PENGARUH EKSTRAK ETANOLIK BUAH LABU AIR (Lagenaria siceraria (Mol.) Standley) SEBAGAI IMUNOMODULATOR MELALUI
PENGAMATAN PROLIFERASI LIMFOSIT PADA TIKUS JANTAN Sprague Dawley YANG DIPEJANI DOKSORUBISIN
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Joseph Singgih Dwilaksono
098114077
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
2013
i
PENGARUH EKSTRAK ETANOLIK BUAH LABU AIR (Lagenaria siceraria (Mol.) Standley) SEBAGAI IMUNOMODULATOR MELALUI
PENGAMATAN PROLIFERASI LIMFOSIT PADA TIKUS JANTAN Sprague Dawley YANG DIPEJANI DOKSORUBISIN
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Joseph Singgih Dwilaksono
098114077
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
ii
iv
vi
HALAMAN PERSEMBAHAN
“Tuhan merangkai hidup, mungkin tidak seindah yang kau
bayangkan, tetapi tidak sesulit yang kita khawatirkan”
Sebuah karya kecil kupersembahkan kepada :
TUHAN YESUS KRISTUS sebagai wujud rasa syukurku.
Ibu Supriyati dan Bapak Margito , wujud sayang dan cintaku,
Kakakku
Rosalia Prita
dan
Bayu
Adikku, sebagai tanda sayangku,
vii PRAKATA
Puji syukur dan terima kasih penulis panjatkan kepada Sang Maha Kasih
Tuhan Yesus Kristus, atas segala berkat dan anugerah-Nya sehingga penulis dapat
menyelesaikan skripsi yang berjudul “Pengaruh Ekstrak Etanolik Buah Labu
Air (Lagenaria siceraria (Mol.) Standley) sebagai Imunomodulator Melalui Pengamatan Proliferasi Limfosit pada Tikus Jantan Sparague Dawley yang Dipejani Doksorubisin”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah ikut
membantu, memberikan dukungan, bimbingan, kritik, dan saran selama proses
penyelesaian skripsi ini. Dalam kesempatan ini, penulis hendak mengucapkan
terima kasih kepada :
1. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma.
2. Bapak Prof. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt. selaku Dosen Pembimbing dan Dosen
Penguji yang telah banyak memberi bimbingan, arahan, dan masukan dalam
penyusunan skripsi ini sehingga dapat menjadi lebih baik.
3. Ibu Agustina Setiawati, S. Farm., Apt., M.Sc. selaku Dosen Pembimbing dan
Dosen Penguji yang telah banyak memberi bimbingan, arahan, dan masukan
dalam penyusunan skripsi ini sehingga dapat menjadi lebih baik.
4. Ibu Yunita Linawati, M.Sc.Apt selaku Dosen Penguji yang telah memberikan
viii
5. Ibu Phebe Hendra, M. Si., Ph. D., Apt. selaku Dosen Penguji yang telah
memberikan masukan yang berarti terhadap skripsi ini.
6. Pimpinan dan staff LPPT UGM : Ibu Istini yang telah mengijinkan penulis
untuk melakukan penelitian serta membantu selama masa penelitian.
7. Bapak Heru, Bapak Parjiman, Bapak Kayat, Bapak Wagiran selaku laboran
laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Kampus III yang
telah banyak memberikan bantuan selama proses pelaksanaan penelitian.
8. Rekan-rekan tim skripsi, Vincentia Adelina H., Maria Larizza, Reza Eka
Putra atas segala kerjasama, bantuan dan dukungan dalam pengerjaan skripsi.
9. Sahabat-sahabatku Jati Panantya, Felix Pradana A. N., Johanes Baptista
Yunio R., atas motivasi, kebersamaan dan persahabatannya.
10. Seluruh dosen dan teman-teman FSM B 09, FST B 09 serta seluruh angkatan
2009 Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
11. Semua pihak yang penulis tidak dapat menyebutkan satu-persatu yang telah
ikut membantu selama penyusunan skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini jauh dari sempurna, oleh karena itu,
segala kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan demi
sempurnanya skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat dan memberi
informasi bagi pembaca.
Penulis
ix DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... ii
HALAMAN PENGESAHAN ... iii
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... iv
xi
E. Tata Cara Penelitian ... 19
1. Determinasi buah L. siceraria ... 19
2. Penetapan kadar air simplisia serbuk kering buah L. siceraria .... 19
3. Pembuatan ekstrak etanol buah L. siceraria ... 19
B.Perlakuan Ekstrak Etanol Buah Lagenaria siceraira dan Doksorubisin pada Hewan Uji ... 27
C.Pengujian Proliferasi Limfosit ... 28
D.Hasil Uji Efek Imunomodulator Ekstrak Etanol Buah L. siceraria dengan Kajian Proliferasi Limfosit ... 30
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ... 35
A.Kesimpulan ... 35
xii
DAFTAR PUSTAKA ... 36
LAMPIRAN ... 41
BIOGRAFI PENULIS ... 48
xiii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel I. Perlakuan Terhadap Hewan Uji ... 20
Tabel II. Purata OD + SD Proliferasi Limfosit Praperlakuan
Pemberian Ekstrak Etanol Buah Lagenaria siceraria ... 30
Tabel III. Hasil Analisis Uji Post-hoc Scheffe Proliferasi Limfosit
Setelah Praperlakuan Pemberian Ekstrak Etanol Buah
xiv DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Struktur Doksorubisin ... 6
Gambar 2. Buah Labu Air ... 14
Gambar 3. Diagram Batang Purata OD + SD Proliferasi Limfosit
Praperlakuan Pemberian Ekstrak Etanol Buah Lagenaria
siceraria ... 31
xv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Foto Ekstrak Buah L. siceraria dalam CMC Na 1% ... 41
Lampiran 2. Foto Buah L. siceraria ... 41
Lampiran 3. Komposisi Media Tumbuh Limfosit ... 42
Lampiran 4. Data Orientasi Proliferasi Limfosit tiap Kelompok Kontrol . 43
Lampiran 5. Data Rasio Proliferasi Limfosit Tahap Pengujian ... 43
Lampiran 6. Analisis Statistik Proliferasi Limfosit Pengaruh Ekstrak
Etanol Buah Labu Air (Lagenaria siceraria) pada
Berbagai Variasi Dosis Terhadap Imunosupresan
Doksorubisin ... 44
xvi INTISARI
Doksorubisin merupakan salah satu obat sitotoksik yang digunakan sebagai agen kemoterapi. Doksorubisin dapat menimbulkan efek merugikan yaitu supresi sumsum tulang belakang, sitotoksik pada sel hematopoietic sehingga dapat menurunkan jumlah sel limfosit yang merupakan sel penting dalam pertahanan imunitas tubuh. Oleh karena itu perlu dikembangkan agen ko-kemoterapi untuk mengurangi efek merugikan doksorubisin. Salah satu tanaman yang berpotensi sebagai ko-kemoterapi adalah buah Lagenaria siceraria yang bersifat sebagai imunomodulator. Tujuan penelitian adalah memperoleh informasi mengenai pengaruh pemberian ekstrak etanolik buah Lagenaria siceraria terhadap proliferasi sel limfosit tikus galur Sprague Dawley yang dipejani doksorubisin.
Sebanyak 25 ekor tikus Sprague Dawley dibagi menjadi 5 kelompok : Kelompok I sebagai kelompok kontrol pelarut. Kelompok II sebagai kelompok kontrol doksorubisin. Kelompok III diberikan doksorubisin dan ekstrak buah
Lagenaria siceraria dosis 1000 mg/kg BB secara p.o. Kelompok IV diberikan
doksorubisin dan ekstrak buah Lagenaria siceraria dosis 750 mg/kg BB secara p.o. Kelompok V diberikan doksorubisin dan ekstrak buah Lagenaria siceraria
dosis 500 mg/kg BB secara p.o. Perlakuan dilakukan selama 15 hari terus-menerus kemudian diamati proliferasi limfosit. Data dianalisis dengan uji one way
ANOVA taraf kepercayaan 95% yang dilanjutkan dengan uji Scheffe.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian ekstrak etanolik buah
Lagenaria siceraria berpengaruh terhadap proliferasi limfosit pada tikus galur
Sprague Dawley yang dipejani doksorubisin. Dosis pemberian ekstrak etanolik
buah L. sicearia yang paling efektif untuk meningkatkan proliferasi limfosit yaitu 500 mg/KgBB.
Kata kunci : Lagenaria siceraria, doksorubisin, imunomodulator, proliferasi limfosit
xvii ABSTRACT
Doxorubicin is a cytotoxic drug that is used as a chemotherapeutic agent. Doxorubicin has adverse effects such as suppression of bone marrow, cytotoxic to hematopoietic cells that could reduce the number of lymphocytes that are important cells in the immune defense. Therefore, it is necessary to develop co-chemotherapy agent to reduce adverse effects of doxorubicin, one of which is
Lagenaria siceraria fruit’s which can be as immunomodulators. The aim of this
research was to obtain information of the effect of ethanolic extract of Lagenaria
siceraria fruit’s on lymphocytes proliferation on Sprague Dawley rats induced
doksorubisin.
