PERCOBAAN PENUMBUHAN KALUS AGAVE AMANIENSIS TREL. & NOWELL SERTA DETEKSI STEROIDNYA Repository - UNAIR REPOSITORY

S K R I P S I

SET 1 A D E W I W U L A N S A R I

P E R C O B A A N P E N U M B U H A N K A L U S

A G A V E A M A N I E N S I S T REL. & N O W E L L

S E R T A DET EK SI S T E R O I D N Y A

FAKULTAS FARMAS1 UNIVERSITAS AIRLANGGA

PERCOBAAN PENUMBUHAN KALUS

AGAVE AMANIENSIS TREL. & NOWELL

SERTA DETEKSI STEROIDNYA

SKRIPSI

DIBUAT UNTUK MEMENUHI TUGAS AKHIR

MENCAPAI GELAR SARJANA FARMASI

PADA FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS AIRLANGGA

Disetujui oleh pembimbing

D_R/ NQOR._IFA_NSYAH

untuk yang tercinta

mas ton

dan

sahabat-sahabatku

myr, ran* et, mar, rin.

KATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur eaya panjatkan pada Allah swt

yang melimpahkan rahmatNya, sehingga saya dapat raenyele -

saikan tugas untuk menyusun skripsi ini sebagai salah satu

syarat mencapai gelar sarjana pada Fakultas Farmasi Univer

sitas Airlangga.

Hasil yang diperoleh dari skripsi yang berjudul "Per-

cobaan Penurabuhan Kalus Agave amaniensis Trel. & Nowell

'serta Deteksi Steroidnya" ini, sangatlah sederhana dan ja-

uh dari sempurna. Naraun demikian, harapan saya, seraoga ha­

sil sederhana yang diperoleh ini dapat bermanfaat sebagai

langkah awal untuk penelitian-penelitian selanjutnya.

Untuk itu perkenankanlah pada kesempatan ini saya me-

nyampaikan rasa terima kasih yang tulus dan sedalam-dalam-

nya kepada :

Bapak DR. Noor Ifaneyah, Bapak DR. Gunawan Indrayanto

serta Ibu Dra. Isnaeni MS sebagai pembimbing yang telah

berkenan meluangkan waktu untuk membimbing, memberikan sa-

ran, pengarahan dan semangat serta dorongan moral yang sa-

ngat berharga selama saya melakukan penelitian hingga se -

lesainya penulisan skripsi ini,

Kepala Kebun Raya Cabang Purwodadi - Pasuruan Jawa

Timur yang telah membantu memberikan tanaman sebagai bahan

Ketua Jurusan Biologi Farmasi dan Laboratorium Bio -

teknologi Fakultas Farmasi Universitas Airlangga yang te-

lah menyediakan fasilitas seiaraa penelitian.

Tidak lupa pula kepada bapak dan ibu dosen, rekan-

rekam mahasiswa serta semua pihak yang tidak dapat saya

sebutkan satu per satu yang telah dengan tulus ikhlas mem-

berikan dorongan moral dan bantuan, juga kepada para kar-

yawan jurusan biologi farmasi yang telah membantu kelancar-

an penelitian ini, saya sampaikan rasa terima kasih yang

tulus pula.

Terakhir kepada suami saya, atas dukungan moral dan

pengertiannya demikian juga kepada sahabat-sahabat saya,

saya sangat berterima kasih.

Semoga segala amal baik yang telah diberikan ter^ebut

.mendapat balasan yahg melimpah dari Allah sv/t,

Arnin.

Surabaya, Januari 1988

DAFTAR ISI

II. TINJAUAN PUSTAKA 1. Tinjauan tentang kultur jafcingan tanam-an ... ... ... ...

5

1.1. Media Kultur jaringan tanaraan .... ... 6

1.2. Hormon p«rtumbuhan tanaman ... 7

1.3. Teknik kultur jaringan tanaraan untuk produksi metabolit eekunder ... ... 8

2. Tinjauan tentang steroid ... 11

2.1. Deteksi steroid ...

13

Halaman

2. Alat- alat yang digunakan ... ...18

3

. Metode penelitian ... ...18

3-1. Pembuatan media ... ... ...18

3.2. Penanaman eksplan ... .... 2k

3*3# Pemeriksaan kalus yang terbentuk.. 27

3**+.. Pemeliharaan kalus yang telah

tum-buh ... .... 27

3.5. Deteksi steroid dari kalus ... .... 28

3.5*1. Reaksi warna pada ekstrak

kloroforra ... ... .... 23

3.5*2. Analisis kualitatif dengan

kromatotfrafi lapis tipis ..

29

IV. HASIL PENELITIAN

1. Pemeriksaan kalus yang terjadi ... .... 31

2. Subkultur kalus A,flave amaniensis Trel. &

Nowell ... '... ....

35

3. Deteksi steroid dalara kalus ... ... 36

3*1. Hasil reaksi warna Salkowski •••••• 36

3.2. Hasil reaksi warna Liebermann-.

Burchard ... .... 37

3.3. Hasil kromatografi lapis tipis

ter-hadap ekstrak kloroform ... ....

38

V. PEMBAHASAN

1. Penumbuhan kalus ... ...

^7

1

.

1

. Pemilihan eksplan ... .... t+7

1.2. Pemilihan media uatuk penanaman eks­

plan ... ....

^7

2. Deteksi steroid ualara kalas ... ... 50

Halaman

VII. SARAN' - SARAN ... . /...

53

VIII. RINGKASAN ...

54

DAFTAR TABEL

I. Komposisi kimiawi media hurashige &

Skoog ...

21

II. Korabinasi dan kadar hormon pertum

-buhan yang ditambahkan pada media MS

untuk pcnumbuhan kalus Agave amanien

sis Trel. & Nowell ... 22

III. Kombinasi hormon pertumbuhan yang

dapat menumbuhkan kalus Agave ama

-niensis Trel. & Cowell ... 32

IV. Pemeriksaan makroskopis kalus Agave

amaniensis Trel. Sc Nowell ... 3*t

V. Hasil reaksi warna ekstrak kloroform

dengan pereaksi Salkowski ... 3?

VI. Hasil reaksi warna LiebermannBur

-chard terhadap ekstrak kloroform ...

38

VII. Hasil kromatografi lapis tipis eks­

trak kloroform kalus Agave

amanien-sis Trel. & Nowell ... 39

VIII. Hasil kromatografi lapis tipis eks­

trak kloroform knave amaniensia

Trel. & Nowell ... i+3

IX. Jenis steroid yang terdeteksi dalam

kalus Agave amaniensirs Trel. & Nowell i

+6

DAFTAR GAMBAR

1. Skema langkah-langkah produksi

meta-bolit sekunder ...

10

2. Skema pembagian sapogenin steroid •• 12

3. Agave amaniensis Trel. & Nowell ... 15

b, Agave a m a n i o n s l G Trel* & Nowell beru.

mur

1 - 2

bulan yang digunak'an seba-

gai sumber eksplan ...

17

5. Skema pembuatan media ... 20

6

. Daun Agave amaniensis Trel, & Nowell

yang akan ditanam pada media •••«•• 25

7. Penanaman eksplan pada media ... 26

8

* Kalus Agave amaniensis Trel, & Nowell 35

9. Sel-sel kjilus Agave amaniensis Trel.

& Nowell ... 36

10, Kromatogram ekstrak kloroform kalus

Agave amaniensis Trel. & Nowell ...

