Kloning tanaman apoptin GFP pada tembaka

(1)

Kelompok 5 Vina Damayanti 1306370865

Ambar Maresya 1306370796 Claudia Maya

1306412180

Seffiani 1306370783

Getta Austin (1306405364) Itamar Pascana S

1306371016

Rekayasa Genetika

Teknologi Bioproses Fakultas Teknik

TANAMAN TEMBAKAU

DENGAN

(2)

STRATEGI KLONING

APOPTIN + GFP PADA TANAMAN

TEMBAKAU DENGAN

AGROBACTERIUM

Modifikasi Gen

endo-1,4-beta-D-glucanase

Pemilihan Vektor Puc19

Pemilihan Host E.Coli

ER2275

Pemilihan Restriction Site

pada Plasmid

Penyisipan GFP ke dalam

Plasmid

Modifikasi Gen Apoptin

TRANSFORMASI PLASMID KE

E-COLI DENGAN METODE HEAT SHOCK + CACL₂ Transformasi

menggunakan Triparental

Mating

Introduksi ke Tanaman Tembakau (Nicotiana tabacum L.)

(3)

Strategi Modifikasi Gen

(4)

Endo-1,4-beta-D-glucanase

• Endo-1,4-β-D-glucanases (EGS) merupakan

enzim spesifik yang mengkatalisis reaksi

hidrolisis dari selulosa. Enzim ini dapat berasal

dari fungi, bakteri, dan protozoa.

• Specific activity

: ~80 U/mg (40

o

C, pH 4.5,

(5)

(6)

Pemilihan Vektor pUC19



_{Banyak digunakan sebagai vektor untuk kloning dalam E.coli}



_{pUC19 diisolasi dari}

_{E. coli}

_{strain ER2272}



_{Memiliki circular double stranded DNA dan mempunyai 2686}

bp (

base pairs

).



_{Mudah ditransfeksikan kedalam E coli dengan metode yang}

sederhana dan relatif murah (seperti

heat shock

)



_{Dapat dengan cepat bereplikasi dan mudah diseleksi dengan}

(7)

Pemilihan Host E.Coli ER2275

Host cell

ini

merupakan sel inang

yang cocok sebagai

growth strain

bagi vektor plasmid pUC19 dan

sangat cocok

dijadikan media

transformasi.

1. Transformasinya efisien, strain ini

memiliki tingkat efisiensi tinggi.

2. Disablement

yang baik, memiliki

penanda (

marker

).

(8)

(9)

Memiliki origin of replication, sebagai syarat replikasi. Vektor pUC19 memiliki yang namanya oriV

Mempunyai dua gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke dalam sel inangnya nanti. Gen marker ini dapat ditandai dengan amphicilin dan blue-white screening.

Ukuran yang sesuai, memiliki ukuran yang relatif kecil dibandingkan dengan pori dinding sel inang sehingga dapat dengan mudah melintasinya.

(10)

Pemilihan

Restriction Site

pada Plasmid

• Untuk melakukan cloning DNA insert ke dalam vector cloning, dibutuhkan dua enzim

restriksi yang berbeda untuk membentuk ujung yang kompatibel.

• _{Enzim yang digunakan menghasilkan ujung yang kohesif atau}

_{sticky ends}

_untuk

memastikan bahwa penggabungan insert berada pada arah yang benar. Enzim yang

dipilih diusahakan agar tidak menghasilkan potongan yang komplemen satu sama

lainnya (

compatible end

) sehingga arah penyisipan fragmen dapat terbalik.

• _{Restriction Site}

_{yang dipilih adalah BamHI pada ujung 5 dan EcoRI pada ujung 3 .}

_‟

(11)

(12)

GFP (Green Fluorescence Protein)

• Asal : Ubur-ubur Aequoria victoria

• Memancarkan warna Hijau pada 509 nm.

• Sequence :

1 MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFICTT

51GKLPVPWPTL VTTFSYGVQC FSRYPDHMKQ HDFFKSAMPE GYVQERTIFF

101 KDDGNYKTRA EVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK

LEYNYNSHNV

151 YIMADKQKNG IKVNFKIRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD

GPVLLPDNHY

(13)

Lokasi penyisipan GFP

• _Daerah

bialophos/phosphinothric

in-resistance (BiPR)

dipotong dan disisipi

dengan gen GFP.