A total of 25 Sprague-Dawley rats were divided into 5 groups: Group I as a negative control group was given CMC Na 1%. Group II as a doxorubicin
lymphocyte proliferation. The data were analyzed by one-way ANOVA test with confidence level of 95%, followed by Scheffe's test.
The results showed that the ethanolic extract of Lagenaria sicerariafruit’s
has an effect on lymphocyte proliferation in Sprague-Dawley rats induced doksorubisin with effective dose 500 mg/Kg BW to increase lymphocyte proliferation.
1 BAB I PENGANTAR
A.Latar Belakang
Kanker merupakan suatu penyakit yang disebabkan oleh pertumbuhan
sel-sel jaringan secara cepat dan terus membelah diri, selanjutnya menyebar ke
jaringan sekitarnya (Mangan, 2009). Penyakit ini menjadi menjadi berbahaya
karena pertumbuhan yang tidak terkontrol sehingga membuat jaringan
disekitarnya tersebut rusak (Maria, 2008). Hal ini menyebabkan kanker dikenal
sebagai penyakit yang membahayakan, sehingga perlu mendapat perhatian khusus
dalam pencegahan maupun pengobatannya.
Terapi pengobatan kanker yang biasa dilakukan selama ini, yaitu dengan
cara pembedahan, radioterapi dan kemoterapi (sitostatika). Salah satu terapi yang
sering digunakan untuk pengobatan kanker adalah kemoterapi. Kemoterapi
merupakan suatu bentuk terapi kanker dengan menggunakan obat-obat sitotoksik
(Gruendemann dan Fernsebner, 2005). Banyak pilihan penggunaan obat sitotoksik
untuk kemoterapi. Doksorubisin merupakan salah satu obat sitotoksik yang sering
digunakan sebagai agen kemoterapi dalam pengobatan kanker. Saat ini
penggunaan doksorubisin mulai dibatasi karena menimbulkan efek yang
merugikan. Menurut Zhang, Li, Wu, dan Gao, (2005), doksorubisin dapat
menyebabkan supresi pada jumlah sel darah putih. Rendahnya sel darah putih
dapat menyebabkan penurunan sistem imun tubuh, hal ini disebabkan karena salah
satu dari komponen penyusun sel darah putih, yaitu limfosit yang berperan dalam
sistem pertahanan imun tubuh jumlahnya juga rendah. Limfosit dapat berikatan
dengan antigen dan menghasilkan respon imun berupa pengaktifan sel limfosit
tersebut untuk berproliferasi (Ronald dan Richard, 2004).
Alternatif baru yang dapat digunakan untuk mengatasi efek merugikan
doksorubisin tersebut yaitu penggunaan ko-kemoterapi dalam terapi pengobatan
kanker. Ko-kemoterapi merupakan kombinasi terapi kanker menggunakan
senyawa kemoprevensi yang bersifat tidak toksik dikombinasikan dengan agen
kemoterapi (Jenie dan Meiyanto, 2009). Dalam penelitian ini, ko-kemoterapi
bertujuan untuk mengurangi efek merugikan dari doksorubisin, sehingga tingkat
imunitas tubuh pasien yang sedang menjalani kemoterapi tetap baik.
Penelitian ini menggunakan ekstrak etanol buah labu air (L. siceraria)
sebagai agen ko-kemoterapi dari doksorubisin. Pemilihan buah labu air (L.
siceraria) sebagai agen ko-kemoterapiini didasarkan bahwa kandungan dari buah
ini mempunyai aktivitas sebagai imunomodulator (Gangwal, Panmar, Gupta,
Rana dan Sheth, 2008). Imunomodulator merupakan suatu senyawa yang dapat
memodulasi sistem imun dengan cara merangsang (imunostimulan) atau
sebaliknya dengan cara menekan sistem imun (imunosupresan).
Penelitian ini meneliti aktivitas imunomodulator dari buah L. siceraria
dengan mekanisme imunostimulan yang dilihat dari proliferasi limfosit setelah
dipejani doksorubisin. Proliferasi limfosit merupakan penanda adanya fase
aktivasi dari respon imun tubuh. Proliferasi limfosit ini ditunjukkan dengan
terjadinya peningkatan produksi limfoblas yang kemudian akan menjadi limfosit
3
mengetahui proliferasi limfosit yang digunakan sebagai parameter aktivitas
imunomodulatornya.
1. Perumusan masalah
a. Apakah ekstrak etanol buah L. siceraria berpengaruh terhadap proliferasi
limfosit pada tikus jantan galur Sprague Dawley yang dipejani
doksorubisin?
b. Berapakah dosis paling efektif dari ekstrak etanol buah L. siceraria yang
memberikan pengaruh terhadap proliferasi limfosit pada tikus jantan galur
Sprague Dawley yang dipejani doksorubisin?
2. Keaslian penelitian
Penelitian yang mirip adalah penelitian yang dilakukan oleh Deshpande,
Choudhari, Mishra, Meghre, Wadodkar dan Dorle (2008), dengan judul “Efek
Menguntungkan Buah Lagenaria siceraria ((Mol.) Standley) pada Hewan Uji”.
Perbedaan penelitian ini terletak pada larutan pengekstrak buah dan penginduksi
efek imunosupresan yang digunakan. Penelitian oleh Deshpande dkk. (2008)
menggunakan metanol sebagai larutan pengekstrak dan penginduksi efek
imunosupresan yang digunakan adalah pyrogallol, sedangkan penelitian ini
menggunakan etanol sebagai larutan pengekstrak dan penginduksi efek
imunosupresan yang digunakan adalah doksorubisin.
3. Manfaat penelitian
a. Manfaat praktis, memberikan informasi kepada masyarakat tentang
pengaruh ekstrak etanol buah L. siceraria sebagai agen ko-kemoterapi
dalam pengobatan kanker.
b. Manfaat teoritis, hasil penelitian ini diharapkan dapat menambah informasi
dalam bidang kefarmasian tentang pengujian ekstrak etanol buah L.
siceraria sebagai sebagai agen ko-kemoterapi dalam pengobatan kanker.
B.Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum
Tujuan umum penelitian ini adalah untuk menemukan alternatif agen
ko-kemoterapi yang aman digunakan dalam terapi kanker.
2. Tujuan khusus
a. Mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol buah L. siceraria terhadap
proliferasi sel limfosit pada tikus galur Sprague Dawley yang dipejani
doksorubisin.
b. Mengetahui dosis paling efektif ekstrak etanol buah L. siceraria yang
memberikan pengaruh terhadap proliferasi limfosit pada tikus jantan galur
5 BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A.Kanker
Kanker adalah suatu penyakit yang ditandai dengan adanya sel tubuh
yang tumbuh secara tidak terkendali sehingga menyerang jaringan di sekitarnya.
Penyebab kanker tidak dapat dirumuskan secara pasti, karena biasanya penyebab
kanker merupakan gabungan dari berbagai faktor. Beberapa faktor risiko pemicu
kanker adalah faktor genetis (keturunan) dan faktor lingkungan. Sebagian besar
pemicu kanker pada manusia merupakan hasil dari interaksi antara faktor
lingkungan hidup dan lingkungan kerja. Contoh penyebab kanker adalah :
1) Karsinogen kimia, seperti nikotin dan tar dari rokok, zat pengawet, pewarna
makanan, nitrosamine, asbes, merkuri dan alkohol
2) Karsinogen fisika, seperti sinar X, sinar ultraviolet, dan radiasi dari bom atom,
3) Karsinogen biologi, seperti infeksi virus (papilloma dan herpes yang
merupakan salah satu faktor risiko kanker serviks) dan jamur (misalnya jamur
Aspergillus flavus yang merupakan salah satu penyebab kanker hati)
(Wijayakusuma, 2008).
Sel-sel kanker tumbuh melewati dinding pembuluh darah dan limfe,
kemudian terlepas dan memaksa masuk ke tempat-tempat lain dalam tubuh dan
sel-sel tersebut dapat bersarang dan tumbuh. Sel kanker tumbuh dan masuk ke
dalam jaringan sehat di sekitarnya dan menghancurkannya, menyebar lewat
pembuluh limfe dan darah ke tempat-tempat lain (Jong, 2004).
Proses terjadinya kanker berlangsung secara bertahap dan dalam waktu
yang cukup lama. Sel-sel kanker dapat timbul di setiap tempat pada tubuh, pada
setiap waktu. Proses terjadinya kanker ini disebabkan oleh beberapa faktor, antara
lain faktor lingkungan, kimia, fisika, radiasi, ionisasi, dan virus. Penyebab lain
datang dari dalam tubuh (faktor endogen) misalnya karena terganggu sistem
imunologi, genetik, hormon, dan asam glutamat (Haryanto, 2009). Salah satu sifat
yang dimiliki oleh sel kanker adalah kemampuan untuk metastasis. Metastasis
merupakan proses invasi tumor pada sistem limfatik, pembuluh darah, atau rongga
tubuh yang diikuti oleh transportasi dan pertumbuhan massa sel tumor sekunder
yang tidak berhubungan dengan tumor primer (Robbins dan Cotran, 2008).