41

11. Kromatogram ekstrak kloroform

Agave amaniensis Trel. & Nowell ,,. kb

BAB I

PENDAHULUAN

Penelitian-penelitian dalam bidang kultur jaringan ta

naman dimulai sejak keberhasilan White dan Gautheret pada

tahun 193^• ( ). Keberhasilan mereka ialah ber

-hasilnya dibuat suatu kultur kalus, dan kultur akar dari po

tongan jaringan tanaman tinggi pada media buatan. (

1

,

2

,

3

>

4 )

Menurut Koblitz, kultur jaringan tanaman dapat didefi

nisikan sebagai potongan jaringan dari tanaman yang ditum-

buhkan dalam kondisi steril pada media buatan dimana sel -

selnya marapu mengadakan pembelahan dan pertambahan massa

•plasma. ( k )

Berdasarkan teori sel dan teori totipotensi sel, bah-

wa sel merupakan unit terkecil kehidupan yang mampu menga­

dakan aktifitas dan bila sel tumbuhan ditanam pada media

yang sesuai akan mampu tumbuh menjadi tanaman dewasa. (

6

)

Maka dari itu teknik kultur jaringan tanaman ini dapat di-

pakai sebagai teknik pembudidayaan tanaman dengan kandung-

an metabolit sekunder yang tinggi. ( 7 ). Keuntungan- ke-

untungan dari teknik ini adalah kultur bebas dari pengaruh

mikroba, kondisi dapat dikontrol sehingga produk-produk

tertentu dapat dihasilkan sesuai dengan keinginan serta

tidak tergantung pada iklim dan letak geografis. (

7,8

)

jaring-an tjaring-anamjaring-an dapat dipengaruhi oleh faktor fisika aeperti u-

sia kultur, cahaya atau oleh faktor kimia seperti raacam

dan konsentrasi nutrien atau hormon pertumbuhan yang ditam

bahkan pada media atau kapasitas biosintesis pada kultur,

(

7*9

)• Karena itu produksi metabolit sekunder dari kul -

tur jaringan tanaman dapat lebih besar, sama atau lebih ke

cil daripada tanaman induknya, Kadang-kadang dapat berbeda

atau bahkan kultur tersebut tidak rnampu menghasilkan meta­

bolit seperti tanarnan induknya. ( 8,9 )• Dalam kultur ja -

ringan tanaman, metabolit sekunder’ yang terdapat antara

lain : alkaloid,flavonoid, steroid, tanin, asam-asam orga-

nik dan lain-lain. ( U,

5»9

)•

Untuk produksi metabolit sekunder dalam skala besar,

dilakukan suatu kultur suspensi. Adapun tahapan-tahapan

dalam perabuatan kultur suspensi adalah sebagai berikut :

pertama dibuat kultur kalus dari potongan jaringan tanaman

yang mengandung metabolit sekunder tertentu pada media pa-

dat, baru kemudian kalus yang didapatkan tadi dipindahkan

ke dalam media cair dan diagitasi dengan rpm tertentu. (i*,

7,10 )

Selain untuk langkah awalpada produksi skala besar,

ternyata pada kalus dc*pat diproduksi metabolit sekunder

yang lebih bervariasi dibanding kultur suspensi. (

8

)

Hal ini dapat terjadi karena kondisi lingkungan yang sa -

ngot berbeda bila sel-sel tanaman ditumbuhkan secara in

vitro dibundingkan dengan sebelumnya di alam. (

10

)

menjadi kalus bila kebutuhan akan makronutrien, mlkronu -

trien, vitamin-vitarain dan suplemen organiknya telah ter-

penuhi serta pengaruh macam dan konsentrasi horrnon pertum-

buhan dari golongan auksin dan sitokinin yang ditambahkan

pada media tersebut. ( 1,2,3j6>9>10 ). Pada penelitian

yang dilakukan oleh Weier et al. 197*f ( 11 ), penambahah

auksin dan sitokinin dalam konsentrasi tertentu akan ter-

bentuk kalus pada kultur jaringan batang terabakau*

Permasalahan n£ Limbul pada pembuatan kultur kalus

ini terletak pada bagaimanakah raenentukan komposisi dan

konsentrasi horrnon auksin dan sitokinin yang tepat yang

harus ditambahkan pada media dasarnya. Selain itu apakah

metabolit sekunder yang diproduksi kultur kalus dapat sama,

berbeda atau bahkan tidak ada sama sekali seperti pada ta­

naman induknya. Untuk mengetahui hal tersebut, tahapan yang :

perlu dilakukan adalah perabentukan kalus dari eksplan kemu-

dian baru dilakukan deteksi pada kalus tersebut.

Penelitian-penelitian terhadap tanaman dengan kandung-

an metabolit sekunder steroid dengan teknik kultur jaring­

an tanaman telah banyak dilakukan, seperti pada Solanum s p p

Dioscorea s p p. Digitalis s p p. Apocvnum cannabinum dan

Yucca glauca ( 5 )• Namun penelitian-penelitian terhadap

tanaman jenis Agave dengan teknik kultur jaringan tanaman

masih belum banyak dilakukan. ( )

Dari skrining yang telah dilakukan, tanaman dari jenis

Agave mengandung sterol, diosgenin, hekogenin dan lain-lain.

Berdasarkan hal tersebut di atas, raaka pada peneliti­

an ini akan dicoba untuk menumbuhkan kalus dari Agave ama-

niensis Trel, & Nowell pada media dasar MS dengan penambah

an hormon auksin dan sitokinin, keroudian dilakukan deteksi

steroid dalam kalus yang tumbuh,

Dalam penelitian yang dilakukan oleh Blunden et al.

( 15,16 ), kandungan steroid 'yang paling banyak pada bagi-

an pangkal daun. Maka untuk penelitian ini sebagai sumber

eksplan ( potongan jaringan ), digunakan juga bagian pang­

kal daun Agave amaniensis Trel. & Nowell,

Diharapkan dari hasil penelitian ini dapat bermanfaat

sebagai langkah awal untuk penelitian-penelitian selanjut-

nya dalam penerapan metode kultur jaringan tanaman untuk

BAB IX

TINJAUAN PUSTAKA

I . Tin.iauan tentang kultur laringan tanaman

KuXtur jaringan tanaman oXeh Koblitz. ( i* ), dide -

finisikan sebagai potongan jaringan tanaman yang dipi -

sahkan dari lingkungan alamiahnya dan ditumbuhkan pada

'media buatan dalam kondisi steril, di mana sel-selnya

dapat mengadakan pembelahan dan pertambahan plasma.

Keberhasilan penelitian-penelitian yang dilakukan oleh

Gautheret, Nobecourt dan White pada tahun 1939 dalam

percobaan pembuatan kultur kalus, mengawali penelitian

berikutnya dalam bidang tersebut.(

3

, 4,5,17 )

Kultur kalus adalah suatu kultur sel-sel yang ti -

dak terdiferensiasi menjadi org^n-organ seperti tanaman

induknya* (1,2,3,4,5,8,9,10,17 K Hal yang menarik dari

kalus ialah bahwa ia dapat atau mampu tumbuh dan berkem

bang menjadi tanaman baru seperti tanaman induknya apa-

bila dipindahkan pada media baru yang komposisinya con-

cok dan tergantung pula pada hormon pertumbuhan yang

ditambahkan.

