ANALISIS MOLEKULER HCV (HEPATITIS C VIRUS) REGIO E1-E2 DAN NS5B PASIEN HIV RUMAH SAKIT UMUM DAERAH DR.
MOEWARDI DI SURAKARTA
TESIS
Disusun untuk Memenuhi Sebagian Persyaratan Mencapai Derajat Magister Program Studi Biosain
Oleh:
Rizki Nisfi Ramdhini S901108007
1
ANALISIS MOLEKULER HCV (HEPATITIS C VIRUS) REGIO E1-E2 DAN NS5B PASIEN HIV RUMAH SAKIT UMUM DAERAH DR.
MOEWARDI DI SURAKARTA
TESIS
Disusun untuk Memenuhi Sebagian Persyaratan Mencapai Derajat Magister Program Studi Biosain
Oleh:
Rizki Nisfi Ramdhini S901108007
PROGAM PASCA SARJANA UNIVERSITAS SEBELAS MARET
PERNYATAAN ORISINALITAS DAN PUBLIKASI ISI TESIS
Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa:
1. Analisis Molekuler HCV (Hepatitis C Virus) Regio E1-E2 dan NS5B Pasien HIV Rumah Sakit Umum Daerah Dr. Moewardi di Surakarta
tidak terdapat karya ilmiah yang pernah diajukan oleh orang lain untuk
memperoleh gelar akademik serta tidak terdapat karya atau pendapat yang
pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis
digunakan sebagai acuan dalam naskah ini dan disebutkan dalam sumber acuan
serta daftar pustaka. Apabila di kemudian hari terbukti terdapat plagiat dalam
karya ilmiah ini, maka saya bersedia menerima sanksi sesuai ketentuan
perundang-undangan (Permendiknas No 17, tahun 2010).
2. Publikasi sebagian atau keseluruhan isi tesis pada jurnal atau forum ilmiah lain
harus seijin dan menyertakan tim pembimbing sebagai a uthor dan PPs UNS
sebagai institusinya. Apabila dalam waktu sekurang-kurangnya satu semester
(enam bulan sejak pengesahan tesis) saya tidak melakukan publikasi dari
sebagian atau keseluruhan tesis ini, maka Prodi Biosain PPs-UNS berhak
mempublikasikannya pada jurnal ilmiah yang diterbitkan oleh Prodi Biosain
PPs-UNS. Apabila saya melakukan pelanggaran dari ketentuan publikasi ini,
maka saya bersedia mendapatkan sanksi akademik yang berlaku.
Surakarta, April 2014
Mahasiswa,
Rizki Nisfi Ramdhini
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulis panjatkan atas kehadirat Allah SWT berkat
limpahan nikmat, rahmat serta hidayah-Nya penulis dapat menyelesaikan tesis
yang berjudul Analisis Molekuler HCV (Hepatitis C Virus) Regio E1-E2
dan NS5B Pasien HIV Rumah Sakit Umum Daerah Dr. Moewardi di Surakarta
Di dalam melakukan penelitian maupun penyusunan naskah tesis ini
penulis mendapatkan banyak masukan, bantua dan bimbingan dari berbagai
pihak yang bermanfaat baik secara langsung maupun tidak langsung. Oleh
karena itu, penulis ingin mengucapkan terimaksih kepada:
1. Prof. Dr. Ravik Karsidi, M.S selaku Rektor Universitas Sebelas Maret.
2. Prof. Dr. Ir. Ahmad Yunus, M.S selaku Direktur Program Pasca Sarjana.
3. Prof. Dr. Sugiyarto, M.Si selaku Ketua Program Studi Biosain yang telah
memberikan arahan dalam proses pembelajaran di Program Studi Biosain.
4. Dr. Ari Susilowati, M.Si selaku Sekretaris Program Studi Biosain.
5. Afiono Agung Prasetyo dr., Ph.D selaku pembimbing tesis yang telah
memberikan saran, kritikan, arahan dan motivasinya.
6. Prof. Drs. Sutarno, M.Sc., Ph.D selaku pembimbing tesis yang telah
memberikan saran dan arahan.
7. Teknisi Laboratorium Biomedik dan staf administrasi serta teman-teman
asisten Biomedik di fakultas kedokteran Universitas Sebelas Maret.
8. Staf administrasi Program Studi Biosain atas bantuan dan kerja samanya.
9. Orang tua dan keluarga atas doa, dukungan dan semangat yang selalu
dicurahkan.
10. Teman-teman Program Studi Biosain angkatan 2011, mbk nova, mbk
fahrida, mbk andriyani, mbk lisdyah, inggrit, angga, pak edi, pak pri atas
semangat dan dukungannya.
