α αα α
! " # $ !
a
Jurusan Kimia FMIPA, Universitas Haluoleo, Kendari, 93232
b
Jurusan Biologi FMIPA, Universitas Haluoleo, Kendari, 93232
" % Isolasi dan karakterisasi α amilase isolat bakteri amilolitik asidofilik dari Taman Nasional Rawa Aopa Watumohai telah dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakteristik isolat bakteri amilolitik asidofilik, substrat dan suhu optimum aktivitas α amilase yang dihasilkan, dan aktivitas spesifik pada setiap tahap pemurnian enzim. Aktivitas α amilase diukur dengan metode DNS (Dinitrosalisilic acid) pada λ 550 nm dan kadar protein enzim diukur dengan metode Biuret pada λ 540 nm. Dari hasil penelitian diperoleh isolat bakteri TR 1 dengan aktivitas amilolitik tertinggi merupakan koloni berwarna kuning keruh dengan permukaan cembung, bentuk tepian koloni tidak rata, sel batang dan bersifat Gram negatif. Aktivitas dan kadar protein optimum diperoleh pada ekstraksi (NH4)2SO4 60% (b/v). Aktivitas spesifik α amilase dalam bentuk ekstrak kasar adalah 0,038 U/mg enzim, setelah ekstraksi dengan (NH4)2SO4 60% (b/v) adalah 0,146 U/mg enzim dengan tingkat kemurnian 3,8, dan setelah dialisis adalah 0,255 U/mg enzim dengan tingkat kemurnian 6,7. Konsentrasi substrat optimum (amilosa) adalah 1,25% (b/v) dan suhu optimum inkubasi adalah 45oC.
& : Taman Nasional Rawa Aopa Watumohai, bakteri amilolitik asidofilik, α1amilase.
" & % Isolation and characterization αamylase acidophilic amylolytic bacteria isolate from Rawa Aopa Watumohai National Park has been carried out. The aims of these studies are to know the characteristics of acidophilic amylolytic bacteria isolate, the optimum concentration of substrate and temperature αamylase activity yielded, and specific activity in each enzyme purification steps. Activity of αamylase was measured with DNS (Dinitrosalisilic acidI) method at λ 550 nm and the rate of protein enzyme was measured with Biuret method at λ 540 nm. The content of this research were obtained the isolate bacteria TR 1 which higher amylolytic activity is the colonies are pale yellow with convex elevated, undulate, bacill sel, and negative Gram. The maximum activity and protein content obtained with (NH4)2SO4 extracted at 60% (w/v). The specific activity of αamylase in crude extract was 0.038 U/mg enzyme, after extracted with (NH4)2SO4 60% (w/v) was 0.146 U/mg enzyme with purification fold 3.8, and after dialysis was 0.255 U/mg enzyme with purification fold 3.8, respectively. The optimum concentration of substrate (amylose) was 1.25% (w/v) and the optimum incubation temperature was 45oC.
'( )*+*
Taman Nasional Rawa Aopa Watumohai merupakan salah satu kawasan konservasi sumber daya alam hayati di Sulawesi Tenggara. Kawasan ini memiliki empat tipe ekosistem yaitu ekosistem hutan hujan tropika dataran rendah, hutan bakau, savanah dan hutan rawa, dengan keanekaragaman flora dan fauna yang cukup tinggi. Beberapa flora diantaranya alang alang, tio tio, kasumeeto, nona, kayu angin, saninten, dan uwi, serta terdapat beberapa jenis satwa langka endemik antara lain anoa, kuskus, bajing perut merah, mandar Sulawesi, elang Sulawesi, dan maleo (BKSDA Sultra, 2006). Kondisi keanekaragaman hayati tersebut sangat
memungkinkan terdapatnya
keanekaragaman bakteri yang tinggi, salah satunya adalah bakteri amilolitik.