Selain kultur kalus, dikenal pula kultur suspensi

yaitu sel-sel kalus yang ditanam pada media cair*(

5,10

)

Dibandingkan dengan teltnik propagasi tanaman seca-

ra konvensional,teknik kultur jaringan tanaman mempu. -

ter-kontrol dapat diproduksi senyawa-senyawa tertentu sesuai

keinginan, kultur bebas dari pengaruh mikroba dan ^nsekfca,

sel dapat memproduksi senyawa-uenyawa spesifik, biotrans -

forraasi senyawa tertentu menjadi senyawa yang berguna da -

lam bidang farmasi / medis, dapat dilakukan dimana saja ti

dak tergantung letak geografis dan iklim, seleksi strain

tanaman unggul atau tanaraan dengan metabolit tinggi dan

dapat untuk multiplikasi tanaman secara cepat dan seragam.

( 7,8,9,18 )

l.i. Media kultur .jaringan tanaman ( 1,2,3»)

Keberhasilan teknik kultur jaringan tanaman sa-

ngat tergantung pada media yang digunakan dan yang pa

ling penting adalah penambahan horrnon pertumbuhan da­

ri golongan auksin dan sitokinin* Kebutuhan akan hor-

mon-hormon ini juga tergantung pada spesies dan kul­

tur yang akan dibuat • Kebutuhan nutrien dari kultur

jaringan tanaman terdiri atas :

- makronutrien, seperti N, P, K, Ca, Mg, S

- mikronutrien, sepertiFe, Mn, Zn, B, Cu, Co, Mo

- sumber karbon, biasa dipakai adalah sukrosa untuk

mengganti karbon yang didapat tanaman normal dari u-

dara secara fotosintesis

- suplemen organik, seperti vitamin, asam amino

- hormon pertumbuhan, golongan auksin ( IAA, NAAj^ ^ - D )

golongan sitokinin ( Kinetin, BA )

Media MS ( Murashige dan Skoog, 1962 ) telah

jaringan tanaman setelah keberhasilannya menu.iibuh-

kan kalus Nicotiana tabacum dengan berat kering

kalus 167 % lebih besar daripada bila digunakan me­

dia yang pertama kali digunakan oleh Hildebrandt

e t 1 9 4 6 . ( 1 ) .

Murashige dan Skoog menyatakan bahwa pH media

dibuat

5.7

-

5>8

sebelum disterilisasi secara oto-

klaf pada 121°C selama 20 menit, karena pada keada-

an tersebut komponen-kornponen media berada dalarn

bentuk terlarut. Disamping itu penelitian Mann et

al. menunjukkan bahwa pengaturan pH pada 5»7 sete­

lah diotoklaf pada 121°C selama 20 menit pH media

menjadi 5*0. ( 1 ). Hal ini juga berkaitan dengan

pemadatan media oleh agar, karena di b;-.wah pH 5>0

agar tidak dapat berbentuk padat. (

1

,

2

)

Sebagai sumber karbon yang biasa dipakai ada-

lah sukrosa. Gautheret pada 1959 mencoba beberapa

sumber karbon lain seperti galaktosa, maltosa, ma-

nosa dan laktosa pada kultur jaringan tanaman. Ter-

nyata penggunaan sukrosa lebih baik, karena setelah

media diotoklaf pada 121°C selama 20 menit, akan

terhidrolisa menjadi glukosa dan fruktosa yang di-

butuhkan oleh kultur,

1*2. Hormon pertumbuhan tanaman ( 1,2,3**+ )

Dalam kultur jaringan tanaman, yang dimaksud

dengan hormon pertumbuhan adalah zat pengatur tum­

( IAA, NAA dan 2,i+-D ) dan golongan sitokinin ( Ki-

netin, BA ). Selain itu sebagai zat pengatur tumbuh

juga kadang-kadang ditambahkan cairan dari buah-

buahan, kasein hidrolisat dan ekstrak ragi.

IAA ( asam indolasetat ) merupakan auksin alara

dan selalu terdapat dalam tanaman dan berperan da­

lam perpanjangan

6

el. Dalam kultur jaringan tanara­

an, auksin baik alam maupun sintetis berperan da­

lam pembentukan kalus dari eksplan. Golongan auk­

sin sintetis seperti NAA ( asam naftalenasetat )

dan ( asam

2

,

4

-diklorofenoksiasetat ) dapat

ditambahkan dalam konsentrasi yang lebih rendah

daripada IAA- 2,i+-D adalah yang paling poten di an-

tara ketiga senyawa tersebut.

•Golongan hormon yang lain yaitu sitokinin. Pe­

ngaruh horrnon ini dalam kultur merangsang pembelah-

an sel. Peranan hormon-hormon auksin dan sitokinin

selain menginduksi pembentukan kalus, perpanjangan

dan pembelahan sel, juga mempengaruhi pembentukan

metabolit dalam sel. Pengaruh ini bervariasi ter­

gantung pada konsentrasi, stabilitas dan metabolis-

me dalam jaringan selama kulturisasi. (

6

).

1

.

3

* Teknik kultur jaringan tanaman untuk produksi me­

tabolit sekunder

Teknik kultur jaringan tanaman diterapkan un­

tuk men^ataBi.macalah-masalah yang timbul pada pro­

di mana biasanya metabolit sering diakumulasi pada

bagian tertentu dari tanaman. Dengan adanya kondi­

si lingkungan yang berbeda dari kondisi tanaman a-

ealnya, sel-sel tanaman pada kultur jaringan dapat

memproduksi senyawa yang berbeda macam dan kadarnya

atau bahkan sama sekali tidak dapat memproduksi

metabolit seperti tanaman induknya. (

9

»

10

)*

Untuk memproduksi metabolit sekunder dalam

skala besar dipakai sistem kultur euspensi atau

kultur fermentor. Adapun tahapan-tahapan dalam pera-

buatan kultur suspensi adalah sebagai berikut se­

Tanaman asal

Pendispersian pada media cair

Suspensi sel

Optimasi kondisi untuk mendapatkan

pertumbuhan yang maksimal

v j U

Induksi pembentukau metabolit sekunder

4

^

Seleksi klonal untuk mendapatkan

'cell line* dengan produktifitas

maksimal

. Optimasi media untuk produksi

metabolit sekunder

Suspensi sel

( rmedia produksi skala besar

ferrnentor / bioreaktor )

Gambar 1. Skeraa langkah-langkah produksi metabolit

Dalam kultur jaringan tanaman, horrnon pertum -

buhan yang digunakan dapat berpengaruh terhadap pro

duksi metabolit sekunder. Pada kultur Trigonella

foenum-graecum. hormon kinetin dan IAA dapat mensti

mulasi produksi sitosterol dan stigmaeterol• Dalam

sel-

6

el Trigonella foenum-graecum. kinetin menaikkan

pertumbuhan sedangkan 2,if-D menaikkan konsentrasi

sterol dan pertumbuhan. ( 9 ) • Pada penelitian yang

dilakukan oleh Rokem et $

1

., kadar diosgenin dalam

kultur Dioscorea deltoidea dapat ditingkatkan deng­

an modifikasi komponen media dan hormon pertumbuhan

pada media MS, ( 18 )