B.Doksorubisin
Gambar 1. Struktur Doksorubisin (Long, Hai dan Xian, 2005).
Doksorubisin (Gambar 1) merupakan salah satu obat golongan antibiotik
antrasiklin yang digunakan untuk kemoterapi. Menurut Stepankova, Malina,
Kasparkova, Brabec (2010), senyawa ini bersifat sitotoksik dengan mekanisme
berinteraksi dengan DNA dan berinterkalasi non kovalen antara pasangan basa,
7
mengenai mekanisme kerja doksorubisin telah dilakukan. Antibiotik antrasiklin
seperti doksorubisin memiliki mekanisme aksi sitotoksik melalui empat
mekanisme, yaitu sebagai berikut :
1. Penghambatan topoisomerase II,
2. pengikatan membran sel yang menyebabkan aliran dan transport ion,
3. interkalasi DNA sehingga mengakibatkan penghambatan sintesis DNA dan
RNA,
4. pembentukan radikal bebas semiquinon dan radikal bebas oksigen melalui
proses yang tergantung besi dan proses reduktif yang diperantarai enzim.
Mekanisme radikal bebas ini telah diketahui bertanggung jawab pada
kardiotoksisitas akibat antibiotik antrasiklin (Bruton, Lazo dan Parker, 2005).
Penelitian Zhang dkk. (2005) menunjukkan bahwa doksorubisin dapat
mengakibatkan myocardial oxidative stress, mengurangi aktivitas lactate
dehydrogenase dan creatine kinase pada hati. Doksorubisin juga menyebabkan
penurunan interleukin-2 (IL-2) dan produksi interferon-γ (IFN-γ), sel sitotoksik
natural killer (NK), proliferasi limfosit serta ratio limfosit T CD4+/CD8+.
C.Kemoterapi dan Kemoterapi Kombinasi
Kemoterapi adalah suatu bentuk terapi kanker yang mengalami kemajuan
cepat dan aplikasi baru. Bahan-bahan kemoterapi adalah obat sitotoksik yang
bekerja dalam berbagai cara pada sel-sel spesifik selama berbagai fase siklus
kehidupan sel. Kemoterapi hampir tidak pernah dilakukan bersama dengan terapi
pembedahan (Gruendemann dan Fernsebner, 2005).
Dalam kemoterapi digunakan suatu obat yang merusak sel kanker. Obat
antikanker dapat dibedakan menjadi dua yaitu obat konvensional dan obat dengan
target molekuler yang spesifik. Obat konvensional yang dimaksud adalah
obat-obat sitostatika (agen kemoterapi) seperti taxol, bleomycin, doksorubisin,
5-flurourasil, klorambusil, tiotepa, alkaloid indol seperti vinblastin, dan vinkristin.
Obat sitostatika bekerja dengan mempengaruhi metabolisme asam nukleat
terutama DNA atau biosintesis protein. Hal inilah yang menyebabkan obat
sitostatika bekerja tidak selektif karena bersifat toksik baik pada sel kanker
maupun sel normal, terutama sel normal yang kecepatan proliferasinya tinggi
seperti pada sumsum tulang belakang (Siswandono dan Soekardjo, 2000).
Penatalaksanaan efek samping kemoterapi merupakan bagian penting dari
pengobatan dan perawatan pendukung pada penyakit kanker. Walaupun efek
samping bisa terjadi mengikuti pemberian obat apa pun, efek samping setelah
pemberian kemoterapi sitotoksik efek ini hampir selalu cukup menggangu. Hal ini
diakibatkan efek non-spesifik dari obat-obat sitotoksik yang menghambat tidah
hanya sel-sel tumor melainkan juga sel-sel normal. Konsekuensinya, efek samping
paling sering dapat dilihat pada jaringan dengan aktivitas proliferatif yang tinggi,
misalnya sumsum tulang, epitel traktus gastrointestinalis, folikel rambut
(Widjanarko, 2002).
Ko-kemoterapi adalah kombinasi antara agen kemopreventif dengan agen
kemoterapi agar menghasilkan efek yang lebih baik dibandingkan dengan agen
kemoterapi saja. Perubahan-perubahan genetik dan ekspresi protein yang semakin
9
agen kemoprevensi kanker. Agen ini diharapkan dapat menghambat
karsinogenesis dan dapat memacu kematian sel kanker. Kemoprevensi merupakan
suatu usaha menggunakan bahan alam, sintetik, atau biologis, bahan kimia untuk
membalikkan, menekan, atau mencegah perkembangan karsinogenik penyakit
kanker. Keberhasilan beberapa uji klinis dalam mencegah kanker pada populasi
menunjukkan kemoprevensi merupakan strategi yang rasional (Tsao, Kim dan
Hong, 2004).
D.Imunomodulator
Imunomodulator adalah zat alami atau sintetis yang membantu mengatur
atau menormalkan sistem kekebalan tubuh. Imunomodulator mengoreksi sistem
kekebalan tubuh yang berada di luar keseimbangan. Imunomodulator alami
cenderung menyebabkan efek samping yang kecil. Imunomodulator dapat
merangsang mekanisme pertahanan alami dan adaptif, seperti sitokin (Patil,
Jaydeokar dan Bandawane, 2012).
Menurut Anonim (2011), senyawa yang memiliki sifat imunomodulator
haruslah memenuhi persyaratan berikut :
(1) Secara kimiawi murni atau dapat didefinisikan secara kimia,
(2) secara biologik dapat diuraikan dengan cepat,
(3) tidak bersifat kanserogenik atau ko-kanserogenik, dan
(4) baik secara akut maupun kronis tidak toksik dan tidak mempunyai efek
samping farmakologik yang merugikan.
Imunomodulator adalah substansi atau obat yang dapat memodulasi
fungsi dan aktivitas sistem imun. Imunomodulator dibagi menjadi tiga kelompok :
1. Imunostimulator ditujukan untuk perbaikan fungsi imun pada kondisi-kondisi
imunosupresi. Imunostimulan merupakan agen yang dipertimbangkan untuk
meningkatkan ketahanan tubuh terhadap infeksi dan meningkatkan tingkat
respon imun (Patil dkk., 2012).
2. Imunoregulator, artinya dapat meregulasi sistem imun.
3. Imunosupresor yang dapat menghambat atau menekan aktivitas sistem imun.
dan digunakan untuk mengontrol respon imun patologis pada penyakit
autoimun, (Patil dkk., 2012). Efek terhadap sistem imun berupa perubahan
jalur sel sistem imun yang sementara dan efek yang lebih persisten terhadap
fungsi sel individual tergantung dari golongan imunosupresan (Baratawidjaja
dan Rengganis, 2010).
Kebanyakan tanaman obat yang telah diteliti membuktikan adanya kerja
imunostimulator, sedangkan untuk imunosupresor masih jarang dijumpai.
Pemakaian tanaman obat sebagai imunostimulator dengan maksud menekan atau
mengurangi infeksi virus dan bakteri intraseluler, untuk mengatasi
imunodefisiensi atau sebagai perangsang tumbuhnya sel pertahanan tubuh dalam
sistem imunitas (Block dan Mead, 2003).
E.Limfosit
Limfosit merupakan salah satu bagian dari sel darah putih yang bersifat
agranulosit. Secara umum ukuran dan penampilan limfosit bervariasi, serta
memiliki inti sel yang relatif lebih besar yang dikelilingi oleh sejumlah
11
umumnya banyak terdapat pada pembuluh darah dan organ limfoid, seperti limfa,
kelenjar limfe, dan timus (Kimball, 1990).
Limfosit merupakan leukosit kedua terbanyak di darah perifer. Sel-sel ini
merupakan komponen esensial pada sistem pertahanan imun. Fungsi utamanya
adalah berinteraksi dengan antigen dan menimbulkan respons imun. Respon imun
ini mungkin terjadinsebagai berikut :
(1) Humoral, dalam bentuk produksi antibodi,
(2) seluler, diserati pengeluaran berbagai limfokin oleh limfosit,
(3) sitotoksik, disertai pembentukan limfosit pembunuh sitotoksik.
Terdapat dua subtipe utama, limfosit-T dan limfosit-B, yang
masing-masing melakukan fungsi imunologik tersendiri. Limfosit-T berperan dalam
imunitas selular dan memodulasi responsivitas imun. Limfosit-B terutama
bertanggung jawab untuk imunitas humoral dan pembentuk antibodi (Ronald dan
Richard, 2004).