Bakteri amilolitik adalah jenis bakteri yang memproduksi enzim amilase dan mampu memecah pati. Genus bakteri yang termasuk kelompok bakteri amilolitik yang cukup dikenal luas ialah Bacillus, Clostridium, Bacteriodes, Lactobacillus, Micrococcus, Thermus dan Actinomycetes
(Reddy et al., 2003). Amilase merupakan kelompok enzim yang menghidrolisis pati dan glikogen. Dikenal tiga jenis enzim amilolitik yaitu αamilase, β amilase, dan glukoamilase. Enzim αamilase (EC. 3.2.1.1, α1,4 D glukan glukanohidrolase, endoamilase) adalah enzim yang menghidrolisis ikatan α1,4 glikosidik dari pati dan maltodekstrin secara acak dari bagian dalam molekul polisakarida menghasilkan maltosa dan beberapa oligosakarida rantai pendek (Ballschmiter
et al., 2006).
Umumnya αamilase yang dihasilkan dari bakteri memiliki stabilitas yang tinggi, yaitu stabilitas terhadap suhu dan pH ekstrim. Genus Bacillus merupakan sumber yang paling penting dalam industri
enzim karena menghasilkan αamilase yang bersifat termostabil (Cordeiro et al., 2002). Enzim amilase dari B. lentus, B. Coagulans, dan B. caldolyticus memiliki aktivitas optimum yang sama pada suhu 70oC (Fossi et al., 2005). Selain Bacillus, enzim yang disekskresi oleh Thermococcus profundus DT 5432 tahan terhadap pemanasan 90oC untuk selama 15 menit tanpa kehilangan aktivitas (Chung et al., 1995).
Enzim αamilase yang dihasilkan oleh bakteri banyak dimanfaatkan dalam industri, terutama industri makanan, minuman, tekstil, farmasi dan detergen. Hal ini karena umumnya amilase asal bakteri mempunyai aktivitas yang tinggi dan bersifat termostabil dibandingkan yang berasal dari fungi dan hewan. Sebagian besar industri, seperti industri makanan dan minuman menggunakan αamilase dari bakteri yang tahan terhadap asam (Corderio et al., 2002). Namun lain halnya dalam industri detergen, tekstil, dan farmasi yang justru menggunakan amilase basa atau alkali (Hagihara et al., 2001).
dari tanah di Taman Nasional Rawa Aopa Watumohai Sulawesi Tenggara.
,( - ( '( (+
Alat dan Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini, diantaranya; tanah dari ekosistem rawa Taman Nasional Rawa Aopa Watumohai, media nutrien agar
(NA), crystal violet, safranin, alkohol, amilosa murni, maltosa murni (larutan standar), Lugol iodine, nutrien fermentasi (Ekstrak ragi, (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, KH2PO4, pati, dan agar), larutan buffer pH 4, reagen DNS (Dinitrosalisilic acid, NaOH, dan Na K Tartrat), dan reagen Biuret.
Alat yang digunakan, diantaranya; autoklaf, laminar air flow, inkubator, pH meter, timbangan analitik, spektrofotometer UV vis, sentrifus, penangas air, pengaduk magnet, dan alat alat gelas yang umum digunakan di Laboratorium kimia, seperti: pipet volumetrik, pipet ukur, gelas kimia, gelas ukur, tabung reaksi, elenmeyer, gelas ukur, dan lain lain.
Pengambilan Sampel Tanah diperoleh kemudian dianalisis kondisi fisiknya (suhu, jenis tanah, warna tanah, dan pH). pH tanah diukur dengan mencampurkan 3,0 gram contoh tanah dengan 7,5 mL akuades (perbandingan 1 : 2,5). Sebelum diukur, tanah dan akuades diaduk dan partikel tanah dibiarkan mengendap. Bagian supernatan diukur pHnya menggunakan pH meter.
Isolasi dan Identifikasi Bakteri Amilolitik Asidofilik
Sebanyak 10% (b/v) tanah disuspensikan dalam akuades steril, kemudian diambil 0,1 mL larutannya lalu disebarkan dalam media NA dan diinkubasi pada suhu kamar selama dua hari. Koloni koloni bakteri yang tumbuh dikulturkan dalam media nutrien agar secara berulang ulang hingga diperoleh kultur murni.