2. Tinjauan tentang steroid

Secara umum steroid adalah senyawa organik yang mem

punyai kerangka inti jperhidrosiklopentanofenantren,

dengan substituen metil pada atom C-10 dan atom C-IJ,

( 14 ). Secara garis besar steroid dibagi dua golongan

yaitu : steroid dengan atom karbon tidak lebih dari

21

,

disebut steroid sederhana dan steroid dengan atom kar -

bon lebih dari

21

, misalnya sterol, sapogenin steroid,

alkaloid steroid dan lain-lain.(

6

)

Sterol yang terdapat dalam kultur jaringan tanam­

an dikenal sebagai fitosterol, dan yan^ paling banyak

ditemukan adalah sitosterol dan stigmasterol. (

9

)

Dalam tanaman, sterol dapat mengalami transformasi men­

jadi saponin steroid. Saponin dapatberupa glikosida

triterpenoid atau glikosida steroid, ( 9 ). Sapogenin

steroid merupakan gugus aglikon dari glikosida steroid,

Berdasarkan cabang cincin yang tidak mengandung atom

nitrogen ( cincin spiroketal ) dan cincin yang mengan­

2

.

1

. Deteksi steroid

Untuk mendeteksi steroid dalam tanaman dipakai

prosedur yang cepat, sederhana dan dengan sedikit

peralatan. ( 19 ). Namun kerugian metode tersebut ia-

lah tidak dapat membedakan sterol dan sapogenin ste -

roid. ( 6,19 ). Untuk itu, perlu dilakukan hidrolisa

dengan HC1 2H d;.n analisis dilakukan terhadup ekstrak

kloroform. ( 19 )

2.1.1. Kromatografi lapis tipis ( 20,21,22 )

Kromatografi adalah teknik pemisahan ber-

dasarkan perbedaan kecepatan migrasi masing-

masing komponen pada fase diam di bawah penga­

ruh suatu pelarut yang bergerak. (

20

)

Pada kromatografi lapis tipis fase diam berupa

suatu lapis tipis dengan ketebalan tertentu pa

da suatu lempeng*

Adapun mekanisme pemisahan terjadi seca­

ra adsorpsi, partisi,pertukaran ion ataupun

filtrasi, tergantung pada adsorben yang dipa -

kai dan jenis pelarutnya. Pada umumnya mekanis

me yang terjadi adalah adsorpsi dan partisi.

( 20 ,21,2a )

Untuk analisis kualitatif, kromatografi

lapis tipis dapat membedakan campuran zat atas

3* Tin.lauan tentang tanaman Agave

3.1. Penvebaran. habitus dan klasifikasi

Agave tumbuh tersebar di ciaerah tropis dan

subtropis. Di Indonesia Agave ditanam sebagai ta­

naman hias. (

23

*

24

»

25

)

Agave mempunyai tanda-tanda raorfologi :

Merupakan tanaman herba tegak, kuat, daun ter-

susun roset, bertulang daun sejajar, daun berben-

tuk lansot, sedikit berbentuk talang, tebal berda-

ging. Daun berwarna biru atau hijau kelabu, kadang-

kadang bertepi putih. Tepi daun ada yang berduri

dengan jarak 1 - 2 cm. Pada ujung daun tumbuh duri

yang berwarna coklat hitam, panjang

1 - 2

cm.

Klasifikasi Agave amaniensls Trel. & Nowell

adalah sebagai berikut : ( 26 )

Divisi s Spermatophyta

Anak divisi : Angiospermae

Kelas : Monocotyledoneae

Bangsa : Liliales

Suku : Amaryllidaceae

Marga : Agave

Jenis : Agave amaniensis Trel. Sc Nowell

Pada halaman berikut dapat dilihat bentuk ta­

Gambar 3* Agave amaniensis Trel., & Nowell,

3*2. Kandungan kimia Agave amaniensis Trel. & NOwell

Agave amaniensis Trel. & Nowell mempunyai kan-

dungan kimia sapogenin steroid diosgenin, tigogenin,

hekogenin dan sterol serta senyawa steroid lain

METODE PENELITIAN BAD III

1. Bahan penelitian

1.1. Bahan kimia

Semua bahan kimia yang dipergunakan untuk

pembuatan media adalah produksi E. Merck Darmstadt,

dengan derajad 'pro analisa', kecuali apabila diee-

butkan lain. Hormon 2,4-D yang digunakan produksi

Sigma. Agar yang digunakan adalah Difco Bacto-Agar,

'Difco' certified, buatan Difco Laboratories -

Detroit Michigan USA. Steroid pembanding sitosterol

dan hekogenin produksi Sigma serta diosgenin pro­

duksi E. Merck Darmstadt.

-1.2. Potongan .jaringan ( eksplan )

Potongan jaringan berasal dari pangkal daun

Agave amaniensis Trel. & Nowell, berumur 1-2 bulan,

yan& diperoleh dari Kebun Raya Cabang Purwodadi -

Pasuruan Jawa Timur. Pada halaraan berikutnya da -

pat dilihat Agave amaniensis Trel. & Nowell yang

Gambar Z+* Agave amaniensis Trel. & Nowell

berumur

1-2

bulan yang diguna -

kan sebagai sumber eksplan,

1.3. Media

Media ysng digunakan dalam penelitian ini ada-

lah media standar Murashige & Skoog, 1^62 ( media

MS ) yang terdiri atas makroelemen, mikroelemen,

vitamin, suplemen organik dan hormon pertumbuhan

dari golongan aukuin dan aitokinin*

IComposisi media MS yang digunakan dalara pe­

nelitian ini tertera pada tabel 1. Sedangkan kode

media, kombinasi dan kadar hormon pertumbuhan ter­

2* Alat-alat yang digunakan

pll-meter Fisher untuk mengatur pH larutan media.

Otoklaf

?3

1 ( American Portable Autoclave '.'/AF Co

Inc. ), untuk sterilisasi media dan air suling.

Laminar air flow cabinet digunakan untuk pengerja-

an 'aseptis.

Kieselgel 60 F

?_5k

( E. Merck, Darmstadt ).

3« Metode penelitian

3*1* Pembuatan media

Semua bahan kimia komponen media Muranhige &

Skoog ( MS ) dibuat dan disimpan dalam bentuk la­

rutan stok, kecuali mio-inositol dan sukrosa. Da­

lam penelitian ini media dibuat 'padat dengan pe -

nambahan agar

1%*

Pembuatan media padat dalam per-

cobaan ini sesuai dengan metode Murashige & Skoog

dalam Bhojwani, 1983 (!)• Untuk masing-masing kom­

ponen media dasar MS dibuat stok dengan konsentra­

si sebesar 100 kali jumlah yang tertera pada ta -

bel I, Jadi untuk memperoleh media dengan volume

dari masing-masing larutan stok diambil

10

ml, di-

tambah

100

mg mio-inositol dan

30

g sukrosa ; di-

tambnh hormon yang tergantung pada konsentrasi

dan macam yang digunakan dalam percobaan, kemudi-

an ditambahkan air culing samp^i volume lebih-ku-

rang tiga per emnat volume akhir dan pH larutan

diatur antara

5,7

-

5,6

dengan penambahan larutan

NaOH 0,1 N atau larutan HC1 0,1 N. Setelnh ditam-

bah agar

10

g, volume dibuat menjadi

1

liter de­

ngan menambahkan air suling. Kemudian campuran

tersebut dipanaskan cambil diaduk sampai jernih.