Jumlah limfosit dalam tubuh berkisar 20-25% dari jumlah leukosit total,
limfosit memiliki nukleus besar bulat dengan menempati sebagian besar sel
limfosit berkembang dalam jaringan limfe (Handayani, 2008). Konsentrasi
limfosit yang tinggi ditemukan di kelenjar getah bening, limpa, dam mukosa
saluran napas dan cerna, sedangkan secara difusi sel-sel ini ditemukan di sumsum
tulang, hati, kulit, dan jaringan yang mengalami peradangan kronis (Ronald dan
Richard, 2004). Melihat hal tersebut, limfosit merupakan salah satu sel kekebalan
tubuh yang penting yang memainkan peran penting dalam mekanisme pertahanan
tubuh. Menurut Mashitoh (2007), ketika mempertimbangkan efek samping
kemoterapi, sangat penting untuk memverifikasi apakah obat menunjukkan efek
berbahaya terhadap sel-sel normal khususnya dalam berkembangnya limfosit.
Kemampuan obat yang memberikan efek samping toksis dapat
mempengaruhi keberlangsungan hidup sel limfosit yang berdampak pada sistem
kekebalan tubuh. Proliferasi limfosit dapat diinduksi oleh adanya mitogen
Mitogen adalah agen yang mampu menginduksi pembelahan sel, baik sel B
maupun sel T dalam persentase yang tinggi. Sel limfosit B dan T mampu
berproliferasi seiring stimulasi mitogen ke dalam kultur sel. Ada beberapa
mitogen yang berasal dari produk alami telah diakui untuk merangsang proliferasi
limfosit alami yang berguna dalam meningkatkan sistem kekebalan tubuh (Harris,
1991).
Proliferasi limfosit merupakan suatu peningkatan produksi limfoblas
yang kemudian menjadi limfosit di limpa dapat dilihat dengan adanya pembesaran
organ-organ limfoid. Limpa merupakan salah satu organ limfoid perifer
(Khasanah, 2009). Proliferasi limfosit yang distimulir antigen secara normal
terjadi dalam jaringan limfoid. Kemampuan sel limfoid untuk berkembang biak
ketika dikultur dengan mitogen tertentu merupakan parameter untuk menilai
fungsi sel T dan sel B secara in vitro (Winarsi, 2010).
Aktivitas proliferasi yang ditunjukkan limfosit sangat mempengaruhi
tingkat imunitas tubuh. Menurut Meydani, Wu, Santos, Hoyek (1995), proliferasi
sel limfosit berawal dari kontak antara membran sel dengan sutu antigen atau
dengan aktivator lain. Membran sel harus dalam keadaan utuh untuk dapat
13
imuitas tubuh karena dapat menghasilkan sel efektor atau imunokompeten. Sel
limfosit termasuk sel tunggal yang bertahan baik saat dikulturkan pada media
sederhana dan secara konsisten tetap dalam tahap diam dan tidak membelah
sampai ditambah mitogen ke dalamnya (Ramadhani, 2009).
F. Labu Air 1. Sinonim
Curcubita hispida sensu Thunb. (sensu strico), Curcubita idolatrica
Willd, Curcubita siceraria Molina (Lim, 2012).
2. Nama Lain :
a. India : Sorakaya
b. Indonesia : Labu Air
c. Jepang : Hyoutan
d. Inggris : Bottle Gourd (Lim, 2012).
3. Klasifikasi taksonomi:
Kingdom : Plantae
Division : Magnoliophyta
Class : Magnoliopsida
Order : Cucurbitales
Family : Cucurbitaceae
Genus : Lagenaria
Species : Lagenaria siceraria (Mol.) Standley (Lim, 2012).
4. Morfologi
Buah labu air (Gambar 2) termasuk ke dalam varietas labu bertekstur
keras. Bentuk buahnya bervariasi, mulai dari membulat hingga lonjong
memanjang. Warna kulitnya kehijauan dengan daging buah berwarna putih.
Tanaman ini diketahui mudah beradaptasi dengan kondisi cuaca, baik di musim
penghujan ataupun kemarau (Lim, 2012).
5. Kandungan dan khasiat
Deore dkk. (2009) memaparkan bahwa hasil skrining fitokimia ekstrak
etanol buah Lagenaria siceraria memiliki kandungan flavonoid, glikosida
saponin, dan senyawa fenolik. Menurut Gangwal dkk. (2008) ekstrak methanol
fraksi n-butanol dan etil asetat buah labu air (Lagenaria siceraria) memiliki
aktifitas imunomodulator karena dapat meningkatkan jumlah antibodi primer dan
sekunder serta mampu menghambat reaksi hipersensitivitas pada tikus. Senyawa
yang dapat diisolasi ekstrak metanol fraksi n-butanol dan etil asetat buah L.
siceraria diidentifikasi merupakan asam oleanolat, campuran ß-sitosterol dan
kempesterol, isokuersetin, kampeferol (Shah, Seth dan Desai, 2010).
15
G.Landasan Teori
Salah satu pengobatan kanker dapat dilakukan dengan kemoterapi
menggunakan obat-obat sitostatika, contohnya doksorubisin. Penggunaan
doksorubisin mempunyai efek merugikan, salah satunya adalah penurunan jumlah
sel darah putih sehingga sel limfosit juga menurun jumlahnya. Imunitas tubuh
meningkat seiring dengan peningkatan jumlah limfosit, hal ini dikarenakan sel
limfosit merupakan sel yang berperan dalam respon imun. Oleh karena itu, perlu
dikembangkan agen ko-kemoterapi untuk mengurangi efek merugikan
doksorubisin tersebut.
Buah L. siceraria digunakan sebagai alternatif agen ko-kemoterapi
karena mempunyai aktivitas imunomodulator. Kandungan flavonoid pada ekstrak
etanol buah L. Siceraria ini dapat meningkatkan proliferasi limfosit, sehingga
ekstrak etanol buah L. siceraria berpotensi untuk dikembangkan sebagai agen
ko-kemoterapi.
Penelitian ini bertujuan untuk mengamati pengaruh pemberian ekstrak
etanol buah Lagenaria siceraria terhadap efek merugikan doksorubisin pada tikus
Sprague Dawley yang dilihat dari aktivitas proliferasi limfosit untuk mengetahui
efek imunomodulatornya.
H.Hipotesis
Ekstrak etanol buah labu air (Lagenaria siceraria) dapat meningkatkan
proliferasi limfosit pada tikus galur Sprague Dawley yang dipejani doksorubisin.
16 BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental murni, yaitu
penelitian dengan melakukan percobaan terhadap kelompok perlakuan dan
dibandingkan dengan kelompok kontrol yang tidak dikenai perlakuan. Rancangan
penelitian yang digunakan adalah rancangan penelitian acak pola searah, yaitu
cara menetapkan sampel dalam kelompok perlakuan dan kelompok kontrol
dengan pengacakan agar setiap sampel punya kesempatan yang sama untuk dapat
masuk ke dalam kelompok perlakuan maupun kelompok kontrol. Pola searah
ditunjukkan dengan adanya perlakuan yang sama pada kelompok perlakuan, yaitu
pemberian ekstrak etanol buah L. siceraria.
B.Variabel dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian
a. Variabel utama
1) Variabel bebas : dosis ekstrak etanol buah L. siceraria.
2) Variabel tergantung : proliferasi sel limfosit.
b. Variabel pengacau
1) Variabel pengacau terkendali : jenis kelamin, galur tikus, umur tikus,
berat badan tikus, jenis makanan
2) Variabel pengacau tak terkendali : kondisi fisiologis tikus, asal buah L.
17
2. Definisi operasional
a. Ekstrak etanol buah L. siceraria, merupakan hasil maserasi serbuk kering
buah L. siceraria sebanyak tiga kali, ekstrak disaring dan kemudian pelarut
diuapkan dengan rotary evaporator hingga didapat ekstrak kental.
b. Efek imunomodulator buah L. siceraria, merupakan kemampuan buah L.
siceraria untuk mengembalikan sistem imun tikus Sprague Dawley yang
dipejani doksorubisin menuju keadaan normal yang dilihat dari proliferasi
sel limfosit.
C.Bahan Penelitian 1. Bahan utama
Bahan uji yang digunakan, yaitu buah Labu Air (L. siceraria) yang
didapatkan dari Pasar Beringharjo Yogyakarta.
2. Hewanuji
Tikus jantan galur Sprague Dawley dengan rentang berat badan 200-300
gram dan umur 2-3 bulan yang diperoleh dari Laboratorium Imono Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
3. Bahan uji jumlah sel limfosit
Akuades, akuabides, klorofom, Roswell Park Memorial Institute Medium
(RPMI 1640) (Sigma), metanol, alkohol 70%, Phosphate Buffer Saline (PBS)
steril, medium komplit yang terdiri dari RPMI 1640, Fetal Bovine Serum (FBS)
(Gibco) 10%, Penisilin-Streptomisin 2% (Gibco) dan fungizon 1% (Gibco).
