Laporan Hasil Tahun Pertama Penelitian Hibah Bersaing UHAMKA _______________1 BAB II. STUDI PUSTAKA
Salah satu sifat serangga adalah memiliki ketertarikan terhadap cahaya, dalam praktek secara tradisional hal ini telah lama diaplikasikan misalnya menggunakan lampu petromak untuk menangkap laron (serangga), menangkap lalat buah dengan warna kuning, menangkap lalat dengan warna-warni yang mencolok dan menangkap nyamuk mengunakan cahaya ultraviolet. Bahkan di Malaysia dalam beberapa aplikasi yang terbatas juga telah diterapkan dalam bidang pertanian. Namun belum ada yang meneliti secara komprehensip mulai dari ukuran intensitas cahaya dan pengaruhnya terhadap perilaku serangga. Kenyataan ini sangat menantang untuk dapat diteliti secara khusus seberapa besar intensitas cahaya yang diperlukan untuk dapat menarik perhatian serangga secara optimal, hal ini akan sangat berpengaruh untuk menentukan sumber energi yang diperlukan guna membangkitkan cahaya yang dibutuhkan seefektif mungkin.
A. Mengukur Intensitas Cahaya.
Salah satu cara untuk mengamati energi cahaya dapat dilakukan dengan mengukur pengaruh besaran dan distribusi partikel dalam Flow cytometers.
Flow cytometers pada dasarnya adalah microskop yang dilengkapi dengan komponen yang berfungsi untuk melalukan individu cell secara sekuensial melalui berkas cahaya (laser) yang akan dianalisis.
Komponennya antara lain:
1. Sumber cahaya, dan komponen pemfokus cahaya. 2. Fluidics, untuk mengarahkan cells melalui cahaya.
3. Elektronika, untuk mendeteksi cahaya dan mengubahnya ke bentuk sinyal digital. 4. Suatu komputer untuk penyimpanan signals yang akan dianalisis.
A.1. Sumber Cahaya
Sumber cahaya pada suatu flowcytometer adalah laser. Alasan penggunaan laser, karena kemampuannya untuk difokuskan menjadi berkas cahaya elliptis. Ini terkait dengan komponen-komponen fluidics terkait. Laser memancarkan cahaya koheren, dan merupakan
Laporan Hasil Tahun Pertama Penelitian Hibah Bersaing UHAMKA _______________2 berkas sangat paralel. Hal ini memungkinkan dasar pengukuran yang berbasis pada gangguan berkas (beam disturbance) dapat dilakukan (forward scatter, side scatter). Batasan prinsip bagi lasers ditentukan oleh panjang gelombang yang dapat menimbulkan eksitasi. Secara virtual semua cytometers mengikuti standar laser argon, yang memancarkan cahaya pada 488nm. Selanjutnya lasers lain dapat digunakan, untuk mendapatkan panjang gelombang eksitasi lainnya.
Gambar 1. Karakteristik Cahaya.
Cahaya adalah suatu bentuk energi yang terdiri dari sejumlah partikel yang disebut photons, tetapi memiliki sifat-sifat gelombang. Panjang gelombang cahaya/photon sebanding dengan energi yang dimilikinya. Bertambah panjang gelombangnya akan bertambah kurang energinya.
Kesimpulan Sumber Cahaya
Penggunaan laser memungkinkan berkas cahaya difokuskan pada cell yang melalui cytometer. Cahaya koheren memungkinkan pengukuran gangguan cahaya (light disturbance). Penggunaan berkas terfokus yang elliptis dapat menghasilkan hanya cahaya fluoresensi dari single cell (size dependent) yang dapat diukur setiap saat.
A.2. Fluidics
Fluidics adalah bagian yang paling sensitif pada setiap flow cytometer. Jika terjadi kesalahan, semuanya akan salah, dan fatal.
Laporan Hasil Tahun Pertama Penelitian Hibah Bersaing UHAMKA _______________3 1. Clogs (celah pada aliran larutan sangat kecil).
2. Gelembung udara (akan menggangu aliran dan yang akan diinterpretasikan sebagai cell).
3. Leaks (Kurangnya tekanan didalam sistem akan menggangu aliran cellular dan mempengaruhi hasil).
4. Errors yang paling umum mempengaruhi fluidics adalah:
a) Clumps of cells. Hal ini akan “clog” mesin dan berakibat kesulitan utama dan “headaches” . Kejadian ini dapat diatasi dengan pre-filtrasi populasi cell tidak lebih besar dari 50um filter.
b) Konsentrasi cell yang tidak sesuai. Semua larutan memiliki proporsi partikel debu yang rendah. Jangan percaya suatu flow rate yang lebih rendah dari 15 cells/sec. Tetapi, flow rates lebih besar dari sekitar 4000 cells/sec meningkatkan risiko pada pengukuran multiple cells secara simultan.
c) Konsentrasi Optimal adalah sekitar 1x106 s/d 1x107 cells/ml
A. 3. Deteksi Sinyal.
Seperti dibahas sebelumnya, deteksi sinyal dilaksanakan dengan menggunakan kombinasi photomultiplier (cathode-ray) dan rangkaian elektronika. Sinyal yang dibangkitkan oleh setiap individu cell pada dasarnya merupakan oscilloscope trace. Dengan melakukan integrasi sinyal ini, akan dihasilkan suatu nilai numerik bagi fluorescensi maupun nilai side scatter.