Larutan dituang ke dalam botol-botol kultur, ma -

sing-macing sebanyak lebih-kurang i

+0

ml, kemudian

ditutup rapat-rapat dengan aluminium foil dan di-

sterilkan dalam otoklaf 121°C selama 20 menit.

Media disimpan dalam ruang bersuhu 20 - 25°C bila

tidak dipakai. Untuk lebih jelasnya, pembuatan me­

dia tersebut di atas dapat dilihat pada skema be­

rikut ini ( gambar

5

)> komposisi hormon dan kode

Larutan stok

komponen media MS

dengan konsentrasi

100

kali

i

Masing-masing diambil 10 ml

Ditambah 100 mg mio-inositol

i

Ditambah 30 g sukrosa

i

Ditambah hormon pertumbuhan

( jumlah sesuai dengan macam

yang akan dibuat untuk perco

baan )

Ditambah air suling

Tabel II. Kombinasi aan kadar hormon pertumbuhan yang di-

tambahkan pada media MS untuk periumbuhan kalus

Agave amaniensis Trel. & Nowell

Keterangan :

0

= untuk setiap rnacam media dibuat

5

<

botol

= tidak ditambahkan hormon tersebut

K = kinetin

BA ss benziladenin

2

,if-D = asam

2

,if-diklorofenoksiasetat

XAA = asam indolasetat

NAA- = asam naftalenasetat

3*2. Penanaman eksplan

Penanaman eksplan Agave amaniensis pada media

dilakukan sesuai dengan metode yang dikemukakan oleh

Reinert dan Yeoman (

6

) sebagai berikut : pangkal

daun Agave amaniensis muda-yang akan dipakai sebagai

eksplan dicuci bersih dengan air suling, kemudian di

rendam dalam alkohol 90

%

seloma 2 menit. Setelah

itu disterilkan dalam larutan pensteril •Clorox1 4 0$

( 'Clorox' 100% mengandung NaOCl 5,25$ sebagai bahan

aktifnya ) selama 4 menit, dsn dicuci / dibilas de­

ngan air suling steril 3 - 5 kali untuk menghilang-

kan sisa-sisa larutan pensteril, Hssplan yang telah

steril dipotong-potong dengan ukuran + 1 x 0 , 3 cm

dan ditanam pada media MS dengan berbagai komposisi

dan konsentrasi hormon pertumbuhan yang berbeda-be -

da. Semua pekerjaan ini dilakukan secara aseptis da­

lam *laminar air flow cabinet1* Botol'kultur yang te

lah berisi / ditanami eksplan tersebut disimpan da­

lam ruang bersuhu 20 - 25°C. Gambar 6 * berikut ini

menunjukkan daun Agave amaniensis muda ( gambar 6A ),

i

dan gambar 6B, potongan melintang daun yang berukuran

±

1 X 0,3 cm. Sedangkan gambar 7. menunjukkan cara

penanaman eksplan pada media, yaitu dengan cara me-

nempatkan eksplan diatas media dengan raenggunakan

Gambar

6

. Daun Agave amaniensis vane akan

ditanam pada media.

Keterangan :

A : bagian daun yang dipakai untuk eksplan

Gambar 7, Penanaman eksplan pada media,

Keterangan :

penanaman dilakukan dengan cara meletakkan

eksplan steril di atas media padat dengan

satu sisi potongan melintang daun / ekplan

3.3* Pemeriksaan kalus yang terbentuk

Kalus dinyatakan terbentuk, apabila terbentuk

suatu massa sel yang tidak terorganisasi atau tidak

terdiferensiasi menjadi organ tanaman induknya.

( 1,2,3 )

Kalus yang tumbuh mempunyai tokstur kompak atau ra-

puh dan dapat bervvarna kekuningan, putih, hijau atau

hitam, ( 3 )• Kemudian untuk melihat sel-sel kalus

yang terbentuk dilakukan pemeriksaan mikroskopis.

Pemeliharaan kalus yang telah tumbuh

Untuk pemeliharaan dan perbanyakan kultur kalus

dilakukan subkultur yaitu kalus dari satu botol kul­

tur dipindahkan ke beberapa media segar ( 3), de­

ngan cara sebagai berikut :

botol kultur yang berisi kalus dibuka tutup alumini-

umnya kemudian mulut botol diflambir dengan lampu

spiritus. Dengan menggunakan skalpel steril, kalus

dipindahkan ke dalam botol yang berisi media segar.

Setelah diisi kalus, botol media segar tersebut ditu

tup dengan aluminium foil kembali setelah diflambir

dengan lampu spiritus. Pekerjaan ini dilakukan dalam

3*5. Deteksi steroid dari kalus ( 6 )

Kalus yang terbentuk dipisahkan dari media agar

yang menempel* Setelah dikeringkan dalam lemari pe-

ngering atau.lampu pengering pada suhu 40 - 60°C, di

serbuk dan dihomogenkan. Kemudian serbuk kalus terse

but ditimbang 1 g dihidrolisis dengan 2 0 ml asam klo

rida 2 N pada suhu 100°C selama.dua jam, setelah di-

ngin dinetralkan dengan natrium' hidroksida 1 N dan

disaring. Filtrat yang didapat diekstraksi dengan

i

kloroform tiga kali menggunakan corong pisah. Residu

hasil hidrolisis setelnh dikeringkan dalam lemari pe

ngering bersuhu 40 - 60°C, direfluks tiga kali sela­

ma dua jam dengan 30 ml kloroform kemudian disaring,

Filtrat yang didapat dicampur dengan ekstrak kloro­

form dan diuapkan sampai kental,.Pada ekstrak kental

yang didapat dilakukan analisis kualitatif dengan

menggunakan reaksi warna dan kromatografi lapis ti -

pis.

3.5.1* Reaksi warna r>ada ekstrak kloroform

- Reaksi warna Salkowski ( 19 )

Sedikit ekstrak dalam tdbung reaksi ditam-

bah asam sulfat pekat volume sama melalui

dinding tabung perlahan-lahan. Diamati war-

: na yang terjadi di antara dua lapisan, kemu

dian dikocok dan diamati juga warna pada la

pisan asam dan pada lapisan kloroformnya.

steroid pemuanding. Dalam penelitian ini

steroid yang dipakai sebagai pembanding

adalah sitosterol, diosgenin dan hekogenin.

- Reaksi warna Liebermann-Burchard ( 19 )

Ekstrak dalam tabling reaksi ditambah de-

ngan tiga tetes asam asetat anhidrat,

dikocok dan ditambah satu tetes asam sul-

fat pekat kemudian dikocok perlahan-lahan

dan diamati warna yang terjadi. Hal yang

soma dilakukan pula terhadap steroid pem­

banding.