7
Penulis menyadari bahwa naskah tesis ini masih jauh dari sempurna,
oleh karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran untuk perbaikan dan
pembelajaran selanjutnya. Akhir kata penulis mengharapkan agar naskah ini
nantinya dapat memberikan manfaat bagi semua pihak.
Surakarta, April 2014
Rizki Nisfi Ramdhini, S901108007, 2014, Analisis Molekuler HCV (Hepatitis C Virus) Regio E1-E2 dan NS5B Pasien HIV Rumah Sakit Umum Daerah Dr. Moewardi di Surakarta. TESIS. Pembimbing 1: Prof. Drs. Sutarno, M.Sc., Ph.D, II: Afiono Agung Prasetyo dr., Ph.D. Program Pascasarjana, Universitas Sebelas Maret Surakarta.
ABSTRAK
Sekitar 15-30% dari pasien dengan HIV (Huma n immunodeficiency Virus) diperkirakan koinfeksi dengan HCV (Hepa titis C Vir us). Pasien koinfeksi HIV-HCV lebih mungkin untuk progresivitas sirosis dan risiko AIDS. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendeteksi infeksi HCV pasien HIV di Rumah Sakit Umum Moewardi Surakarta dan analisis motif esensial di sebagian region HCV E1-E2 dan HCV NS5B.
Sebanyak 100 sampel plasma diperoleh dari 100 pasien HIV di VCT (voluntar y counselling a nd testing) di Rumah Sakit Umum Moewardi Surakarta. Dalam studi ini, deteksi RNA HCV meliputi isolasi asam nukleat, sintesis cDNA, amplifikasi menggunakan nested PCR dan sequencing produk PCR. Hasil sekuensing di-a ligment dengan semua sekuen genotipe HCV yang dilaporkan di database GenBank. Identifikasi genotipe HCV berdasarkan analisis filogenetik dan analisis molekuler dilakukan menggunakan softwar e MEGA5.
RNA HCV positif terdeteksi pada satu sampel dari 37 sampel anti- HCV positif dan satu sampel dari 63 anti-HCV negatif. Hasil ini menunjukkan bahwa HCV dapat mengalami koinfeksi dengan pasien HIV. Hasil tersebut merupakan petunjuk terhadap pentingnya pemeriksaan HCV terhadap pasien HIV. Sekuensing nukleotida regio NS5B dan E1-E2 menunjukkan satu isolat diidentifikasi sebagai genotipe 1a dan satu isolat sebagai genotipe campuran 1a dan 3k. Di regio E1 terjadi variasi a la nine di residu 369. Epitop I regio E2 terjadi variasi di I414V dan T416S (isolat D8-26), dan N417G T416A (isolat D8-87), sedangkan epitop II regio E2 terjadi variasi di W437F, L438I, Q444Y dan H445N (isolat D8-26); L438I, F442I, Q444R dan H445Y (isolat D8-87). Regio NS5B ditemukan variasi di motif A RdRp NS5B yaitu D220Y (isolat D10-87) sedangkan di motif B dan C tidak ditemukan variasi asam amino baik di isolat D10-26 dan D10-87.Variasi tersebut diketahui tidak menurunkan kesensitivan terhadap antibodi monoklonal dan terapi a ntiretrovir al (ARV).
9
Rizki Nisfi Ramdhini, S901108007, 2014. Molecular Analysis of HCV (Hepatitis C Virus) E1-E2 and NS5B regions in HIV Patients in Dr. Moewardi General Hospital, Surakarta. THESIS. Supervisor I: Prof. Drs. Sutarno, M.Sc., Ph.D, II: Afiono Agung Prasetyo dr., Ph.D. Program Study of Sciences. Post-graduate Program of Sebelas Maret University, Surakarta.
ABSTRACT
Approximately 15%-30% of people with HIV (Human Immunodeficiency Virus) are estimated to be co-infected with HCV (Hepa titis C Vir us). HIV-HCV co-infected patients were more likely to develop cirrhosis and had an increased risk of developing AIDS. The aim of this study was to investigate HCV infection in HIV-positive patients in Moewardi General Hospital Surakarta and analysis of essential motif on portion HCV E1-E2 and HCV NS5B regions.
A total of 100 plasma samples were obtained from 100 HIV patients in VCT (voluntary counselling and testing) Moewardi General Hospital Surakarta. In this study, detection of RNA HCV which includes nucleic acid isolation, cDNA synthesis, amplification by nested PCR and sequencing of PCR products. The sequences result were aligned with all HCV genotype sequences reported in the GenBank database. HCV genotyping was performed by phylogenetic analysis and molecular analysis was performed using MEGA5 software.