Photodeteksi : Forward Angle Light Scatter (FSC)
Ada dua dari parameter yang paling berharga didapatkan dalam flow cytometry, yang menentukan bagaimana cahaya dari berkas laser dapat melalui suatu cell secara afektif. Parameter pertama adalah forward angle light scatter. Anggaplah suatu cell (atau partikel lainnya) merupakan suatu lensa. Jika cahaya koheren dari laser melaluinya, cahaya akan menjadi “berbelok” tergantung pada ukuran dan indeks bias dari cell. Besar sudut cahaya di belokkan atau lengkungan, diukur sebagai Forward Angle Light Scatter (FSC).
Laporan Hasil Tahun Pertama Penelitian Hibah Bersaing UHAMKA _______________4 Gambar 2. Bentuk Hamburan Depan
(Forward scatter).
Secara umum FSC berbanding langsung dengan ukuran cell. Tetapi cell yang mati (walaupun penampakan mikroskopis sebaliknya) terlihat lebih kecil dibanding yang hidup. Cell darah merah (juga berbeda terhadap sebenarnya) umumnya lebih kecil dari semua cell darah lainnya. FSC pada umumnya diamati dalam skala linear (untuk PBL).
Photodeteksi : Side Scatter (SSC)
Selain memiliki forward detector, cytometers memiliki detektor lain pada posisi 90 derajat terhadap berkas cahaya. Sesuai namanya, detektor ini mengukur kesanggupan suatu cell untuk “membelokkan” cahaya ke samping. Pada umumnya peningkatan side scatter berkorelasi dengan peningkatan granularity (butiran kecil) dari cell (Umpamanya, granulocytes, plasma cells, dll.). Tetapi Cells dendritic dan tipe cell kompleks lain memiliki side scatter yang tinggi.
Gambar 3. Deteksi Samping (side scatter).
Forward Scatter
Photo Multiplier Tube
SSC PMT Laser Light
FSC Detector
Laporan Hasil Tahun Pertama Penelitian Hibah Bersaing UHAMKA _______________5 Deteksi Sinyal : Fluorescence
Gambar 4. Skema Deteksi Sinyal fluoresensi. Deteksi Sinyal : PMT
Untuk mendeteksi sinyal, photons harus diubah menjadi besaran listrik (untuk computer storage). Tegangan listrik yang dibangkitkan sebanding dengan jumlah photons
(jumlah cahaya) yang diemisikan oleh cell/partikel. Hal yang perlu diketahui
CATHODE-RAY/PHOTOMULTIPLIER TUBES digunakan khusus untuk flowcytometer tertentu saja.
Gambar 4. Bentuk Fisik PMT.
Gambar 5. Bentuk Fisik PMT.
Kekuatan sinyal (tegangan listrik) tergantung dari perbedaan voltage antara katoda dan anoda.
Besarnya dapat dimanipulasi oleh user dan harus berada dalam orde yang tepat yang sesuai dengan
set up mesin. Pada umumnya FSC dan SSC dianalisis dengan menggunakan penguatan liner,
sedangkan fluoresensi dianalisis secara logarithmis. Peningkatan voltage tidak perlu adanya
peningkatan disciminatory power dari FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting), hanya kekuatan
sinyal.
Deteksi Sinyal : Elektronika
Pada saat cell melalui tengah-tengah berkas laser, cahaya yang diemisi akan meningkat ke
puncak tertentu (puncak dari berkas) dan kemudian akan berkurang. Sinyal ini kemudian ditangkap oleh rangkaian elektronika. Walaupun dimungkinkan untuk menganalisis pola ini (seperti tinggi
Laporan Hasil Tahun Pertama Penelitian Hibah Bersaing UHAMKA _______________6
puncak, yang dapat menginformasikan sesuatu tentang distribusi fluoresensi pada cell) tetapi hal ini tidak umum dianalisis. Total cahaya/fluoresensi dihitung berdasarkan luas bidang dibawah kurva (yaitu integrasi fluoresensi). Karena secara normal hanya dibaca nilai integrasi kurva fluoresensi,
perbedaan pola dari fluoresensi akan dapat memberikan pembacaan yang identik.
