Lampiran 1. Prosedur Analisis Karakterisasi Minyak Ikan. 1.a. Metode Pengukuran Bilangan Asam (AOCS Cd 3d-63, 1997)

48

LAMPIRAN

49 Lampiran 1. Prosedur Analisis Karakterisasi Minyak Ikan

1. Analisis Kimiawi

Alat

1.a. Metode Pengukuran Bilangan Asam (AOCS Cd 3d-63, 1997)

a. labu Erlenmeyer (250 atau 300 mL), b. stirring magnet,

c. buret (10 mL, dengan ketelitian 0.05 mL)

Bahan

a. KOH 0.1 N (reagent grade). KOH memiliki spesifikasi karbonat maksimum 0.5% atau KOH 0.1 N dari Baker dengan standardisasi kotoran NIST hingga lebih kurang satu bagian per 1000 di dalam pelarut air, metanol atau etanol.

b. Campuran pelarut yang terdiri atas bagian yang sama dari isopropil alkohol (Spesifikasi AOCS 18-58) dan toluen (Spesifikasi AOCS H 19-58).

c. Larutan indikator fenolftalein (1% dalam isopropil alkohol).

Prosedur

a. Tambahkan larutan indikator ke dalam sejumlah pelarut yang diperlukan dengan perbandingan 2 mL terhadap 125 mL dan netralkan dengan basa hingga menimbulkan warna pink pucat yang permanen.

b. Tentukan ukuran sampel dari tabel berikut:

Bilangan Asam Massa Sampel (± 10%), g Keakuratan Penimbangan, ± g 0-1 20 0.05 1-4 10 0.02 4-15 2.5 0.01 15-75 0.5 0.001 75 dan seterusnya 0.1 0.0002

c. Timbang sejumlah cairan sampel yang telah dikocok sempurna sesuai jumlah pada tabel di atas ke dalam labu Erlenmeyer.

d. Tambahkan 125 mL campuran pelarut yang telah dinetralkan. Sampel haus terkocok merata sebelum dititrasi. Pemanasan diperlukan pada beberapa kasus.

50 e. Kocok sampel secara berkala selama menitrasi sampel dengan basa standar hingga timbul warna pink permanen yang sama intensitasnya dengan pelarut yang telah dinetralisasi sebelum ditambahkan ke dalam sampel. Warna tersebut harus bertahan paling tidak selama 30 detik.

Perhitungan

Bilangan Asam (mg KOH/g sampel) =

di mana:

A = volume (mL) basa standar yang digunakan untuk titrasi B = volume (mL) basa standar yang digunakan untuk titrasi blanko N = normalitas basa standar

W = massa sampel (gram)

Ketelitian

Penentuan pertama yang ditunjukkan oleh dua hasil analisis yang berbeda harus tidak lebih dari 0,22 untuk nilai kurang dari 4, dan tidak lebih dari 0,36 untuk nilai antara 4-20.

Alat

1.b. Metode Pengukuran Bilangan Penyabunan (AOCS Cd 3-25, 1997)

a. labu Erlenmeyer (250 atau 300 mL), tahan basa, b. kondensor udara dengan panjang minimum 65 cm, c. water bath atau hot plate dengan berbagai kontrol suhu d. labu destilasi (2 Liter)

Bahan

a. Asam hidroklorat (HCl) yang telah distandarisasi. Lihat Spesifikasi AOCS H 14-52.

b. KOH metanolik 0.1 N.