Isolasi bakteri amiloltik asidofilk dilakukan dengan menumbuhkan setiap isolat bakteri pada media agar pati pH 4 dengan komposisi amilosa 1% (b/v), MgSO4.7H2O 0,05% (b/v), KCl 0,05% (b/v), pepton 0,6% (b/v), ekstrak ragi 0,2% (b/v), dan agar 2% (b/v) (Ekunsaumi.,
1990). Biakan diinkubasi pada suhu kamar. Setelah 48 jam koloni yang tumbuh digores kembali pada medium agar agar pati untuk disiapkan menjadi inokulum. Sisa koloni yang terdapat pada agar cawan ditetesi larutan iodium (komposisi KI 4,0 g, I2 4,0 g, akuades 600 mL) untuk pengamatan zona bening dan pengukuran indeks amilolitik (Fossi et al., 1995).
Isolat diidentifikasi berdasarkan ciri ciri morfologi koloni (warna koloni, elevasi/bentuk permukaan koloni, bentuk tepi koloni), pewarnaan Gram untuk mengetahui bentuk sel bakteri dan sifat Gram (Gram Negatif/Gram Positif) (Apun
et al, 2000).
Produksi dan Pemurnian α amilase
Sebanyak 10 lup inokulum bakteri amilolitik ditumbuhkan dalam 1000 mL media kaldu pati steril ber pH 4 dengan komposisi amilosa 1% (b/v), MgSO4.7H2O 0,05% (b/v), KCl 0,05% (b/v), pepton 0,6% (b/v), dan ekstrak ragi 0,2% (b/v) (Ekunsaumi., 1990). Produksi enzim dilakukan dalam bioreaktor dengan pengocokkan selama dua hari pada suhu kamar.
kecepatan 8500 rpm selama 15 menit pada suhu 4oC (Aiyer, 2004). Supernatan yang diperoleh dimurnikan lebih lanjut melalui fraksinasi (NH4)2SO4 20, 40, 60 dan 80% (b/v) dan didiamkan selama semalam pada suhu 4oC selanjutnya disentrifus (Fossi et al., 2005). Endapan yang diperoleh dari fraksinasi amonium sulfat didialisis dengan akuades selama 3 jam. Setelah itu didialisis lagi menggunakan buffer sitrat pH 4,0 selama 24 jam pada suhu 5oC dengan stirer (Safey dan Ammar, 2004).
Penentuan Aktivitas dan Kadar Protein Enzim
Sebanyak 1 mL enzim αamilase dicampur dengan 2 mL substrat (amilosa 1%, b/v dalam buffer pH 4) lalu diinkubasi selama 30 menit. Inkubasi dihentikan dengan penambahan 2 mL DNS (1 g asam 3,5 asam dinitrosalisilat, 20 mL NaOH 2 N, dan 30 g Na K Tartrat dalam 100 mL) kemudian dikocok dan dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit. Selanjutnya didinginkan dalam air es dan ditambahkan akuades sampai volumenya menjadi 10 mL. Setelah itu diukur absorbansinya pada panjang gelombang 550 nm. Blanko mendapat perlakuan yang sama dengan sampel, namun penambahan enzim dilakukan setelah campuran dipanaskan (Shaw et al., 1995). Satu unit aktivitas α amilase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang diperlukan untuk melepas 1 mol gula pereduksi/menit atau setara dengan 1 mol maltosa/menit (Aiyer, 2004). Penentuan kadar maltosa hasil hidrolisis didasarkan pada kurva larutan standar maltosa yang dibuat pada kisaran konsentrasi maltosa 0,1 – 1,0 mg/mL dengan selang 0,2 mg/mL.
Kadar protein enzim ditentukan berdasarkan metode Biuret, dengan cara mencampur 1 mL enzim αamilase dengan 4 mL reagen Biuret dan didiamkan selama 30 menit, kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. Standar
protein yang digunakan ialah bovin serum albumin (BSA) pada kisaran konsentrasi 1– 10 mg/mL dengan selang 2 mg/mL (Aiyer, 2004).
Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas α amilase
Pengaruh suhu terhadap aktivitas α amilase diukur dengan mencampur 1 mL enzim αamilase dengan 2 mL substrat (amilosa 1% dalam buffer pH 4) lalu diinkubasi selama 30 menit pada suhu yang bervariasi mulai 30 55oC. Setelah inkubasi, aktivitas αamilase kemudian ditentukan untuk mengetahui suhu optimumnya.