Positive HCV RNA was detected in one sample from 37 samples of anti-HCV positive and one sample from 63 of anti-HCV negative. These results indicated that HCV can be co-infection in HIV patients. These findings are pointer to the importance of testing for HCV in HIV pasien. Nucleotide sequencing of the NS5B and E1-E2 regions showed that one isolate was identified as 1a dan one isolate was a mixed infection of genotype 1a and 3k. In the E1 region were a lanine variation on 369 residue. The epitope I of E2 region showed variations on I414V and T416S (D8-26 isolate), N417G and T416A (D8-87 isolate), while the epitope II of E2 region showed variations on W437F, L438I, Q444Y dan H445N (D8-26 isolate); L438I, F442I, Q444R dan H445Y (D8-87 isolate). In the NS5B region were found variation motif A of RdRp NS5B was D220Y (D10-87 isolate) while in motif B and C were no variation both D10-26 and D10-87 isolates. These variations not decreased sensitivity of monoclonal antibodies and antiretrovirals (ARV) therapy.
HALAMAN JUDUL ... i
HALAMAN PENGESAHAN PEMBIMIBING TESIS ... ii
HALAMAN PENGESAHAN PENGUJI TESIS ... iii
HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS ... iv
HALAMAN MOTTO DAN PERSEMBAHAN ... v
KATA PENGANTAR ... vi
ABSTRAK ... viii
ABSTRACT ... ix
DAFTAR ISI ... x
DAFTAR TABEL ... xi
DAFTAR GAMBAR ... xii
DAFTAR LAMPIRAN ... xiii
BAB I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang ... 1
B. Rumusan Maslah ... 2
C. Tujuan Penelitian ... 2
D. Manfaat Penelitian ... 4
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA A. Kajian Teori ... 4
B. Kerangka Pemikiran ... 13
BAB III. METODE PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian ... 14
B. Alat dan Bahan ... 14
C. Cara Kerja ... 16
D. Analisis Data ... 23
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil ... 26
B. Pembahasan ... 39
BAB V. KESIMPULAN ... 59
DAFTAR PUSTAKA ... 61
11
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Homologi sekuen nukleotida E2-E2 dan NS5B isolat uji
dengan seluruh isolat di database GenBa nk berdasarkan
27
Tabel 2. Variasi nukleotida dan asam amino isolat E1-E2 (D8- 31
Tabel 3. Variasi nukleotida dan asam amino isolat E1-E2 (D8- 33
Tabel 4. Variasi nukleotida dan asam amino isolat NS5B (D10- 35
Tabel 5. Variasi nukleotida dan asam amino isolat NS5B (D10- 36
Tabel 6. Motif esensial sebagian regio HCV E1- 37
Tabel 7. 38
Tabel 8. Daftar refer ence sequences isolat HCV genotipe 1-7 dari
GenBa nk 78
Tabel 8. Alignment nukleotida isolat NS5B (D10- 79
Tabel 9. Alignment nukleotida isolat NS5B (D10-87 81
Tabel 10. Alignment nukleotida isolat E1-E2 (D8-26 83
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur genom HCV 5
Gambar 2. Pemetaan HCV E1 dan E2 8
Gambar 3. Pemetaan subdomain finger, palm dan thumb 10
Gambar 4. Kerangka berpikir 13
Gambar 5. Skema alur kerja penelitian 25
Gambar 6. Konstruksi phylogenetic tree isolat uji sebagian regio HCV
29
Gambar 7. Konstruksi phylogenetic tree isolat uji sebagian regio HCV
30
Gambar 8. Sekuen asam amino sebagian regio HCV E1 isolat D8- 43
Gambar 9. Sekuen asam amino sebagian regio HCV E1 isolat D8- 44
Gambar 10. Sekuen asam amino sebagian regio HCV E2 isolat D10-26.... 46
Gambar 11. Sekuen asam amino sebagian regio HCV E2 isolat D10-87.... 46
Gambar 12. Sekuen subdomain palm (motif B dan motif C) RdRp NS5B
isolat D10- 51
Gambar 13. Sekuen subdomain palm (motif A, B dan motif C) RdRp
13
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Visualisasi hasil 72
Lampiran 2. 74
Lampiran 3. Alignment sekuen nukleotida isolat uji dengan seluruh isolat
di database GenBa nk 76
Lampiran 4. Daftar reference sequences 77