51

Prosedur

a. Lelehkan sampel, bila belum berbentuk cairan dan saring dengan menggunakan kertas saring hingga tidak lagi mengandung kotoran dan air. Sampel harus berada dalam keadaan kering.

b. Timbang sampel berdasarkan ukuran tertentu hingga titrasi balik adalah 45-55% dari blanko. Biasanya dibutuhkan sampel sebanyak 4-5 gram. Tambahkan 50 mL KOH metanolik dengan menggunakan pipet dan keringkan pipet hingga beberapa waktu.

c. Siapkan blanko dengan cara yang sama, tetapi tidak menggunakan lemak atau minyak.

d. Sambungkan ke kondensor dan didihkan dengan perlahan, tetapi tetap hingga seluruh sampel tersaponifikasi. Untuk sampel yang bersifat formal biasanya proses ini membutuhkan waktu selama 1 jam. Pastikan bahwa cincin uap tidak melebihi atau kurang dari tinggi kondensor.

e. Setelah labu dan kondensor mendingin, tetapi belum berubah bentuk menjadi gel, cuci bagian dalam kondensor dengan menggunakan akuades. Lepaskan kondensor, tambahkan 1 ml indikator fenolftalein dan titrasi dengan menggunakan HCl 0.5 N sampai warna merah muda menghilang. Tulis volum HCl 0.1 N yang dibutuhkan untuk titrasi.

Perhitungan

Bilangan Penyabunan (mg KOH/g sampel) =

di mana:

B = volume (mL) HCl 0.5 N yang digunakan untuk titrasi

S = volume (mL) HCl 0.5 N yang digunakan untuk titrasi blanko N = normalitas larutan HCl

W = massa sampel (gram)

Peringatan:

KOH seperti halnya basa/alkali lainnya dapat melukai kulit, mata dan mengganggu sistem pernafasan. Gunakan sarung tangan karet dan pelindung

52 muka untuk melindungi cairan konsentrat basa. Gunakan efektif peralatan yang dapat menghilangkan asap atau masker untuk melindungi saluran pernafasan dari debu atau uap. Ketika bekerja dengan materi kaustik seperti KOH, selalu tambahkan butiran kaustik ke dalam air dan jangan terbalik. Alkali adalah bahan eksotermik yang ekstrim ketika direaksikan dengan air.

Perhatikan :

Larutan kaustik pada kontainer/tempat panas akan dirusak oleh pembentukan panasnya.

Ethanol adalah bahan yang mudah meledak. Gunakan lemari asap ketika memanaskan atau menguapkan pelarut ini.

HCl adalah asam kuat dan akan menyebabkan “terbakar”. Pakaian pelindung harus dipakai ketika bekerja dengan asam ini. Bahan ini beracun apabila tertelan atau terhisap pernafasan dan menimbulkan iritasi pada mata dan kulit. Penggunaan lemari asap sangat disarankan. Ketika melarutkan asam, selalu tambahkan asam ke dalam air dan jangan terbalik.

Catatan :

1. Ketika bilangan penyabunan digunakan terhadap asam lemak, persiapan dan pemisahan dilakukan sesuai dengan metode AOCS Official Method Ti-La -64

2. Untuk hasil yang konsisten, pipet volumetrik 50 mL yang telah dikalibrasi harus digunakan. Pipet harus spesifik dan kering.

3. Sebagian sampel sulit untuk disabunkan, dan membutuhkan waktu lebih dari 1 jam. Hal ini hanya dapat ditentukan dengan percobaan. Kemurnian dan homogenitas dari pengujian menunjukkan sebagian indikator bahwa penyabunan telah selesai. Namun, hal ini bukan kriteria sepenuhnya.

Tingkat hidrolisis ditentukan dengan cara mengukur bilangan asam dari minyak awal (belum terhidrolisis) dan minyak terhidrolisis pada waktu yang berbeda-beda (6, 12, 24 dan 48 jam) dan bilangan penyabunan dari minyak yang belum terhidrolisis, berdasarkan metode dari American Oil Chemist’ Society

53 (1997). Blanko ditentukan untuk setiap perlakuan. Tingkat hidrolisis ditentukan melalui rumus berikut:

Bilangan asam menunjukkan banyaknya asam lemak bebas yang dihasilkan dari reaksi hidrolisis, dan dihitung sebagai banyaknya potassium hidroksida yang dibutuhkan untuk menetralkan 1 gram minyak ikan.