Pengaruh Konsentrasi Substrat (Amilosa) terhadap Aktivitas α amilase
Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas αamilase diukur dengan mencampur 1 mL enzim α amilase dengan 2 mL substrat (amilosa dalam buffer pH 4) pada konsentrasi substrat yang bervariasi mulai 0,25 – 2 % (b/v) lalu diinkubasi selama 30 menit. Setelah inkubasi, aktivitas αamilase kemudian ditentukan untuk mengetahui konsentrasi substrat optimumnya.
) + '(, )
Deskripsi Isolat Bakteri Amilolitik
Asidofilik dari Ekosistem Rawa Taman
Nasional Rawa Aopa Watumohai
Sulawesi Tenggara
rawa Taman Nasional Rawa Aopa Watumohai.
Tabel 1. Kondisi Sampel Tanah dari Ekosistem Rawa Taman Nasional Rawa Aopa Watumohai – Sulawesi Tenggara
Parameter Contoh Tanah
Tepi Rawa Dasar Rawa
Suhu (oC) 33 27
pH 6,4 6,0
Warna Tanah Coklat Tua Coklat Keabu abuan
Jenis Tanah Gambut Gambut
Jumlah Isolat Total 4 2
Jumlah Isolat Amilolitik 2 1
Keterangan: Pengambilan contoh tanah dilakukan pada Sabtu, 14 Juli 2007 pukul 11.35 11. 50 WITA
Bakteri amilolitik asidofilik ini diperoleh dengan menambahkan pati pada media agar ber pH 4. Penambahan pati ke dalam media tumbuh diharapkan dapat menginduksi sel sel bakteri untuk memproduksi dan mensekresikan enzim enzim eksraselulernya, khususnya enzim α amilase.
Dari ketiga isolat bakteri amilolitik yang diperoleh, dipilih satu isolat dengan indeks amilolitik terbesar. Indeks amilolitik ini ditentukan berdasarkan pembentukan zona bening di sekitar koloni bakteri. Zona bening ini terjadi karena enzim α amilase yang disekresikan oleh sel bakteri menghidrolisis molekul pati disekitarnya sehingga kompleks amilum iod dengan warna biru kehitaman (disebabkan oleh penambahan iodin ke dalam media) berkurang/hilang. Gambar 1 menunjukkan pembentukan zona bening dari salah satu koloni bakteri terpilih.
Gambar 1. Pembentukan Zona Bening pada Salah Satu Koloni Bakteri Terpilih.
Adapun indeks amilolitik dari ketiga isolat yang diperoleh, ditunjukkan pada Tabel 2.
Tabel 2. Indeks Amilolitik Isolat Bakteri Terpilih
Isolat Asal Indeks
Amilolitik (IA) TR 1 Tepi Rawa 0,44
DR 1 Dasar Rawa 0,33 TR 2 Tepi Rawa 0,20
Keterangan: TR 1 (Tepi Rawa 1), TR 2 (Tepi Rawa 2), dan DR 1 (Dasar Rawa 1).
Ketiga isolat bakteri dengan aktivitas amilolitik kemudian diidentifikasi lebih lanjut berdasarkan warna koloni, permukaan koloni, tepian koloni, bentuk sel dan sifat Gramnya. Hasil identifikasi isolat bakteri ini diperlihatkan pada Tabel 3.
Berdasarkan pengamatan morfologi koloni, ketiga isolat bakteri tidaklah memiliki ciri yang sama. Isolat TR 1 yang merupakan isolat bakteri dengan indeks amilolitik terbesar memiliki karakteristik bentuk koloni dengan permukaan cembung, tepian tidak rata, dan warna koloni kuning keruh. Isolat TR 1 ini merupakan sel Koloni
bakteri berbentuk batang dengan sifat Gram negatif. Isolat TR 2 memiliki karakteristik yang hampir sama dengan isolat TR 1, yang membedakannya hanyalah koloni isolat TR
2 yang berwarna putih serta aktivitas amilolitik yang lebih rendah. Berbeda dengan bakteri yang berasal dari dasar rawa (Isolat DR 1) dengan koloni berwarna kuning tua, tepian rata, dan permukaan
koloni cembung. Isolat DR 1 ini memiliki bentuk sel batang dengan sifat Gram positif. Identifikasi isolat sampai ketingkat spesies tidak dilakukan karena diperlukan pengujian lebih lanjut seperti sifat biokimiawi serta mikroskopisnya. Dari ketiga isolat bakteri amilolitik yang diperoleh, isolat bakteri TR 1 yang paling baik untuk memproduksi enzim α amilase karena memiliki indeks amilolitik terbesar.