D.Alat Penelitian 1. Alat pembuatan serbuk buah L. siceraria
Seperangkat alat gelas, yaitu beaker glass, gelas ukur, cawan porselen,
batang pengaduk, mesin penyerbuk, dan timbangan analitik.
2. Alatuntuk ekstraksi bahan
Seperangkat alat gelas, blender, cawan porselen, mikropipet, mortir,
stamper, pengayak tepung, oven, gelas ukur, beaker glass, vaccum filter, vaccum
rotary evaporator.
3. Alat untuk perlakuan hewan uji
Peralatan bedah tikus (pisau, gunting, pinset), sarung tangan disposable,
syringe, cawan petri, tabung sentrifuse, pipet tetes, pipet volumetrik, alat
sentrifuse, gelas penutup, microwell plate, mikropipet.
4. Alat untuk penetapan jumlah limfosit
Inkubator CO2 5%; 37oC (Heraeus), plate 96 well (Nunc), sentrifus
eppendorf (Sorfall MC 12 V, Dupont), Effendorf tube, Laminar Air Flow
(Labquib), hemasitometer (Nebaeur), mikropipet (Eppendorf), neraca elektronik
(Sartorius), filter 0,22 μm (Sartorius), tabung sentrifus 15 mL (Nunc), spuit injeksi
10 mL (Terumo), mesin Vortex, yellow dan blue tip, Inverted Microscope
(Olympus), mikroskop binokuler, lampu spiritus, pinset, gunting, tabung reaksi,
19
E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi buah L. siceraria
Determinasi sampel buah L. siceraria yang digunakan berdasarkan
pengamatan ciri morfologinya yang dibandingkan dengan literatur.
2. Penetapan kadar air simplisia serbuk kering buah L. siceraria
Penetapan kadar air dilakukan termopan, yaitu dengan menguji jumlah
air yang menguap dari simplisia serbuk buah L. siceraria. Alat yang digunakan
pada uji ini adalah Moisture Balance yang terdapat di Laboratorium Kimia
Analisis, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma.
Pengujian dilakukan dengan cara memasukkan 5 gram sampel dan
menimbang bobot simplisia sebagai bobot sebelum pemanasan (bobot a).
Kemudian alat dipanaskan pada suhu 1100C selama 15 menit, dan setelah
menimbang bobot simplisia setelah pemanasan (bobot b). Selisih bobot a dan b
merupakan kadar air dari simplisia yang diselidiki.
3. Pembuatan ekstrak etanol buah L. siceraria
Buah labu air yang didapat dari pasar Beringharjo Yogyakarta
dibersihkan dengan cara dicuci dengan air mengalir, dikupas kulitnya, dipotong
kecil – kecil, dibuang bijinya kemudian diblender dan dimaserasi menggunakan
pelarut etanol. Maserasi diulangi sebanyak tiga kali. Maserasi yang pertama
dilakukan selama 2 x 24 jam, kemudian disaring dengan penyaring Buchner
sehingga diperoleh filtrat dan ampas. Ampas dimaserasi lagi selama 1 x 24 jam.
Ampas yang didapat dimaserasi kembali selama 1 x 24 jam. Kemudian pelarut
diuapkan dengan rotary evaporator hingga tidak ada pelarut yang menetes lagi.
4. Pembuatan sediaan ekstrak etanol buah L. siceraria 15%
Ekstrak etanol buah L. siceraria dibuat suspensi dengan melarutkan 15
gram ekstrak dalam 100 mL CMC Na sehingga didapatkan konsentrasi 15% b/v.
5. Penyiapan dan perlakuan hewan uji
Hewan uji yang digunakan ditempatkan dalam kandang selama 1 minggu
untuk adaptasi. Dua puluh lima ekor tikus yang telah diadaptasikan dibagi secara
acak dalam 5 kelompok. Kelompok I diberikan CMC-Na 1%. Kelompok II
diberikan doksorubisin dosis 4,5 mg/kg BB. Kelompok III diberikan doksorubisin
dosis 4,5 mg/kg BB secara intraperitonial dan ekstrak dosis 1000 mg/kg BB
secara p.o. Kelompok IV diberikan doksorubisin dosis 4,5 mg/kg BB secara
intraperitonial dan ekstrak dosis 750 mg/kg BB secara p.o. Kelompok V diberikan
doksorubisin dosis 4,5 mg/kg BB secara intraperitonial dan ekstrak dosis 500
mg/kg BB secara p.o. Ekstrak diberikan terlebih dahulu selama 10 hari, kemudian
dipejani doksorubisin pada hari ke-11, 13, 15. Isolasi limpa dilakukan pada hari
ke-19.
Tabel 1. Perlakuan terhadap Hewan Uji
Pelarut ekstrak (CMC Na 1%) p.o EELA 1000 mg/kg p.o
EELA 750 mg/kg p.o EELA 500 mg/kg p.o
Pelarut doksorubisin (NaCl fisiologis) Doksorubisin i.p
Pengambilan organ limpa
21
6. Isolasi organ limpa tikus
Tikus dikorbankan dengan dibius terlebih dahulu menggunakan
kloroform, kemudian tikus diletakkan terlentang. Kulit perut dan selubung
peritoneum dibuka. Organ limpa diambil dan dibersihkan dari lemak yang melekat
kemudian diletakkan pada cawan petri dan diberi 1 mL RPMI.
7. Pengujian jumlah limfosit
Organ limpa kemudian disuntik dengan RPMI, sambil ditekan
menggunakan pinset sehingga didapatkan suspensi sel. Suspensi sel tersebut
kemudian dimasukkan dalam tabung sentrifuge. Suspensi sel disentrifugasi 1500
rpm selama 10 menit untuk diambil peletnya. Pelet yang didapat ditambahkan 1
mL ammonium klorida kemudian diaduk. Pelet dicuci dengan cara menambahkan
RPMI hingga 12 mL kemudian dilakukan sentrifugasi 3000 rpm selama 5 menit.
Supernatan yang didapatkan kemudian dibuang dan pelet yang didapatkan
ditambahkan 2 mL medium komplit. Sebanyak 930 µL RPMI dimasukkan dalam
tabung eppendorf, kemudian ditambahkan suspensi sel dengan pengenceran 50
kali yang sebelumnya sudah divortex. Sebanyak 50 µL Triphan Blue ditambahkan
kemudian divortex, dan suspensi sel dibaca dengan alat Haemocytometer.
Selanjutnya dibuat suspensi sel dengan kepadatan 2x107 sel/mL.
Dimasukkan sebanyak 20 µL suspensi sel tersebut ke dalam sumuran yang
sebelumnya sudah ditambahkan RPMI. Sebagai pembanding yaitu suspensi sel
dalam plate yang diberikan PHA. Masing-masing suspensi sel dalam plate
diinkubasi selama 72 jam dalam inkubator CO2 dengan suhu 370 C dengan CO2
5% (Miksusanti, 2010). Metode yang digunakan adalah MTT assay. Setelah
diinkubasi selama 72 jam, ditambahkan dengan MTT {(4,5-Dimethylthiazol-2-yl
)-2,5-Diphenyl-tetrazoilium-Bromide} ke dalam semua sumuran dalam plate. Plate
kemudian diinkubasi selama 4 jam dan tiap sumuran ditambah dengan larutan
SDS 10% dan dilakukan pengukuran menggunakan ELISA reader.
8. Perhitungan statistik
Data yang diperoleh dievaluasi secara statistik dengan melakukan uji
normalitas dengan metode Kolmogorov-Smirnov. Data yang terdistribusi normal
(p>0,05) dilanjutkan dengan uji one way ANOVA dengan taraf kepercayaan 95%,
kemudian jika data terdapat perbedaan yang bermakna dilanjutkan dengan uji
23 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh pemberian
ekstrak etanol buah L. siceraria terhadap proliferasi sel limfosit, serta untuk
mengetahui dosis paling efektif dari ekstrak etanol buah L. siceraria yang
berpengaruh terhadap peningkatan proliferasi sel limfosit. Proliferasi limfosit
dapat dilihat dari Optical Density (OD) yang dihasilkan pada pengukuran
menggunakan ELISA reader. Data proliferasi limfosit yang diperoleh dianalisis
secara statistik menggunakan uji Kolmogorov-Smirnov untuk mengetahui
normalitas data, selanjutnya dilakukan analisis one way ANOVA dengan taraf
kepercayaan 95%, jika ada perbedaan yang bermakna kemudian dilanjutkan
dengan uji Scheffe untuk mengetahui signifikansi antar kelompok.
A.Penyiapan Bahan Uji 1. Determinasi tanaman
Tanaman yang digunakan untuk penelitian ini adalah labu air (Lagenaria
siceraria) dan bagian tanaman yang digunakan adalah bagian daging dan biji
buah. Sebelum dilakukan penelitian lebih lanjut, dilakukan determinasi bagian
tanaman tersebut untuk memastikan bagian tanaman yang digunakan untuk
penelitian sudah tepat dan tidak terjadi kesalahan dalam penggunakan bahan uji.