54 Lampiran 2. Prosedur Pengukuran Aktivitas Lipase (Sigma, 1994)

1. Pengukuran Aktivitas Lipase Metode Spektrofotometri

Alat dan Bahan

a. Buffer fosfat 0.1 M pH 7,0 b. Larutan para-nitro butirat 0.2 M c. Larutan standar para-nitro fenol d. Larutan enzim lipase

Prosedur

a. Larutkan sejumlah kecil enzim ke dalam larutan buffer fosfat pH 7,0 untuk diencerkan. Hitung faktor pengenceran yang digunakan.

b. Pipet enzim sebanyak 0.45 mL ke dalam tabung reaksi.

c. Masukkan 0.54 mL larutan buffer fosfat 0.1 M pH 7,0, kocok dengan menggunakan alat kocok tabung reaksi (vortex).

d. Masukkan 0.01 mL larutan para-nitro butirat 0.2 M kemudian kocok dengan menggunakan vortex.

e. Inkubasi larutan pada suhu 35 o

f. Ukur absorbansi pada panjang gelombang 410 nm, gunakan blanko di atas (0 mL ekstrak).

C selama 10 menit.

g. Buat juga standar larutan para-nitro fenol dengan konsentrasi 0.1 sampai dengan 100 µg dengan pereaksi di atas.

Perhitungan

Keterangan:

1.01 = volume yang dianalisis (mL) Fp = faktor pengenceran

0.0148 = koefisien kepunahan mM dari larutan para-nitro fenol pada 400 nm 0.1 = volume enzim yang digunakan (mL)

55 Lampiran 3. Prosedur Hidrolisis Enzimatis (Wanasundara dan Shahidi, 1998)

1. Diagram Alir Proses Hidrolisis Enzimatis

Enzim Buffer pH Minyak Ikan Penambahan Toluena (pada hidrolisis dengan rekayasa media) Pencampuran (dengan N2) Pencampuran dalam shaker water bath selama

48 jam

Terbentuk Lapisan (Atas: toluena, TAG, DAG, MAG

dan ALB, bawah: air, buffer dan enzim)

Pemisahan Lapisan Atas Pemisahan acylglycerols dari Toluena dengan menggunakan rotary evaporator Pengambilan sampel

Uji Bilangan Asam

Evaporasi untuk Menghilangkan Sisa Toluena Toluena Acylglycerols dan Asam Lemak Bebas Analisis GC-MS

56 Lampiran 4. Prosedur Destilasi Menggunakan Pelarut Heksana (AOAC, 1999)

1. Destilasi Heksana

Alat

• Liquid-liquid extractor – dilengkapi dengan piringan magnet pengaduk, kondensor, dan labu refluks.

• Kombinasi hot plate-magnetic stirrer – Sargent Welch No. H atau sejenis, dapat digunakan pada 25 dan 80o

• Mantel pemanas atau peralatan lain untuk merefluks heksana pada saat pengadukan magnetik.

• Rotary evaporator – Sargent Welch No. S-31210-06 atau sejenis, dapat melepaskan kondisi vakum dengan N2

Pereaksi

atau He.

• Larutan KOH 50% – larutkan 50 gram KOH dalam H2

• Heksana – telah didestilasi ulang atau bebas residu ketika 200 mL dievaporasi.

O hingga larutan mencapai 100 mL.

• Nitrogen (rendah kandungan oksigen) atau helium.

Persiapan Sampel

Hangatkan sampel hingga mencair, aduk rata, masukkan 5 gram ke dalam gelas piala 50 mL, dinginkan. Timbang, bersama dengan pipet tetes, hangatkan hingga mencair, pindahkan 2-2,5 g dengan menggunakan pipet tetes ke dalam wadah reaksi yang terdapat piringan pengaduk magnet, gelas piala dan pipet tetes, kemudian timbang lagi. Tambahkan 50 mL alkohol dan 3 mL larutan KOH, tutup dengan cawan gelas, panaskan sambil diaduk perlahan selama 30 menit. Tambahkan alkohol hingga sama dengan volum sebelumnya, tambahkan 50 mL H2

Total Asam Lemak dan Bahan tak Tersabunkan

O dan panaskan lagi untuk menguapkan sampel tersabunkan yang terbentuk.