Analisis kualitatif dengan kromatografi la­

pis tipis

Ekstrak kental ditotolkan pada lempeng

jadi Kieselgel 60 F 254 kemudian dimasukkan

ke dalam bejana kromatografi yang telah je-

nuh dengan fase gerak. Untuk deteksi ini

tentukan, lempeng diangkat, dikeringkan dan

disemprot dengan pereaksi penampak noda

Lempeng hasil kromatografi dikeringkan da­

lam lemari pengering pada suhu 100 - 105°C

selaina 5 - 1 0 menit, Warna noda yang tampak

dan harga dibandingkan dengan steroid

BAB IV

HASIL PENELITIAN

1. Pemeriksaan kalus yang ter.iadi

Hasil penanaman eksplan daun Agave amaniensis

Trel. & Nowell menunjukkan, bahwa pembentukan kalus ter-

baik pada media MS dengan penambahan kinetin sebesar

1 ppm dan 2,4-D sebeaar 1 ppm. Sedangkan bila konsentra-

kinetin dan 2,4-D diperbesar dan atau diperkecil, per­

tumbuhan kalus lambat sekali dan teksturnya rapuh bah-

kan kalus tidak dapat tumbuh sama sekali,

Pada media MS dengan penambahan hormon sitokinin

yang lain yaitu benziladenin, pertumbuhan kalus tidak

sebaik dan secepat seperti pada media di atas ( kine­

tin 1 ppm dan 2,4-D 1 ppm ), begitu juga pada media MS

dengan penambahan kinetin, benziladenin, 2,4-D dan IAA

yang lain. Pada tabel III., dapat dilihat kombinssi

hormon pertumbunan pada media MS yang dapat menumbuhkan

kalus Agave amaniensis Trel. & Nowell. Pemeriksaan se-

'cara makroskopis kalus Agave amaniensis pada media yang

Tabel III. Kombinasi hormon pertumbuhan yang dapat

raenumbuhkan kalus Agave amaniensis Trel.

8

t

Keterangan :

© = untuk setiap macara media dibuat 5 ( lima )

botol

= tidak ditambahkan hormon tersebut

K ss kinetin

BA = benziladenin

2,4-D = asam 2,4-diklorofenoksiasetat

IAA' = asam indolasetat

NAA = asam naftalenasetat

Pertumbuhan kalus diamati saat permukaan eksplan

terlihat kasar dan beberapa hari kemudian terli-

hat adanya massa sel yang tidak terdiferensiasi

menjadi organ seperti tanaman asalnya.

Kombinasi hormon yang dapat menumbuhkan kalus a-

Secara makroskopis, pemeriksaan kalus yang tumbuh

pada kelima macam media adalah sebagai berikut :

Tabel IV . Pemeriksaan makroskopis kalus Agave amaniensis

Trel. & Nowell

Media Tekstur Warna Diferensiasi

SD

5

kompak putih keku- tidak terjadi

ningan

SD

1

X rapuh putih tidak terjadi

sd13 rapuh putih keco- tidak terjadi

klatan

SD18 kompak putih keco- tidak terjadi

klatan

SD

2

^ kompak kuning muda tidak terjadi

Keterangan :

sd5 = media MS + kinetin

1

ppm + 2,4-D

1

ppm

SDU = media MS + kinetin

2

ppm +

2

,

4

-D

0,5

ppm

sd13 - media MS + benziladenin

1

ppm + 2,4-D 0,5 ppm

SD18 media MS + benziladenin 0,5 P P ® + 2,4-D 1, 5 ppm

SD2^ s: media MS + kinetin

1

ppm + benziladenin

1

ppm +

E. Subkultur kalus Agave amaniensis Trel. & Nowell

Pada kalus yang telah tumbuh perlu dilakukan perae-

liharaah, yaitu dengan cara subkultur yang dilakukan

setiap empat minggu. Karena setelah empat minggu pada

kalus mulai terlihat adanya pencoklatan. Deraikian ju-

ga untuk perbanyakan kalus dilakukan subkultur.

Kalus yang tumbuh pada media SDxi> SD13’ SD18 dan

bila dilakukan subkultur akan mengalami pencoklatan dan

akhirnya mati, sedangkan pada kalus yang tumbuh pada

media hal tersebut tidak terjadi, Gambar berikut

menunjukkan bentuk dan warna kalus yang tumbuh pada

Mii>

~ m ' 1 •••**

Gambar 8 . Kalus Agave amaniensis Trel. & Nowell.

Keterangan :

kalus Agave amaniensis pada media SD^ setelah

empat minggu disubkultur ( terlihat mulai ter

Pemeriksaan mikroskopis sel-sel kalus dilakukan

setelah empat minggu kalus disubkultur. Dari hasil peme­

riksaan mikroskopis, sel-sel kalus berbentuk heterogen

dan berdinding transparan sehingga isi sel dapat ter-

lihat seperti pada gambar di bav/ah ini :

Gambar 9* Sel-sel kalus A g a v e amanlennis Trel. & Nowell

Keterangan :

kalus pada media MS dengan kinetin 1 ppm dan

2,4-D 1 ppm setelah empat minggu kalus disub­

kultur ( pembesaran 1 0 0 kali )

3 . Deteksi steroid dalam kalus

3.1. Hasil reaksi warna Salkowaki

Neaksi warna dilakukan balk terhadap ekstrak

kloroform dari kalus maupun terhadap ekstrak klo­

roform dari tanamannya, dan umur tanaman yang di-

sebagai sumber eksplan.

• Pada deteksi steroid ini sebagai steroid pem-

banding digunakan sitosterol, diosgenin dan heko-

genin. Hasil reaksi warna Salkowski dapat dilihat

pada tabel V di bawah ini :

Tabel V . Hasil reaksi warna ekstrak kloroform dengan

pereaksi Salkowski

2 a t Hasil pengamatan

warna cincin lapisan asam lap.

- Sitosterol merah. jingga merah jingga kuning

jernih

- Diosgenin coklat merah jingga kuning

jernih

- Hekogenin kuning kuning jernih jernih

tak bei

warna

- Ekstrak dari

kalus

coklat raerah coklat kuning

jernih

- Ekatrak dari

tanaman

coklat coklat tua jernih

3.2. Hasil reaksi warna Liebermann-Burchard

Reaksi ini juga dilakukan terhadap ekstrak

kloroform dari kalus dan ekstrak ekstrak kloro­

form dari tanamannya. Tabel VI berikut ini menun-

Tabel VI, Hasil reaksi warna Liebermann-Burchard ter- .