Pemurnian dan Karakterisasi Enzim αααα
Amilase
Metode yang umum dilakukan dalam tahap awal pemurnian enzim adalah dengan menggunakan garam (salting out). Garam yang sering digunakan adalah amonium sulfat, (NH4)2SO4. Enzim α amilase diendapkan dengan penambahan (NH4)2SO4 dengan variasi konsentrasi 20, 40, 60, dan 80% (b/v) untuk melihat konsentrasi optimum (NH4)2SO4 dalam mengendapkan protein enzim. Pengaruh konsentrasi (NH4)2SO4 terhadap kadar protein serta aktivitas α amilase disajikan pada Gambar 2.
Tabel 3. Morfologi Isolat Bakteri Amilolitik Terpilih Isolat
Bakteri
Warna Koloni Permukaan Koloni
Pada Gambar 2 di atas, konsentrasi (NH4)2SO4 60% (b/v) telah mampu mengendapkan protein serta meningkatkan aktivitas enzim α amilase secara optimal. Hasil ini tidak jauh berbeda dengan yang dilaporkan oleh Shaw et al (1995), Safey dan Ammar (2004), dan Fossi et al (2005), dimana konsentrasi (NH4)2SO4 60% telah optimal dalam mengendapkan serta meningkatkan aktivitas enzim α amilase.
Enzim α amilase yang diperoleh melalui ekstraksi dengan (NH4)2SO4 60% belum murni karena masih mengandung sisa sisa garam. Oleh karena itu, enzim dimurnikan dengan dialisis untuk menghilangkan kelebihan garam. Enzim α amilase yang diperoleh pada setiap tahap pemurnian ini diukur aktivitasnya menggunakan substrat amilosa 1% pada pH 4,0. Dari serangkaian proses pemurnian enzim ini, terjadi peningkatan kadar protein serta aktivitas enzim α amilase yang sangat signifikan seperti yang ditunjukkan pada Tabel 4.
Berdasarkan Tabel 4, ekstraksi dengan amonium sulfat menghasilkan aktivitas spesifik 0,146 U/mg enzim dan tingkat kemurnian 3,8 kali dari ekstrak enzim kasar yang hanya memiliki aktivitas spesifik 0,038 U/mg enzim. Setelah dialisis, aktivitas spesifik α amilase meningkat
menjadi 0,255 U/mg enzim dengan tingkat kemurnian 6,7 kali dari ekstrak enzim kasar. Pengaruh konsentrasi substrat amilosa terhadap aktivitas enzim α amilase telah dilakukan pada rentang substrat 0,25 1,75% pada pH 4,0 dengan hasil seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3.
Aktivitas α amilase terus meningkat dari konsentrasi substrat 0,25% hingga mencapai optimumnya pada konsentrasi substrat 1,25% dengan aktivitas 0,0152 U/mL. Di atas konsentrasi substrat 1,25%, tidak terjadi lagi peningkatan aktivitas enzim dikarenakan konsentrasi substrat yang telah jenuh.
Aktivitas α amilase juga diuji pada suhu yang bervariasi dari 30oC sampai 55oC. Hal ini dilakukan untuk mencari suhu yang memberikan aktivitas optimum enzim α amilase pada pH 4,0 dengan konsentrasi substrat 1%. Hasil pengukuran pengaruh suhu terhadap aktivitas α amilase diberikan pada Gambar 4. Aktivitas enzim α amilase meningkat di atas suhu 30oC dan mencapai optimumnya pada suhu 45oC dengan aktivitas 0,071 U/mL. Aktivitas α amilase kemudian menurun di atas suhu 45oC akibat denaturasi enzim oleh panas.