Asamkan sampel tersabunkan dengan menambahkan 6 N HCl (ca 5 mL) ke dalam wadah pereaksi. Uji dengan menggunakan indikator jingga metil untuk menyakinkan bahwa larutan tersebut cukup asam. Isi tabung ekstraktor dengan menggunakan heksana, kemudian masukkan ke dalam wadah pereaksi untuk mencegah kembalinya larutan, kemudian pasang kondensornya. Tambahkan 100

57 mL heksana ke dalam labu pereaksi, tambahkan chip pendidih No. 20 SiC atau tabung inverse, pasang ke sisi kanan dan mulai merefluks dengan menggunakan pengaduk magnet pada kecepatan minimum. Ketika memeriksa apakah larutan tidak naik di dalam wadah pereaksi, naikkan rotasi putaran hingga 500 rpm dan laju refluks menjadi 200-250 tetes/menit.

58 Lampiran 5. Hasil Hidrolisis Minyak Ikan di dalam Media Air

1. Pengaruh Suhu

Suhu (o Bilangan Asam C) Bilangan Penyabunan Bilangan Asam Minyak Awal % Hidrolisis di dalam Media Air % Hidrolisis Kontrol 25 9.42 204.81 4.35897 2.76 0.09 35 13.05 204.81 4.488 3.82 0.45 45 18.71 204.81 4.7025 6.02 0.98 55 14.11 204.81 5.35194 4.09 0.30 65 10.59 204.81 5.25096 2.60 0.08

2. Pengaruh pH

pH Bilangan Asam Bilangan Penyabunan Bilangan Asam Minyak Awal % Hidrolisis di dalam Media Air % Hidrolisis Kontrol 5 61.09 204.81 5.016 23.42 4.65 6 25.96 204.81 5.016 6.49 4.00 7 13.58 204.81 5.016 3.22 1.07 8 10.18 204.81 5.016 2.29 0.30 9 13.85 204.81 5.016 4.12 0.30

59 Lampiran 6. Hasil Hidrolisis Minyak Ikan di dalam Media yang Ditambahkan

Toluena

1. Pengaruh Penambahan Air

Penambahan Air Bilangan Asam Bilangan Penyabunan Bilangan Asam Minyak Awal % Hidrolisis dalam Media yang Ditambahkan Toluena 1% 31.29 204.81 5.371126 15.69 2% 27.15 204.81 5.371126 13.61 3% 29.35 204.81 5.371126 14.72 4% 21.52 204.81 5.371126 10.79 5% 27.41 204.81 5.371126 13.75

2. Pengaruh pH

pH Bilangan Asam Bilangan Penyabunan Bilangan Asam Minyak Awal % Hidrolisis dalam Media yang Ditambahkan Toluena 5 33.63 204.81 5.371126 10.66 6 18.36 204.81 5.371126 3.93 7 6.00 204.81 5.371126 0.47 8 6.18 204.81 5.371126 0.11 9 6.12 204.81 5.371126 0.48

3. Pengaruh Suhu

Suhu (o Bilangan Asam C) Bilangan Penyabunan Bilangan Asam Minyak Awal % Hidrolisis dalam Media yang Ditambahkan Toluena 25 27.15 204.81 4.091934 10.21 35 21.97 204.81 3.5871 7.09 45 33.63 204.81 5.371126 11.59 55 18.65 204.81 3.5871 6.61 65 16.86 204.81 4.091934 4.89

60 Lampiran 7. Grafik Hasil Analisis GC-MS

1. Grafik Analisis GC-MS 1

Gambar 11 menunjukkan grafik hasil analisis GC-MS yang dilakukan pada minyak ikan sebelum dihidrolisis.