- Ekstrak dari kalus

*- Ekatrak dari tanaman

ungu biru - biru

coklat

kuning jernih

ungu - coklat - hijau

coklat kehitaman

3.3. Hasil kromatografi lapis tipis terhadap ekstrak

kloroform

Kromatografi lapis tipis dilakukan terhadap

ekstrak kloroform dari kalus dan juga ekstrak klo

roform dari tanaman Agave amaniensis Trel. & No -

well. Fasa gerak yang digunakan adalah n-heksan :

etilasetat =

8

:

2

, kloroform : etilasetat =

9

:

1

, kloroform :metanol =

9

:

1

, karbuntetraklor-

id : etilasetat =

1 : 1

dengan penampak noda anis

aldehid sulfat. Hasil kromatografi lapis tipis

terhadap ekstrak kloroform kalus dapat dilihat

pada tabel VII dyn gambar 10, Untuk hasil kroma­

tografi lapis tipis terhadap ekstrak kloroform

e

c

Keterangan gambar 10 :

S = sitosterol

D = diosgenin

A s= ekstrak kloroform kalus Agave amaniensis

Keterangan gambar 11 :

S = sitosterol

D ss diosgenin

B = ekstrak kloroform tanaman Agave amaniensis

Tabel IX. Jenis steroid yang terdetekei dalam

kalus Agave amaniensis Trel, & Nowell

Jenis steroid Hasil

Sterol +

Diosgenin +

Hekogenin +

Lain-lain +

Keterangan tabel :

+ = mengandung senyawa steroid

+ = dengan faea gerak tertentu menunjukkan

positip, dengan fase gerak lain menun-

jukfaan negatip

- = tidak mengandung senyawa steroid

lain-lain = kemungkinan mengandung senyawa steroid

PEMBAHASAN

!• Penumbuhan kalus

1.1. Pemillhan eksplan

Untuk penumbuhan kalus dari suatu potongan

jaringan tanaraan dipengaruhi oleh beberapa faktor

antara lain : umur tanaman, ukuran eksplan, kuali-

tas tanaman sumber eksplan dan media yang diguna­

kan. Walaupun menurut teori sel dan totipotensi

sel ( 1,2,3 ) mengatakan bahwa setiap bagian tanam

an bila ditanam pada kondisi yang sesuai dapat turn

buh menjadi kalus, tetapi ternyata derajat keber -

hasilannya berbeda untuk setiap bagian tanaman.

Untuk propagasi tanaman jenis Agave sebagai eksplan

dipakai biji. ( 1,12 )* Sedangkan Nickell dan Rou-

tien,menggunakan daun sebagai eksplan untuk kultur

Agave toumcvana. ( 4 )• Juga Blunden dalam

penelitiannya menyatakan bahwa kandungan steroid

pada tanaman Agave terakumulasi di bagian pangkal

daun. ( 15,16 ). Maka untuk penelitian ini sebagai

eksplan adalah bagian pangkal daun Agave amanien­

sis yang masih muda.

1.2* Pemilihan media untuk penanaman eksplan

Dalam penelitian media yang digunakan adalah

karena sesuai dengan metode yang dikemukakan oleh

Dodds,1982; Bhojwani,1983; George dan Sherrington,

1984; bahwa media dasar MS dapat digunakan untuk

kultur jaringan dari banyak tanaman baik monokotil

maupun dikotil. Pada monokotil pembentukan kalus

dapat dirangsang dengan penambahan hormon kinetin

dan 2,4-D. ( 1,2,3 )

Pada avfal penelitian telah dicoba menanam eks

plan pada media dasar MS dengan penambahn kinetin

dengan konsentrasi mulai 0,5 ppm sampai 2 ppm dan

2,4-D 0,5 ppm, ternyata yang dapat menumbuhkan ka­

lus. adalah pada media dasar MS dengan konsentrasi

kinetin 2 ppm dan 2,4-D 0,5 ppm, Tetapi kalus yang

tumbuh terlihat rapuh, pucat dan selanjutnya tidak

tampak adanya pertambahan massa sel-sel kalus.

Hal ini mungkin disebabkan karena jumlah 2,4-D

yang ditambahkan tidak cukup untuk merangsang pem­

bentukan sel-sel kalus dari eksplan,

Kemudian dicoba pada konsentrasi 2,4-D 1 ppm dan

konsentrasi kinetin yang ditambahkan antara 0,5

ppm sampai 2 ppm, dan yang dapat menumbuhkan kalus

pada konsentrasi kinetin 1 ppm dan 2,4-D 1 ppm#

Pada penambahan 2,4-D yang lebih besar dari 1 ppm

terjadi pencoklatan pada eksplan. Hal ini disebab

kan oleh konsentrasi 2,4-D yang cukup besar yang

ditambahkan pada media. 2,4-D dalam konsentrasi

me-matikan sel-sel eksplan. ( 1 )

Pada kombinasi auksin dan sitokinin yang lain

( tabel III )f kalus dapat tumbuh, tetapi untuk

selanjutnya tidak tarapak adanya pertambahan massa

sel-sel kalus dan terjadi pencoklatan.

Pada langkah selanjutnya untuk mempertahankan

kelangsungan hidup kalus yang telah tumbuh pada

kelima macam media ( tabel III ), masing-raasing

dipindahkan ke media segar dengan komposisi hormon

yang sama dengan media asalnya ( disubkultur ).

Ternyata dari kelima macam media tersebut, hanya

pada media dengan kinetin 1 ppm .dan 2,4-D 1 ppm

saja kalus dapat bertahan . Maka untuk selanjutnya

kalus yang tumbuh pada media MS dengan kinetin 1 ppm

dan 2,4-D 1 ppm tersebut saja yang dipakai untuk

penelitian berikutnya.

Dalam kultur jaringan tanaraan, proses penco -

klatan dapat terjadi karena adanya sejenis ensim

oksidase seperti polifenoloksidase, yang dilepas-

kan atau diproduksi oleh jaringan bila lingkungan-

nya tidak sesuai atau bila jaringan tersebut dilu-

kai. ( 1 )

Seharusnya untuk subkultur dilakukan sebelum

kultur melewati fase linier di mana kecepatan per-

turabuhan sel-sel kalus mencapai maksimum. Setelah

dan pertumbuhan akhirnya menurun. ( 2 ). Untuk me-

ngetahtti kecepatan pertumbuhan kalus dapat dilaku­

kan dengan cara memeriksa pertambahan bobot basah

kalus setelah interval waktu tertentu. C 3 )

Pada kalus Agave amaniensis ini kecepatan per-

tumbuhannya belum dapat diamati karena sangat ter-

batasnya jumlah kalus. Pada penelitian yang telah

dilakukan terhadap kultur jaringan tanaman jenis

Agave, ternyata untuk pemeliharaan kalus yang baru

tumbuh dari eksplan diperlukan waktu yang cukup

panjang, ( 12 ). Kemungkinan fase ini yan^ disenut

'lag phase*, fase di mana terjadi penyesuaian sel-

sel terhadap kondisi luarnya. ( 1 )

2. Deteksi steroid dalam kalus

Deteksi steroid dalam kalus Agave amaniensis dila­

kukan untuk mengetahui apakah dalam kalus yang tumbuh

dari eksplan mempunyai kandungan yang sama dengan tana­

man induknya atau tidak,

Karena terbatasnya kalus yang didapat maka deteksi

steroid dilakukan terhadap ekstrak kloroform hasil hi-

drolisa. Sehingga tidak dapat diketahui sterol yang ter-

deteksi pada ekstrak kloroform tersebut berasal dari

sterol bentuk bebas atau sterol yang berasal dari hasil

hidrolisa glikosida sterin,

Pada reaksi warna Salkowski dan Liebermann-Burchard

warna pembanding dan ekstrak kloroform tidak sama. Hal

Hasil kromatografi lapis tipis pada fase gerak ter­

tentu warna noda yang dihasilkan kadang-kadang berimpit

sehingga warna yang dihasilkan juga tidak jelas dan pe-

nentuan harga juga sulit* Hal tersebut karena kela-

rutan komponen-komponen tersebut harapir sama dalam fa­

se gerak. Dalam hal ini untuk mendeteksi diosgenin dalam

kalus Agave amaniensis sulit dilakukan / hasilnya mera-

gukan,

Dari hasil kromatografi lapis tipis, pada ekstrak

kalus menunjukkan adanya sterol. Meskipun sebagai sterol

pembanding digunakan sitosterol, sterol yang terdapat

dalam ekstrak tidak dapat disimpulkan sebagai sitosterol.