• _{Restriction Site :}

BlPI di ujung 5’

(14)

PCR

• _{Forward Primer}

5’-

GC TGAGC

ATG AGC AAA GGA GAA

G-3’

Length : 23 bp

GC Content : 52 %

Melting Temperatur : 57,1 °C

• _{Reverse Primer}

5’-

GC GCGCGC

TTT ATA GAG CTC AT-3’

Length : 22 bp

GC Content : 55 %

(15)

(16)

Modifikasi Gen Apoptin

PCR

Pembuatan Primer

forward

dan

reverse

Pemilihan Situs Restriksi pada vektor

GFP

(17)

Sekuens Gen Apoptin

Desain modifikasi gen Apoptin

5’

3’

5’

3’

(18)

1. Forward

primer

Desain forward primer yaitu

Dari data primer diatas, dapat di cari perkiraan berikut:

T

m

=

60°C

, sesuai dengan T

m

yang baik harus sama atau diatas

60°C

%GC

=

42,85%

, sesuai dengan kandungan GC dalam primer harus berada

diantara

40 -

60%

5’

3’

5’-

ATGAACGCTCTCCAAGAAGAT

-3’

(19)

1. Reverse primer

Desain reverse primer yaitu

3’-

GTCAGAATATGTGGAAGAACATT

-5’

Dari data primer diatas, dapat di cari perkiraan berikut:

T

m

=

80°C

, sesuai dengan T

m

yang baik harus diatas 60°C

%GC

=

42,6%

, sesuai dengan kandungan GC dalam primer harus berada diantara

40 -

60%

5’-

TTACAGTCTTATACACCTTCTTG

-3’

3’

5’

(20)

Hakikat dari amplifikasi dengan PCR adalah penggantian beberapa

enzim yang biasa terdapat dalam sel dengan pemanasan dan

pendinginan sampel. Amplifikasi PCR terdiri dari beberapa

rangkaian proses, yaitu:

a. Denaturasi: yaitu pemutusan ikatan hidrogen DNA pada suhu 95

o

C

b. Annealing: yaitu proses penempelan primer pada template DNA pada

suhu 55-60

o

C

c. Sintesis DNA: di mana Tag Polymerase melakukan sintesis pada DNA

yang baru dibentuk pada suhu 72

o

C

Hasil PCR

(21)

(22)

E. coli

Binary vector

Binary Vector

Menggunakan binary vector

(berisi region T-DNA) dan

Ti-plasmid (berisi gen virulensi) yang terpisah

Binary vector memiliki T-DNA yang berisi gene of interest, serta

penanda seleksi untuk bakteri & tanaman

(23)

(24)

Mengapa CaCl

₂

?

• _{Beberapa bakteri memiliki}

spesialisasi protein

membran untuk membawa

DNA ke dalam sel mereka

• _{Ca merangsang}

(25)

Sekarang plasmid berada di dalam, lalu tambahkan media Super Optimal broth with

Catabolite repression (SOC)

SOC media menutrisi Ecoli untuk tumbuh dan membelah

Plasmid juga akan membelah didalam Ecoli

Jika plasmid yang bereproduksi, mereka akan menyediakan sel Ecoli dengan resistensi

amp sehingga mereka dapat tumbuh di medium mengandung ampicilin

(26)

Proses Replikasi didalam E-coli

(27)

(28)

Dalam Triparental

Mating digunakan 3

macam bakteri yaitu:

Bakteri E. Coli yang

mengandung plasmid

pGreen II 0229

(mrngandung gen

apoptin yang telah di

tambahkan GFP)

Bakteri E.coli HB 101

yang mengandung

(29)

E. coli

yang

membawa

pGreen II 0229

ditumbuhkan

dalam media LB

padat yang

mengandung

antibiotik

kanamisin 50

mg/ kemudian

diinkubasi pada

suhu 37ºC

selama 16 jam

.

E. coli

yang

membawa

plasmid helper

ditumbuhkan

pada media LB

padat dengan

penambahan

antibiotik

kanamisin 50

mg/L

Bakteri A.

