akan digunakan sebagai pembawa gen rekombinan. Plasmid pDL2 diperbanyak dengan cara mentransformasikannya ke dalam bakteri Escherichia coli DH5 . Kemudian bakteri E. coli tersebut diperbanyak pada media nutrient agar (NA) yang mengandung ampisilin dengan konsentrasi 50 µg/ml. E. coli DH5 yang telah tertransformasi oleh pDL2 dibiakan pada media ampisilin dengan konsentrasi yang sama dengan saat melakukan trasnformasi. Plasmid yang telah diperbanyak dalam sel bakteri E. coli DH5 , kemudian diekstraksi. Hasil amplifikasi fragmen promoter sigB dan chiA, dipotong menggunakan enzim restriksi. Promoter gen

sigB dipotong menggunakan enzim restriksi HpaI dan NheI, sedangkan gen chiA

dipotong menggunakan NheI dan ApaI. Promotor gen sigB dan chiA digabungkan dengan enzim ligasi. Kedua fragmen tersebut telah berhasil digabungkan, sehingga menjadi gen rekombinan. Plasmid pDL2 yang telah dipurifikasi, dipotong menggunakan dua enzim restriksi, yaitu HpaI dan ApaI, sehingga membentuk ujung yang sama dengan gen rekombinan. Kemudian gen rekombinan yang telah dihasilkan sebelumnya, digabungkan dengan plasmid dan direkatkan dengan enzim ligasi. DNA rekombinan yang telah disambungkan dengan plasmid, berhasil ditransfomasikan ke dalam sel bakteri E. coli DH5 . Bakteri transforman ini menunjukkan aktivitas kitinase pada media kitin, karena di sekitar koloni bakteri transforman tersebut terbentuk zona bening. Hal ini menandakan bahwa gen kitinase A. caviae WS7b mampu terekspresi dengan baik di bawah promotor

FUSI GEN KITINASE Aeromonas caviae WS7b DENGAN

PROMOTOR sigB DARI Bacillus subtilis 168 DAN

EKSPRESINYA PADA Escherichia coli

ADE SAPUTRA

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Pertanian pada Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor

DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN

FAKULTAS PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

Judul Penelitian : Fusi Gen Kitinase Aeromonas caviae WS7b dengan Promotor sigB dari Bacillus subtilis 168 dan Ekspresinya pada Escherichia coli

Nama Mahasiswa : Ade Saputra NRP : A34053156

Disetujui Pembimbing

Dr. Ir. Giyanto, MSi. NIP: 19670709 199303 1 002

Diketahui

Ketua Departemen Proteksi Tanaman

Dr. Ir. Dadang, MSc. NIP: 19640204 199002 1 002

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bandung pada tanggal 6 Oktober 1987 sebagai anak pertama dari dua bersaudara dari pasangan Reddy Susanto dan Nunik Kustianti. Penulis menyelesaikan sekolah di SMUN 6 Surabaya pada tahun 2005 dan diterima di IPB melalui jalur UMPTN pada tahun yang sama. Pada tahun kedua masuk ke Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.

Selama kuliah penulis pernah mengikuti lomba karya tulis dalam bidang penelitian, seminar dan kepanitiaan serta organisasi sebagai anggota ITRC (Insect

Teaching & Research Collection) (2007). Selain itu penulis juga pernah magang

di Laboratorium Bakteriologi, Departemen Proteksi Tanaman (2007), menjadi asisten praktikum pada mata kuliah Entomologi Umum dan Dasar-Dasar Proteksi Tanaman.

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT karena dengan rahmat dan karunia-Nya, penelitian yang berjudul “ Fusi Gen Kitinase Aeromonas caviae WS7b dengan Promotor sigB dari Bacillus subtilis 168 dan Ekspresinya pada

Escherichia coli” dapat diselesaikan oleh penulis. Pada kesempatan ini penulis

ingin mengucapkan terima kasih kepada kedua orang tua dan adikku tercinta (Reddy Susanto H, Nunik Kustianti dan Evi Yulianti), Dr. Giyanto, Dr. Kikin H Mutaqin, Dr. Tri Asmira Damayanti, Dr Dadan Hindayana, dan rekan-rekan Laboratorium Bakteriologi (Mbak Didi, Mbak Saksak, Mas Eko, Mbak Sulis, Mbak Nisa, Mbak Methy, Mbak Reni, Mbak Anggie, Mbak Ika, Mas Hakim, dan Mas Yoyo) serta teman-teman DPT’42 yang telah memberikan dukungan dan bantuan selama penelitian.

Bogor, November 2009

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR GAMBAR ... vii

PENDAHULUAN Latar Belakang ... 1

Tujuan Penelitian ... 3

Manfaat Penelitian ... 3

TINJAUAN PUSTAKA Bacillus subtilis Sebagai Agens Hayati ... 4

Aeromonas caviae ... 5

Teknologi DNA Rekombinan ... 7

Enzim Kitinase ... 7

BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu ... 8

Uji aktivitas kitinase A. caviae WS7b dan B. subtilis 168 ... 8

Uji potensi antagonisme A. caviae WS7b dan B. subtilis 168 terhadap cendawan patogen ... 8

Preparasi DNA kromosom dan plasmid pDL2 Ekstraksi DNA kromosom A. caviae WS7b ... 9

Ekstraksi DNA Bacillus subtilis 168 ... 9

Amplifikasi Gen chiA dan promotor sigB Amplifikasi promotor sigB dengan PCR ... 10

Amplifikasi promotor sigB dengan PCR ... 11

Purifikasi fragmen chiA dan promotor sigB ... 11

Penyambungan fragmen promotor sigB dan chiA Pemotongan fragmen promotor sigB dan chiA ... 12