Baik sitosterol maupun senyawa sterol yang lain ( kholer*

sterol, kampesterol dan stigmasterol ) mempunyai harga

dan warna noda yang sama. Jadi dengan kromatografi

lapis tipis baik kholesterol, kampesterol, stigmasterol

KESIMPULAN

Dari hasil penelitian dan pembasan dapat disimpul-

kan bahwa :

1. Kalus Agave_.amaniensis Trel* & Nowell dapat tumbuh pada

media dasar MS dengan penambahan hormon kinetin 1 ppm

dan 2,4-D 1 ppm*

2. Dengan metode analisis yang dilakukan, dalam kalus

Agave amaniensis Trel. & Nowell, steroid yang terdetek-

SARAN-SA^AN

Dari hasil penelitian ini perlu dilakukan penelitian

lebih lanjut :

1. Untuk mengoptimasi pertumbuhan kalus Agave amaniensis

Trel* & Nowell dengan kombinasi hormon pertumbuhan

yang lain atau modifikasi pada media dasar MS.

.2, Untuk mengetahui jenis sterol yang terdapat dalam ka-

lus Agave amaniensis Trel. & Nowell.

3. Untuk analisa kuantitatif steroid pada kalus Agave ama­

niensis Trel. & Nowell.

RINGKASAN bab viii

Eksplan Agave amaniensis Trel. & Nowell dapat tumbuh

baik menjadi kalus bila ditanam pada media dasar MS dengan

penambahan hormon kinetin 1 ppm dan 2,4-D 1 ppm.

Kalus yang didapatkan mempunyai tekstur yang kompak dan

berwarna kekuningan. Pada media dasar MS dengan kombinasi

hormon yang lain, kalus yang tumbuh mempunyai tekstur yang

rapuh. Pada pemeliharaan selanjutnya, kalus yang berasal

dari media dasar MS dengan hormon kinetin 1 ppm dan 2,4-D

1 ppm dapat terjadi proliferasi sel-sel-Italus. Sedangkan

pada kalus dari media yang lain, tidak terjadi.

Pada kultur jaringan kadang-kadang kandungan metabo-

litnya tidak sama dengan kandungan tanaman induknya.

Untuk itu pada kalus Agave amaniensis ini dilakukan detek­

si steroid. Ternyata dari hasil analisa dengan KLT menun-

jukkan bahwa dalam kalus Agave amaniensis terdeteksi ada-

nya steroid yang sama dengan tanaman induknya, yaitu adaa

BAB IX

KEPUSTAKAAN

1. George,.EF., and Sherrington, PD. 1984. Plant propagation

by tissue culture, handbook and directory of commer­

cial laboratories. Exegetics Ltd. England, pp 1-29

184-244, 284-307, 334-333.

2. Bhojwani, SS and Razdan, MK. 1983. Plant tissue culture :

Theory and practice- Elsevier. Amsterdam,Oxford,

New York, Tokyo, pp 1-41, 46-47.

3. Dodds, JS., Robert, LW. 1982. Experiment in plant tissue

.culture. Cambrige University Press. London, New York.

PP 1-47, 54-33, 149-153..

4. Puhan, Z., Martin, SM. 1971. The industrial potensial

of plant cell culture. Nat. Res. Counc. of Canada

pp 13-39.

5. Stohs, SJ., Rosenberg, 1975. Steroid and steroi metabo­

lism in plant tissue culture, Lloydia. 58. (3) :

181-192.

6 . Isnaeni. 1986. Optimasi pembentukan kalus Solanum

ma-mmosum L dan identifikasi senyawa steroidnya. Tesis.

Universitas Airlangga. Surabaya, pp 2-83.

7. Crocomo J. Otto, Euginio Aquarone, Otto R. Gottlieb. 1981.

Biosynthesis of secondery product in vitro. Thorpe

A. Trevor ( edit. ). Plant tissue culture method

and application in agriculture. Academic Press.

New York, pp 360-370.

8 . Indrayanto, G. 1986. Prospek kultur jaringan tanaman

9. Staba, EJ. 1980. Plant tissue culture as a source of

biochemical. CRC Press Boca Raton Inc, Florida.

PP 60, 72-74.

10. Indrayanto, G. Produksi metabolit sekunder dengan

tek-nik kultur jaringan tanaman. Seminar nasional me-

tabolit sekunder. PAU Bioteknologi Universitas

Gadjah Mada. Yogyakarta. pp 1-13.

11. Abidin Z, 1983. Dasar-dasar pengetahuan tentang zat

pengatur tumbuh. Penerbit Angkasa. Bandung,

pp 1-36, 55-62.

12. Evans,Sharp, Ammirato, Yamada. 1983- Handbook of plant

cell culture. Techniques for propagation and

breeding. Macmillan Publishing Co. Canada, pp 52,

56-57.

13. Rini Dhamayanti, 1986« Skrining steroid dari beberapa

jenis Agave, Skripsi. Universitas Airlangga.

Surabaya, pp 5-75*

lit. Tarigan, P. 1980. Beberapa aspek kimia sapogenin ste-

roid_pa_d5L tumbuhan di Indonesia. Alumni. Bandung,

pp 120-127.

15. Blunden, G., Yiyi and Jewers K. 1978. Steroidal

eapo-genin from leaves of Agaveae species.

Photochemistry. iZ. : 1923-1925.

16. Blunden, G., Carabot, CA., Jewers, K. 1980. Steroidal

sapogenins from leaves of some species of Agave

and Furcraea. Phytochemistry. 19. : 2M39-2490*

17. Staba, E J . 1985* Milestones in plant tissue culture

systems for the production of secondary products.

Journ. of Nat. Prod. i±8. (2) : 203-206.

18. Rokem, JS., Tal, B., Golden, I. Method for increasing

Diosgenin production by Dioscorea cell in suspen­

sion cultures. Journ. of Nat.; Prod. 48, (2) :

19.

Fong, HHS., Norman, RF. Phvtochemical Screening.

Departement of Pharmacology. College of Pharmacy.

University of Illinois at the Medical Center.

Chicago, pp 55-42.

Stahl, E. 1969. Thin layer chromatography, 2nd edition.

Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York,

p 127.

Macek, K. 1972. Pharmaceutical application of thin

layer and paper chomatographv, Elsevier Publishing

Co. pp 393-399.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1979. Farma-

kope Indonesia. Edisi III. pp 780-784.

Steenis, CGGJ, 1978. Flora. PT Pradnya Paramita. Jakar­

ta. pp 154-156.

Backer, CA., and Bakhuizen van den Brink Jr., RC, 1968,

Flora of Java. Vol III. Wolters-Noordhoff NV.

Groningen - The Nederlands. pp

163-164-Hegnauer, R. 1963. Chemotaxonomie der Pflanzen. Band II.

Birkhauser Verlag, Basel, otuttgart. pp 25-45.

Strasburger, E., et al. 1971. Lehrbuch der Botanik fur

Hochshulen, 30 Auflage. Gustav, Fischer, Verlag,