Tumefaciens

ditumbuhkan

dalam media LB

padat yang

mengandung

antibiotik 50

(30)

Setelah dilakukan

inkubasi, biakan

diambil satu gores

dan dilarutkan

didalam 1 ml media

LB cair. Biakan

dicampur di media

LB padat dengan

memasukkan 20 μl

secara berurutan

E.coli yang

membawa pGreen II

0229, E. coli yang

membawa helper

pRK 2013 dan A.

tumefaciens. Biakan

diinkubasi pada suhu

28ºC selama 32 jam.

Kemudian,

masing-masing biakan

diambil satu gores

dan dilarutkan

dalam medium LB

cair. Selanjutnya,

masing-masing

biakan dicampur

secara

berurutan:

E.coli

yan

g mengandung

pGreen II

0229,

E.coli

HB

101,

A. tumefaciens

.

Lalu, diinkubasi

selama 32 jam pada

suhu 28°C.

Untuk memastikan

perpindahan gen

apoptin ini, maka

biakan di ambil satu

gores lalu

diencerkan dan di

ambil sekitar 10 μl

dari hasil

pengenceran

(31)

(32)

(33)

Strategi

Introduksi ke Tanaman Tembakau

(Nicotiana tabacum L.)

Satu koloni

Agrobacterium tumifaciens

yang positif membawa

plasmid ekspresi rekombinan ditumbuhkan pada media, suhu

28ºC selama 48 jam.

Kultur bakteri disentrifus pada 4000 rpm selama 10 menit.

Pelet diresuspensikan dengan 10 ml larutan MS + vitamin B5

dan mengandung 200 µM asetosiringone lalu diinkubasi

(34)

Sumber eksplan tembakau yang digunakan adalah daun tembakau hasil

perbanyakan kultur in-vitro.

Daun yang dipakai untuk infeksi adalah daun ke-2 dan 3 dari pucuk. Lembaran

daun dipotong dengan ukuran 1 cm x 1 cm, dimasukkan ke dalam suspensi

Agrobacterium tumifaciens

lalu diinkubasikan pada kondisi tanpa cahaya (gelap), suhu 28°C, penggoyangan

dengan kecepatan 75 rpm selama 15 menit. Potongan daun dikeringkan

menggunakan tissue steril lalu ditanam pada media ko-kultivasi yang di atasnya

telah diberi kertas saring steril.

Inkubasi dilakukan di ruangan gelap pada suhu 28ºC selama 1 hari. Potongan daun

dicuci dengan larutan MS sebanyak 2 kali dan larutan MS+250 µg/ml cefotaksim

sebanyak 2 kali.

(35)

Mekanisme infeksi

Agrobacterium

ke dalam sel tanaman meliputi

tiga tahap, sebagai berikut (Day dan Lichtenstein, 1992).

Penempelan

Agrobacterium pada daun tanaman

Pengenalan

Agrobacterium

dengan molekul sinyal yang dihasilkan oleh sel

tanaman yang terluka, kemudian secara kemotaksis

Agrobacterium

bergerak dan menempel pada sel

tanaman.

Gen-gen vir pada plasmid Ti merespon

molekul sinyal yang dihasilkan oleh sel

tanaman dan selanjutnya menginduksi

ekspresi gen-gen vir untuk memotong rantai tunggal T-DNA

dan

memindahkannya ke dalam inti sel

tanaman.

T-DNA terintegrasi ke dalam genom

tanaman dan gen-gen pada T-DNA diekspresikan dalam

sel tanaman.

Ekspresi gen-gen onc (oncogen)

menyebabkan sel berproliferasi, sedangkan ekspresi

gen-gen opin bertanggungjawab untuk sintesis derivat

asam amino opin

Agrobacterium tumefaciens

(36)

(37)

Metode Seleksi

Gen penyeleksi

(38)

Apa itu GFP ?

Green (hijau)

fluorescent (sinar)

Protein

(protein)

(39)

(40)

(41)

Metode Seleksi

http://www.dnaftb.org/34/problem.html

(42)

Seleksi Kalus

Tahapan Seleksi Kalus dengan Metode Goerge dan Sherington

Kalus tembakau hasil transformasi dimultiplikasi pada medium MS ditambah NAA

kadar 0,3 mg/L dan BAP kadar 1 mg/L + kanamisin 100 ug/mL sebagai marker

seleksi.

Diamati persentase hidup eksplan, tinggi eksplan (mm), dan jumlah daun yang

ditampilkan dalam bentuk histogram untuk menunjukkan tingkat multiplikasi

eksplan.

(43)

(44)