Ligasi fragmen promotor sigB dan chiA ... 13

Penyisipan fragmen sigB-chiA pada plasmid pDL2 Pemotongan dan purifikasi plasmid pDL2 ... 14

Ligasi fragmen sigB-chiA dengan pDL2 ... 15

Transformasi plasmid rekombinan pada E. coli DH5 Penyiapan E. coli DH5 kompeten ... 15

Transformasi plasmid rekombinan ke dalam E. coli DH5 ... 15

Pengujian aktivitas kitinase transforman E. coli DH5 ... 16

HASIL DAN PEMBAHASAN Uji aktivitas kitinase A. caviae WS7b dan B. subtilis 168 ... 17

Uji potensi antagonisme A. caviae WS7b dan B. subtilis 168 terhadap cendawan ... 17

Ekstraksi DNA A. caviae WS7b dan B. subtilis 168 ... 19

Amplifikasi promotor sigB dengan PCR ... 20

Amplifikasi fragmen chiA dengan PCR ... 22

Penyisipan fragmen sigB-chiA pada plasmid pDL2 ... 25 Transformasi plasmid rekombinan ke dalam E. coli DH5 ... 26 Pengujian aktivitas kitinase transforman E. coli DH5 ... 27 KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan ... 28 Saran ... 28 DAFTAR PUSTAKA ... 29

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1 Aktivitas enzim kitinase A. caviae WS7b pada media kitin ... 6

Gambar 2 Skema uji dual culture antara bakteri dan cendawan uji ... 9

Gambar 3 Uji aktivitas kitinase E. coli transforman dan E. coli pembawa pDL2 pada media kitin ... 16

Gambar 4 Aktivitas kitinase A. caviae WS7b pada media agar kitin ... 17

Gambar 5 Uji dual culture Pythium sp dengan B. subtilis 168 dan A.caviae WS7b ... 18

Gambar 6 Uji dual culture R. solani dengan B. subtilis 168 dan A.caviae WS7b ... 18

Gambar 7 Uji dual culture F. oxysporum dengan B. subtilis 168 dan A.caviae WS7b ... 19

Gambar 8 Hasil ekstraksi DNA total A. caviae WS7b dan B. subtilis 168 .. 20

Gambar 9 Hasil amplifikasi fragmen promotor sigB ... 21

Gambar 10 Sekuen nukleotida promotor sigB ... 22

Gambar 11 Hasil amplifikasi fragmen gen chiA ... 23

Gambar 12 Sekuen nukleotida fragmen gen chiA dengan ukuran 2,9 kb ... 24

Gambar 13 Situs restriksi pada fragmen promotor sigB ... 24

Gambar 14 Situs restriksi pada fragmen promotor chiA ... 25

Gambar 15 Hasil penggabungan fragmen sigB-chiA ... 25

Gambar 16 Hasil pemotongan plasmid pDL2 ... 25

Gambar 17 Skema hasil penggabungan fragmen sigB-chiA dengan pDL2 .. 25

Gambar 18 Skema letak fragmen DNA rekombinan pada plasmid pDL2 .... 26

Gambar 19 Hasil transformasi plasmid pDL2 ke dalam bakteri E. coli DH5 (a) Kontrol (b) pDL2 pembawa DNA rekombinan ... 26

Gambar 20 Aktivitas kitinase E. coli DH5 transforman pada media kitin .. 27

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Hama dan penyakit merupakan salah satu masalah utama dalam sistem pertanian. Teknik pengendalian yang digunakan oleh petani untuk mengatasi masalah ini, antara lain dengan pestisida, kultur teknis, mekanis, dan menggunakan musuh alami. Namun, pengendalian terhadap hama dan penyakit yang paling sering dilakukan oleh petani adalah pengendalian secara kimiawi. Penggunaan pestisida secara tidak bijaksana akan dapat menimbulkan masalah di lingkungan. Menurut Delph (1994), fungisida yang telah dipergunakan oleh masyarakat Jepang selama bertahun-tahun dan pada tahun 1971 terjadi resistensi pada fungisida berbahan aktif kasugamicin dan diikuti oleh beberapa jenis fungisida lainnya, seperti benzimidazole, dicarboximid, organofos, oksicarboksin, sterptomicin, dan lain-lain. Penggunaan agens hayati di lapangan merupakan salah satu alternatif pengendalian terhadap hama dan penyakit tanaman. Penggunaan agens hayati di lapangan memiliki beberapa keuntungan, antara lain meningkatkan produktivitas tanaman dengan sumberdaya yang ada, mencegah terjadinya resistensi pathogen terhadap bahan kimia, aman bagi lingkungan, sesuai dengan konsep pertanian berkelanjutan (Cook & Baker 1996). Menurut Soglio et

al.. (1998), Trichoderma harzianum Th008 mampu menghambat pertumbuhan

cendawan Rhizoctonia solani pada perakaran kedelai. Selain menjadi agens pengendali hayati, juga ada yang mikroorganisme yang menjadi pemicu pertumbuhan tanaman, sehingga lebih tahan terhadap serangan penyakit, seperti

Bacillus subtilis, dan Pseudomonas fluorescens (Siddiqui 2006). Pada kondisi

lapang di Thailand, plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) yang terdiri atas campuran B. amyloliquefaciens strain IN973a dan B. pumilus strain IN973a, dapat menginduksi ketahanan sistemik pada tanaman terhadap penyakit hawar daun yang disebabkan oleh Sclerotium rolfsii, antraknosa pada cabai yang disebabkan oleh Colletotrichum gloeosporioides, dan mosaik pada mentimun yang disebabkan oleh CMV (Siddiqui 2006).

Menurut Soglio et al. (1998), Trichoderma harzianum Th008 dapat menghambat pertumbuhan cendawan Rhizoctonia solani pada perakaran kedelai