Determinasi dilakukan dengan cara mencocokkan ciri-ciri buah L.
siceraria dengan literatur. Menurut literatur “Edible Medicinal and
Non-Medicinal Plants (Fruits), Volume 2”, buah L. siceraria berbentuk memanjang
sampai dengan 1 meter, warna putih kehijauan ketika muda, daging buah tahan
lama, memiliki biji berbentuk lonjong dan pipih berukuran hingga 2 cm. Dari
hasil determinasi menunjukkan bahwa buah Lagenaria siceraria yang digunakan
dalam penelitian memiliki kesamaan ciri-ciri dengan yang ditunjukkan literatur,
sehingga dapat disimpulkan bahwa buah yang digunakan memang benar
merupakan buah Lagenaria siceraria.
2. Penetapan kadar air serbuk kering buah L. siceraria
Pengujian penetapan kadar air bertujuan untuk memastikan bahwa serbuk
kering yang digunakan memiliki kandungan air sesuai persyaratan serbuk
simplisia yang baik. Menurut Direktorat Jenderal Pengawas Obat dan Makanan
(1995), persyaratan kadar air dalam serbuk simplisia yang baik adalah kurang dari
10%. Penetapan kadar air serbuk kering buah L. siceraria dilakukan dengan
menghitung susut penguapan alat Moisture Balance yang terdapat di
Laboratorium Kimia Analisis Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta. Kadar air yang melebihi 10% dapat memicu pertumbuhan mikroba,
reaksi enzimatis atau proses hidrolisis yang menyebabkan rusaknya kandungan
senyawa aktif dalam serbuk buah L. siceraria.
Penetapan kadar air dilakukan dengan cara memanaskan serbuk pada
suhu 1100C selama 15 menit. Hal tersebut dimaksudkan agar kandungan air dalam
serbuk menguap dalam waktu tersebut. Hasil pengujian didapatkan bahwa
kandungan air dari serbuk kering buah L. siceraria sebesar 7,86%. Hasil
pengujian ini menunjukkan bahwa serbuk kering buah L. siceraria telah
25
3. Pembuatan ekstrak etanol buah L. siceraria
Kandungan air dalam buah L. siceraria cukup tinggi, sehingga dilakukan
pengeringan menggunakan oven untuk menghilangkan kandungan air, hal ini
bertujuan agar potongan buah labu air tersebut mudah untuk dibuat menjadi
serbuk dan tetap awet (tidak menjadi media tumbuh mikroba), karena dengan
adanya kandungan air dapat memicu pertumbuh mikroba, sehingga menyebabkan
buah labu air busuk dan kandungan senyawa aktif didalamnya juga rusak. Jika
kandungan senyawa aktif rusak maka efek farmakologis yang ditimbulkan
menjadi bias.
Maserasi merupakan salah satu metode ekstraksi dengan cara merendam
serbuk dengan pelarut yang sesuai pada suhu ruangan sehingga senyawa yang
tidak tahan panas tidak rusak (Koirewoa, Fatimawali dan Wiyono, 2012). Menurut
Deshpande dkk. (2008), ekstrak etanol buah L. siceraria menunjukkan aktivitas
sebagai imunomodulator melalui pengamatan respon imun humoral dan seluler,
sehingga pada penelitian ini digunakan pelarut etanol untuk membuktikan
aktivitas senyawa pada buah L. siceraria sebagai imunomodulator melalui
pengamatan proliferasi limfosit. Hasil skrining fitokimia ekstrak etanol buah
Lagenaria siceraria memiliki kandungan flavonoid, glikosida saponin, dan
senyawa fenolik (Deore dkk., 2009). Flavonoid dan senyawa-senyawa fenolik
mudah teroksidasi pada suhu tinggi sehingga maserasi merupakan metode yang
tepat dalam ekstraksi ekstraksi untuk mencegah oksidasi dari flavonoid (Koirewoa
dkk., 2012). Serbuk yang digunakan untuk proses maserasi sebanyak 10 g dan
diberi pelarut etanol 80% sebanyak 100 mL. Maserasi menggunakan etanol
dengan konsentrasi 80% karena pada konsentrasi tersebut dapat menyari senyawa
aktif dalam buah L. siceraria yaitu flavonoid, glikosida saponin dan
senyawa-senyawa fenolik. Etanol bisa digunakan untuk menyari zat dengan kepolaran
relatif tinggi sampai relatif rendah karena etanol merupakan pelarut yang
universal (Voigt, 1984). Flavonoid merupakan senyawa aktif dari buah L.
siceraria yang diteliti aktivitasnya sebagai imunomodulator. Maserasi dilakukan
berulang sebanyak 3 kali masing-masing adalah selama 24 jam, hal ini bertujuan
untuk menjamin senyawa aktif dapat tersari secara sempurna.
4. Pembuatan sediaan ekstrak etanol buah L. siceraria
Sediaan ini dibuat dengan cara menambahkan 15 gram ekstrak kental
buah labu air dengan 100 mL CMC Na 1% sehingga didapatkan suspensi ekstrak
konsentrasi 15%. Konsentrasi ekstrak etanol buah L. siceraria tersebut ditentukan
berdasarkan konsentrasi terpekat yang masih menunjukkan ekstrak kental labu air
dapat terdispersi dalam CMC Na dan dapat diinjeksikan menggunakan spuit.
Dalam penelitian ini digunakan CMC Na karena dapat berfungsi sebagai
suspending agent sehingga ekstrak kental dapat tersuspensi dan dapat
diinjeksikan. CMC Na juga larut secara baik dalam air dan bersifat non toksik
dalam tubuh sehingga sering digunakan sebagai suspending agent untuk sediaan
27
B. Perlakuan Ekstrak Etanol Buah Lagenaria siceraira dan Doksorubisin pada Hewan Uji
Penetapan dosis ekstrak etanol buah Lagenaria siceraria bertujuan untuk
mengetahui dosis paling efektif yang memberikan efek yang diharapkan, yaitu
sebagai imunomodulator dengan mekanisme peningkatan proliferasi limfosit.
Dosis yang digunakan menggunakan tiga peringkat dosis, yaitu 1000 mg/kg BB
sebagai dosis tertinggi, dosis 750 mg/kg BB sebagai dosis tengah, dan dosis 500
mg/kg BB sebagai dosis terendah. Rentang dosis ekstrak yang digunakan
besar/lebar dengan tujuan agar bisa mengcover dosis efektif ekstrak etanol buah L.
siceraria yang dapat memberikan efek sebagai imunomodulator (meningkatkan
proliferasi limfosit) yang diduga terletak di antara rentang dosis tersebut.
Pemilihan dosis yang digunakan dalam penelitian ini bersifat eksploratif karena
belum didapatkan data dari penelitian sebelumnya mengenai dosis efektif ekstrak
etanol buah L. siceraria dalam meningkatkan proliferasi limfosit.
Doksorubisin diberikan untuk menginduksi efek imunosupresan,
hepatotoksik dan kardiotoksik. Orientasi dosis doksorubisin dilakukan untuk
mengetahui dosis yang mampu memberikan efek keseluruhan meliputi
kardiotoksik, hepatotoksik dan imunosupresan. Menurut Herwandhani, Nagadi,
dan Saktiningtyas (2011), dosis 4,5 mg/kg BB sebanyak 2 kali terbukti dapat
menimbulkan efek imunosupresan.
Pemberian ekstrak etanol buah L. siceraria dilakukan selama 10 hari,
kemudian dilanjutkan dengan pemberian doksorubisin pada hari ke-11, 13 dan 15.
Pada 2 kali pemberian doksorubisin 4,5 mg/kg BB belum dapat menimbulkan
efek hepatotoksik dan kardiotoksik, sehingga frekuensi pemberian doksorubisin
ditingkatkan menjadi tiga kali. Putri (2012) melaporkan bahwa pencuplikan
sampel dilakukan empat hari setelah dipejani doksorubisin terakhir, atau dengan
kata lain pencuplikan sampel dilakukan pada hari ke-19. Pemberian ekstrak
selama 10 hari bersifat eksploratif, dengan tujuan ekstrak buah L. siceraria
mampu menaikkan sistem imun sebelum dipejani dengan doksorubisin.
C.Pengujian Proliferasi Limfosit
Sel limfosit yang digunakan dalam penelitian ini diisolasi dari organ
limpa. Limpa merupakan organ limfoid sekunder utama yang berfungsi sebagai
tempat utama produksi sel T dan B (Kartika, 2012). Baratawidjaja dan Rengganis
(2009), menjelaskan bahwa organ limfoid sekunder adalah tempat sel dendritik
mempresentasikan antigen yang ditangkap di bagian lain tubuh ke sel T yang
memacu proliferasi dan diferensiasi limfosit.