Gambar 6. Perbedaan Pola Fluoresensi
Deteksi Sinyal : Read out
Sebagai akibat dari sinyal yang diterima PMT, nilai integral dari total fluoresensi bagi setiap parameter yang diukur (FSC, SSC, FL1, FL2, FL3, FL4) ditampilkan bersama histogram frekuensi. Histograms dapat menyimpan sebanyak 256 kanal, atau 1024 kanal (default). Jumlah kanal tergantung dari tingkat resolusi yang diperlukan dan kapasitas memory yang tersedia.
Deteksi Sinyal : Jumlah Kanal
Miskonsepsi yang sering terjadi karena jumlah kanal berbanding langsung dengan intensitas fluoresensi. Tanpa kalibrasi yang tepat, secara virtual tidak mungkin bekerja secara “kuantitatif” dalam flow cytometry. Namun bertambah besar jumlah kanal, bertambah
Laporan Hasil Tahun Pertama Penelitian Hibah Bersaing UHAMKA _______________7 besar fluoresensi. Pada umumnya data yang terrekam mencapai 4-log 1024 kanal histogram.
Deteksi Sinyal : Threshold
Untuk setiap parameter dapat ditentukan harga ambangnya. Yang biasa menggunakan harga ambang ini adalah pada Forward Scatter. Pada dasarnya, cara ini adalah memerintahkan komputer untuk “membuang data” dari setiap partikel (umpamanya debu) yang tidak memenuhi batasan minimum. Sebaliknya semua data dari setiap parameter, terpilih direkam untuk setiap partikel yang melewati aliran.
A.4. Analisis data : Histograms.
Plot fluoresensi umumnya diamati sebagai kombinasi dari histogram parameter tunggal. Sebagai tambahan bagi histograms parameter tunggal, histograms gabungan dapat mencakupi plot dua parameter. Plot yang paling umum digunakan adalah dot-plot. Kesemuanya merupakan representasi berbentuk gambar data flow cytometry.
Analisis data : Markers and Regions
Statistik yang paling umum dilaporkan dari plot histograms/dot cytometry adalah : a) Percent Positive untuk setiap populasi.
b) Mean channel (intensitas fluoresensi). c) Peak channel (intensitas fluoresensi).
CATATAN : Data Flow cytometry bukan Gaussian. Tetapi, normal t- statistics TIDAK relevan.
d) Jika benar-benar sangat diperlukan dan menarik, perlu dipelajari mengenai fisika statistik yang agak rumit menyangkut statistik untuk cytometry.
Analisis data : Gating
Diskusi mengenai gating lebih rinci dalam kaitan dengan Software CellQuest. Gating pada dasarnya merupakan cara untuk memerintahkan komputer agar hanya menampilkan data dari subset cell, yang ditentukan berdasarkan pada karakteristik fluoresensi. Contoh
Laporan Hasil Tahun Pertama Penelitian Hibah Bersaing UHAMKA _______________8 yang mudah adalah gating berbasiskan pada karakteristik FSC/SSC bagi Peripheral Blood Cells. Gating untuk keseluruhan nilai dilakukan melalui exclusion of populations cells yang dipilih untuk menentukan karakteristik sepesifik dari populasi cell yang belum diketahui. Dengan menggunakan darah secara keseluruhan dengan markers tertentu akan didapatkan hanya informasi tentang granulocytes, lymphocytes dan lainnya.
Gambar 7. Contoh Eksperimen Fluoresence Activated Cell Sorting.
488 nm laser
+
Charged PlatesSingle cells sorted into test tubes
FALS Sensor
Fluorescence detector
Laporan Hasil Tahun Pertama Penelitian Hibah Bersaing UHAMKA _______________9 B. Serangga Hama
B.1. Bentuk Umum Serangga
Gambar 8. Bentuk umum serangga B.2.Faktor Fisik yang Mempengaruhi Serangga Hama
Suhu / Temperatur : mempengaruhi aktivitas perilaku serangga, penyebaran geografis, dan perkembangan fisik .
Gambar 9. Pengaruh suhu terhadap serangga
Kelembaban (RH) : mempengaruhi penguapan cairan tubuh serangga, preferensi tempat hidup dan persembunyian (terutama iklim mikro)RH Optimum 73-100%.
Cahaya : mempengaruhi aktivitas serangga (diurnal, nokturnal,krepuskular), perilaku serangga (tertarik gelombang cahaya, menghindar gelombang cahaya).
B.3. Pengendalian Hama
Tujuan pengendalian hama adalah :mengupayakan agar populasi hama tidak merugikan, dengan cara-cara yang evektif, menguntungkan dan aman terhadap lingkungan.
Pengendalian hama dapat dilakukan dengan cara : karantina (melalui undang-undang/peraturan), teknik cocok tanam, varietas resisten (bibit unggul), pengaturan fisik/mekanik, pengendalian hayati, pengendalian geneti, dan kimiawi. Pengendalian hama dengan memanfaatkan respon serangga hama terhadap cahaya termasuk dalam pengendalian hama secara fisik.