Gambar 3. Pengaruh Konsentrasi Substrat terhadap Aktivitas α amilase
Gambar 4. Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Enzim α amilase
( ,'*+
Isolat bakteri amilolitik asidofilik terdiri atas tiga isolat, yaitu isolat TR 1, TR 2, dan DR 1. Dari ketiga isolat ini, isolat TR 1 memiliki aktivitas amilolitik tertinggi. Isolat ini memiliki warna koloni kuning keruh, permukaan koloni cembung, bentuk tepian koloni tidak rata, bentuk selnya batang dan bersifat Gram negatif. Selain itu, isolat ini tahan dan mampu hidup pada lingkungan asam dengan pH 4,0.
Aktivitas α amilase mencapai optimumnya pada konsentrasi substrat amilosa 1,25% (b/v) dan suhu 45oC. Aktivitas spesifik α amilase mengalami peningkatan pada setiap tahap pemurnian. α amilase dalam bentuk ekstrak kasar memiliki aktivitas spesifik 0,038 U/mg enzim, setelah ekstraksi dengan (NH4)2SO4 60% (b/v) aktivitas spesifiknya 0,146 U/mg enzim, dan setelah dialisis aktivitas spesifiknya menjadi 0,255 U/mg enzim.
8 '*
Aiyer, P.V.D., 2004, Effect of C:N Ratio on Alpha Amylase Production by Bacillus licheniformis SPT 27, African J. of Biotechnology, Vol 3 (10) : 519 522.
Apun, K., Jong, B.C., dan Salleh, M.A. 2000, Screening and Isolation of A Cellulolytic and Amylolytic Bacillus from Sago Pith Waste, J. Gen. Appl. Microbiol,Vol. 46: 263 267.
Ballschmiter, M., Futterer, O., dan Liebl, W. 2006, Identification and Characterization of a Novel Intracellular Alkaline α1Amylase
from The Hyperthermophilic
Bacterium Thermotoga maritima MSB8, Appl. and Env. Microbiol, Vol 72 (3) : 2206 2211.
BKSDA Sultra. 2006, Taman Nasional Rawa Aopa Watumohai, BKSDA Sulawesi Tenggara, Kendari.
0.05 0.052
0.064
0.048 0.041
9%9:;
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08
30 35 40 45 50 55
/ $1
6
/*
5
+
7
Chung, Y.C., Kobayashi, T., Kanai, H., Akiba, T., dan Kudo, T. 1995,
Purification and Properties of Extracellular Amylase from The
Hyperthermophilic Archaeon
Thermococcus profundus DT5432, Appl. Environ. Microbiol, Vol. 61(4): 1502 1506.
Cordeiro, C.A.M., Martins, M.L.L., dan Luciano, A.B. 2002, Production and Properties of α1Amylase from Thermophilic Bacillus sp., Braz. J. Microbiol. Vol 33 (1).
Ekunsaumi, T. 1990, Laboratory Production and Assay of Amylase by Fungi and Bacteria, UW, Washington Country.
Fossi, B.T., Tavea, F., dan Ndjouenkeu, R. 2005, Production and Partial Characterization of a Thermostable Amylase from Ascomycetes Yeast Strain Isolated from Starchy Soils, African J. of Biotechnology, Vol. 4 (1): 14 18.
Hagihara, H., Igarashi, K., Hayashi, Y., Endo, K., Ikawakitayama, K., Ozaki, K., Kawai, S., dan Ito, S. 2001,
Novel α1Amylase That Is Highly Resistant to Chelating Reagents and Chemical Oxidants from The Alkaliphilic Bacillus Isolate KSM1 K38, Applied and Environmental Microbiology, Vol 67 (4) : 1744 1750.
Reddy, N.S., Nimmagadda, A., dan Rao, K.R.S.S. 2003, An Overview of The Microbial α1Amylase Family, African J. of Biotechnology. Vol 2 (12) : 645 648.
Safey, E.M. dan Ammar, M.S. 2004,
Purification and Characterization of α1amylase Isolated from Aspergillus
falvus var.columnaris, Ass. Univ. Bull. Environ. Res. Vol. 7 No. 1.