Sel limfosit didapatkan dengan cara menyuntikan medium RPMI dingin
ke dalam limpa dan sel limfosit keluar dari limpa. Medium RPMI mengandung
nutrisi yang dibutuhkan untuk pertumbuhan sel seperti asam amino, vitamin, dan
garam-garam organik, sehingga walaupun sudah diisolasi dari limpa, sel limfosit
tidak akan mati karena kebutuhan nutrsi terpenuhi. Penelitian ini menggunakan
medium komplit yang mengandung medium RPMI, FBS (Fetal Bovine Serum),
penisilin-streptomisin (penstrep) dan fungison. FBS berfungsi untuk memacu
pertumbuhan sel dan menjaga kelangsungan hidup sel. Penisilin-streptomisin
29
Kepadatan sel limfosit ditentukan sebanyak 1x106 sel/mL. Kepadatan sel
tersebut dihitung dengan menggunakan alat haemocytometer dengan pengenceran
50 kali dalam medium komplit. Aktivitas proliferasi sel limfosit didapatkan
dengan cara membandingkan Optical Density (OD) dua sampel, yaitu sampel
yang ditambahkan fitohemaglutinin (PHA) dengan sampel yang tidak
ditambahkan dengan PHA, dan keduanya sudah dikurangi OD kontrol medium.
Fitohemaglutinin digunakan sebagai kontrol positif dan sebagai pembanding
karena fitohemaglutinin merupakan mitogen yang digunakan untuk merangsang
terjadinya proliferasi limfosit T, limfosit B, dan produksi limfokin dimana lektin
PHA mampu memicu aktivitas pada sel T jika terikat pada reseptor sel T manusia
(Kresno, 2001). Semakin besar rasio proliferasi maka semakin besar pula
proliferasi yang ditunjukan sel limfosit. Proliferasi merupakan salah satu
parameter dari suatu tingkat imunitas tubuh, yaitu menunjukkan kemampuan
dasar sistem imun meliputi proses diferensiasi dan pembelahan sel.
Pengukuran proliferasi limfosit menggunakan metode MTT assay
dilakukan setelah inkubasi selama 72 jam dalam inkubator CO2 dengan suhu 370C
dengan CO2 5%. Metode MTT assay merupakan metode pengukuran jumlah sel
hidup berdasarkan prinsip kolorimetri menggunakan senyawa tetrazolium. Enzim
mitokondria suksinat dehydrogenase dalam sel hidup yang dapat mereduksi
garam tetrazolium dari MTT {(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyl-
tetrazoilium Bromide} yang merupakan senyawa berwarna kuning sehingga
membentuk kristal formazan yg berwarna ungu, kemudian dibaca oleh ELISA
reader dan jumlah kristal formazan yang terbentuk berbanding lurus dengan
jumlah sel limfosit yang hidup (Wang, Cheng, Wang, Wei dan Wang, 2010).
Sodium dodecyl sulfate (SDS) 10% dalam HCl 0,01N digunakan sebagai
Stop Solution, untuk menghentikan aktivitas proliferasi sel limfosit sehingga stabil
selama pengukuran OD (Doyle dan Griffiths, 1998). Semua sampel dalam
sumuran pada plate kemudian dibaca menggunakan ELISA reader pada panjang
gelombang 550 nm. Hasil dinyatakan dalam Optical Density (OD) yang
menggambarkan jumlah sel limfosit.
D.Hasil Uji Efek Imunomodulator Ekstrak Etanol Buah Lagenearia siceraria dengan Kajian Proliferasi Limfosit
Uji yang dilakukan terlebih dahulu adalah uji normalitas data menggunakan
uji Kolmogorov-Smirnov. Hasil uji menunjukkan bahwa data terdistribusi normal
dengan signifikansi 0,569 (p > 0,05). Data tersebut selanjutnya diuji dengan one
way ANOVA taraf kepercayaan 95%.
Tabel II. Purata OD + SD Proliferasi Limfosit Praperlakuan Pemberian Ekstrak Etanol Buah Lagenaria siceraria
31
Hasil uji one way ANOVA menunjukkan nilai p = 0,002 (p < 0,05). Hal
ini menunjukkan bahwa paling tidak terdapat perbedaan yang bermakna antara
dua kelompok dari seluruh kelompok perlakuan dan dilanjutkan uji Scheffe.
Tabel III. Hasil Analisis Uji Post-hoc Scheffe Proliferasi Limfosit Praperlakuan Pemberian Ekstrak Etanol Buah Lagenaria siceraria
Ket : Kel. I : kelompok kontrol pelarut Kel II : kelompok doksorubisin
Kel III : kelompok ekstrak dosis 1000 mg/kg BB Kel IV : kelompok ekstrak dosis 750 mg/kg BB Kel V : kelompok ekstrak dosis 500 mg/kg BB (*) : berbeda bermakna
Gambar 3. Diagram Batang Purata OD + SD Proliferasi Limfosit praperlakuan pemberian ekstrak etanol buah Lagenaria siceraria
Kelompok I II III IV V
I - BB BTB BTB BTB
II BB - BTB BTB BB
III BTB BTB - BTB BTB
IV BTB BTB BTB - BTB
V BTB BB BTB BTB -
Kontrol pelarut digunakan untuk mengetahui nilai proliferasi sel limfosit
normal sebelum diinduksi dengan doksorubisin. Pada tabel II diketahui rata-rata
proliferasi limfosit kelompok kontrol (kelompok I) sebesar 1,06 + 0,02. Nilai
proliferasi limfosit kelompok kontrol pelarut ini akan digunakan sebagai
pembanding terhadap kelompok kontrol doksorubisin dan kelompok perlakuan
ekstrak untuk mengetahui efek yang dihasilkan meningkatkan atau menurunkan
proliferasi sel limfosit.
Kontrol doksorubisin digunakan untuk mengetahui pengaruh penggunaan
doksorubisin sebagai agen kemoterapi yang dapat menyebabkan penurunan sistem
imun melalui pengamatan proliferasi limfosit. Rata-rata nilai proliferasi limfosit
kelompok kontrol doksorubisin (kelompok II) sebesar 1,01 + 0,02. Hasil analisis
statistik (Tabel III) menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang bermakna
(p<0,05) antara kontrol doksorubisin dengan kelompok kontrol pelarut, hal ini
menunjukkan bahwa pemberian doksorubisin memberikan pengaruh terhadap
proliferasi sel limfosit, yaitu berupa penurunan proliferasi limfosit. Lemasters
dkk. (cit., Putri, 2012) menjelaskan bahwa adanya sifat sitotoksik dari
doksorubisin karena terjadinya metabolisme doksorubisin tersebut oleh sitokrom
P450 yang menghasilkan metabolit radikal bebas semiquinon dan bersifat toksik.
Doksorubisin menekan sumsum tulang belakang, sehingga menyebabkan
penurunan semua jenis sel darah yang dihasilkan di sumsum tulang belakang
termasuk penurunan jumlah limfosit (Kunjumoideen, 2010).
Tabel III menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang bermakna antara
33
menunjukan bahwa pada ekstrak dosis 500 mg/kg BB mempengaruhi proliferasi
limfosit, yaitu berupa peningkatan proliferasi limfosit, sehingga dapat
disimpulkan bahwa ekstrak buah L. siceraria pada dosis 500 mg/kg BB bersifat
sebagai imunomodulator dengan mekanisme imunostimulan, yaitu memperbaiki
fungsi imun pada kondisi-kondisi imunosupresi (di bawah kondisi normal) setelah
dipejani doksorubisin, menuju keadaan yang menunjukkan jumlah limfosit pada
keadaan normal kembali. Secara biokimia aktivitas imunostimulan mungkin
disebabkan oleh flavonoid yang berperan sebagai antigen dan mampu dikenal oleh
reseptor sel B maupun sel T dan memacu sel limfosit T maupun sel limfosit B
untuk berproliferasi (Filbert, 2010).
Tabel III menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang tidak bermakna
antara kelompok ekstrak dosis 1000mg/kg BB dan dosis 750mg/kg BB dengan
kontrol doksorubisin. Hal ini menunjukkan bahwa pada ekstrak dosis 1000mg/kg
BB dan 750mg/kg BB terjadi penghambatan proliferasi limfosit. Peningkatan
proliferasi limfosit berbanding terbalik dengan meningkatnya peringkat dosis
ekstrak buah L. siceraria, yaitu pada ekstrak buah L. siceraria dosis 1000 mg/kg
BB dan 750 mg/kg BB dengan rasio proliferasi sebesar 1,03 dan 1,06; dan ekstrak
buah L. siceraria dosis 500 mg/kg BB dengan rasio proliferasi sebesar 1,07 (Tabel
II). Terjadinya hal ini adalah dari aktivitas flavonoid yang terkandung dalam buah
L. siceraria. Mc.Clure (Cit., Hernawati, 2009) menjelaskan bahwa flavonoid
mempengaruhi interaksi antar sel dalam proses metabolisme baik bersifat negatif
(menghambat) maupun positif (menstimulasi). Akiyama dkk., (cit., Putri, 2012)
menjelaskan bahwa senyawa flavonoid dapat memberikan efek yang berbeda
tergantung jumlah dosisnya di mana pada dosis yang rendah flavonoid mampu
memacu pertumbuhan sel sedangkan pada kadar tinggi justru dapat menghambat
proliferasi sel. Derivat dari senyawa flavonoid, yaitu flavone dan flavonol
menunjukkan efek penghambatan proliferasi limfosit yang diinduksi oleh
concanavalin A (Namgoong, Son, Chang, Kang dan Kim, 1994). Aljancic,
Stankovic, Tesevic, Vujisic, Vajs dan Milosavljevic (2010) menyebutkan semakin
besar konsentrasi quercetin (flavonol) menyebabkan peningkatan kerusakan DNA
sehingga sel mati. Dimungkinkan pada dosis 1000 mg/kg BB dan 750mg/kg BB
yang merupakan dosis besar justru terjadi penghambatan proses proliferasi
limfosit.
Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh maka dapat dibuktikan
bahwa pemberian ekstrak buah L. siceraria mampu memberikan pengaruh berupa
peningkatan proliferasi limfosit. Peningkatan proliferasi limfosit berbanding
terbalik dengan peningkatan dosis ekstrak buah L. siceraria. Proliferasi limfosit
paling besar ditunjukkan oleh ekstrak dosis 500 mg/kg BB, yaitu dengan rasio
35 BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A.Kesimpulan
Berdasarkan hasil yang diperoleh dan analisis statistik yang telah
dilakukan, maka dapat disimpulkan sebagai berikut :
1. Pemberian ekstrak etanol buah L. siceraria terbukti berpengaruh dalam
meningkatkan proliferasi sel limfosit tikus jantan Sprague Dawley yang
dipejani doksorubisin.
2. Dosis yang paling efektif memberikan pengaruh terhadap peningkatan
proliferasi sel limfosit adalah dosis 500 mg/kg BB.
B.Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai :
1. Senyawa dalam buah L. siceraria yang berperan untuk meningkatkan
proliferasi limfosit.
2. Pengkajian peringkat dosis ekstrak etanol buah L. siceraria dengan faktor
kelipatan untuk mendapatkan dosis efektif.
3. Pengkajian lama pemberian dosis ekstrak etanol buah L. siceraria yang dapat
menimbulkan efek imunomodulator.
4. Dosis doksorubisin yang dapat menimbulkan efek imunosupresan.
DAFTAR PUSTAKA
Akiyama, T., Ishida, J., Nakagawa, S., Ogawara, H., Watanabe, S., I toh N., Shibuya, M., and Fukami, Y., 1987, Genistein, a specific inhibitor of tyrosine specific protein kinase, J. Biol. Chem, 262, 5592-5595.
Aljancic, I., Stankovic, M., Tesevic, V., Vujisic, L., Vajs, V., Milosavljevic, S., 2010, Protective effect on human lymphocytes of some flavonoids isolated from two Achilleaspecies. Nat Prod Commun, May;5(5):729-32, PubMed PMID: 20521537.
Anonim, 2011, World Health Organization, http://apps.who.int/medicinedocs /en/d/Js2200e/, diakses tanggal 23 Juni 2013.
Baratawidjaja, K., dan Rengganis, I., 2009, Imunologi Dasar, Edisi ke-8, Balai Penerbit TKUI, Jakarta.
Block, K., Mead, M., 2003, Immune System Effects of Echinacea, Ginseng and Astragalus : A review Integrative cancer therapies, 2(3): 247-246.
Bruton, L., Lazo, J. S., dan Parker, K. L., 2005, Goodman & Gilman’s The
Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th Edition, McGrawHill,
Lange.
Deore, S., Khadabadi, S., Patel, Q., Deshmukh, S., Jaju, M., Junghare, N., Wane, T., Jain, R., 2009, In Vitro Antioxidant Activity and Quantitative Estimation of Phenolic Content of Lagenaria siceraria, Rasayan J. Chem.,
Vol.2, No.1, India.
Direktorat Jenderal Pengawas Obat dan Makanan, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan RI, Jakarta.
Deshpande, J., Choudhari, A., Mishra, M., Meghre, V., Wadodkar, S., Dorle, A.K., 2008, Beneficial Effects of Lagenaria siceraria (Mol.) Standley fruit eficarp in animal Model, Indian J. Exp Biol, 46, 234-242.
Doyle, A. & Griffiths, J. B., 1998, Cell and tissue culture : laboratory procedures
in biotechnology, Wiley & Sons Ltd., England, pp. 62-64.
Filbert, I., 2010, Gambaran Histopatologis Limpa Mencit Galur Swiss Webster
Jantan Pasca Pemberian Minyak Buah (Pandanus conoideus Lam.),
Laporan Akhir Penelitian Karya Tulis Ilmiah, Fakultas Kedokteran
Universitas Kristen Maranatha.
Gangwal, A., Panmar, S.K., Gupta, G., Rana A., and Sheth, N., 2008, Immunomodulatory Effects of Lagenaria siceraria Fruits in rats,
Pharmacognosy Mag., 4, S234-S238.
Gruendemann, B., Fernsebner, B., 2005, Keperawatan Perioperatif, EGC, Jakarta, pp. 610-611.
Handayani, W., 2008, Asuhan Keperawatan pada Klien dengan Gangguan Sistem
Hematologi, Salemba Medika, Jakarta.
Harris, J., 1991, Blood Cell Biochemistry Volume 3 : Lymphocytes and
Granulocytes, Plenum Press, New York.
37
Hernawati, 2009, Perbaikan Kinerja Reproduksi Akibat Pemberian Isoflavon dari Tanaman Kedelai, Laporan Penelitian, FPMIPA Universitas Pendidikan Indonesia, Bandung, p. 6.
Herwandhani, P., Nagadi, S.. dan Saktiningtyas, I.A., 2011, Potensi Kulit Jeruk Purut (Citrus hystrix D.C.) sebagai Agen Imunomodulator yang Prospektif pada Penekanan Efek Imunosupresi Kemoterapi, Jurnal Saintifika Gadjah Mada, III(2).
Jenie, R., Meiyanto, E., 2009, Aplikasi ko-kemoterapi Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanolik Daun Sambung Nyawa (Gyanura Procumbens (Lour.)Merr.) Pada Sel Kanker Payudara MCF-7, Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. VI, No. 3, Yogyakarta.
Jong, W., 2004, Kanker, Apakah itu? Pengobatan, Harapan Hidup dan Dukungan
Keluarga, Arcan, Jakarta, pp. 119-121.
Kartika, R., S., 2012, Isolasi Polisakarida Buah Mengkudu (Morinda citrifolia L.) dengan Metode Pengendapan Menggunakan Aseton serta Uji Aktivitasnya Terhadap Fagositosis Makrofag dan Proliferasi Limfosit secara in vitro,
Skripsi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, pp. 59,60.
Khasanah, N., 2009, Pengaruh Pemberian Ekstrak Jintan Hitam (Nigella Sativa) Terhadap Respon Proliferasi Limfosit Limpa Mencit Balb/C Yang Diinfeksi Salmonella typhimurium, Laporan Akhir Penelitian Karya Tulis
Ilmiah, Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro, Semarang.
Kimball, J., 1990, Introduction to Immunology, 3rd Edition. Macmillan Publishing Company, Inc., New York.
Kresno, S. B., 2001, Imunologi : Diagnosis dan Prosedur Labortorium, Edisi IV, Fakultas Kedokteran Umum, Universitas Indonesia, Jakarta.
Kunjumoideen, K., 2010, Doxorubicin (adriamycin), http://medicineworld.org/ cancer/breast/treatment/doxorubicin.html, diakses 7 Mei 2013.
Lemasters, J., Nieminen A., Qian, T., Trost L., Elmore S., Nishimura, Y., Crowe, R., Cascio, W., Bradham, C., Brenner, D., 1998, mitochondrial permeability transition in cell death : a common mechanism necrosis, apoptosis and autophagy, Biochem Biophys Acta., 1366: 177-196.
Lim, T. K., 2012, Edible Medicinal and Non-Medicinal Plants, Volume 2, Fruits, Spinger Dordrecht Heidelberg, New York.
Long B., Hai, Y., Xian, M., 2005, Spectroscopic and Viscosity Study of Doksorubisin Interaction with DNA, Journal of Molecular Structure, 749 (2005) 1008-113.
Mangan, Y., 2009, Solusi Sehat Mencegah dan Mengatasi Kanker, Agromedia Pustaka, Jakarta, p.1.
Maria, A., 2008, Bertahan Hidup Dengan Terapi Jus, Pustaka Anggrek, Yogyakarta, p. 31.
Mashitoh B., 2007, Effects of Damnacanthal, Nordamnacanthal, Betulinic Acid and Zerumbone Isolated From Local Medicinal Plants on Leukemia Cell Lines and Immune Cells, Laporan Penelitian, Universiti Putra Malaysia, Malaysia.