4.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.0024.0026.0028.0030.0032.00 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 450000 Time--> Abundance

TIC: MINYAK IKAN .D

7.44 _9.01 9.06 9.45 9.69 10.74 10.85 11.05 11.08 11.42 11.51 11.99 12.01 12.11 12.55 12.65 12.83 12.92 13.03 13.15 13.66 13.92 _14.00 14.59 16.13 16.75 17.06 19.45

Gambar 11. Grafik hasil analisis GC-MS terhadap minyak ikan

2. Grafik Analisis GC-MS 2

Gambar 12 menunjukkan grafik hasil analisis GC-MS yang dilakukan pada hasil hidrolisis tanpa penambahan pelarut (pH 5, suhu 45o

4.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.0024.0026.0028.0030.0032.00 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 450000 Time--> Abundance TIC: H1 PH 5 AIR.D 7.46 7.67 8.46 8.95 9.03 9.08 9.14 9.25 9.54 9.68 9.74 9.84 9.94 10.23 10.28 10.35 10.41 10.45 10.55 10.67 10.81 10.94 11.02 11.05 11.12 11.16 11.22 11.29 11.45 11.55 11.59 11.67 11.72 11.76 11.81 11.84 11.93 12.05 12.17 12.22 12.26 12.38 _12.42 12.53 12.70 12.78 12.85 12.92 12.99 13.02 13.10 13.21 13.39 13.52 13.58 13.66 13.69 13.81 13.86 13.94 14.00 14.02 14.08 14.12 14.17 14.37 14.64 14.76 14.94 15.08 15.18 15.23 15.27 15.40 15.84 16.12 16.17 16.25 16.54 16.73 16.79 17.11 17.81 18.40 19.53 C).

Gambar 12. Grafik hasil analisis GC-MS terhadap hasil hidrolisis tanpa penambahan pelarut (pH 5, suhu 45oC)

61

3. Grafik Analisis GC-MS 3

Gambar 13 menunjukkan grafik hasil analisis GC-MS yang dilakukan pada hasil hidrolisis tanpa penambahan pelarut (pH 7, suhu 45o

4.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.0024.0026.0028.0030.0032.00 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 450000 Time--> Abundance TIC: H1 PH 7 AIR.D 7.45 7.65 8.45 8.93 9.01 9.07 9.13 9.22 9.49 9.57 9.67 9.73 9.93 10.39 10.43 10.52 10.64 10.69 10.77 10.89 11.00 11.03 11.14 11.28 11.44 11.52 11.57 11.65 11.70 11.74 11.78 11.81 11.84 11.91 11.96 12.01 12.03 12.14 12.51 12.56 12.67 12.76 12.81 12.89 12.96 12.99 13.07 13.38 13.79 13.85 13.92 13.98 14.00 14.05 14.13 14.35 14.61 14.92 15.06 15.21 15.24 15.82 16.09 16.15 16.23 16.50 16.77 17.08 17.77 19.49 C).

Gambar 13. Grafik hasil analisis GC-MS terhadap hasil hidrolisis tanpa penambahan pelarut (pH 7, suhu 45oC)

4. Grafik Analisis GC-MS 4

Gambar 14 menunjukkan grafik hasil analisis GC-MS yang dilakukan pada hasil hidrolisis dengan penambahan pelarut (penambahan air 1%, pH 5, suhu 45o

4.00 6.00 8.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.0024.0026.0028.00 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 450000 Time--> Abundance

TIC: METIL ESTER KA 0,1.D

7.48 7.69 9.05 9.10 9.25 9.53 9.70 9.96 10.43 10.47 10.54 10.59 10.66 10.81 10.92 11.04 11.07 _11.18 11.31 11.61 11.74 11.77 11.81 11.84 11.94 12.06 12.19 _12.61 12.70 12.79 12.84 12.88 13.00 13.03 13.13 13.84 13.89 13.97 14.01 14.08 14.22 14.40 14.97 15.30 16.21 17.17 19.62 C).

Gambar 14. Grafik hasil analisis GC-MS terhadap hasil hidrolisis dengan penambahan pelarut (penambahan air 1%, pH 5, suhu 45oC)

62 Lampiran 8. Hasil Analisis GC-MS

1. Analisis GC-MS 1

Analisis GC-MS yang dilakukan pada minyak ikan sebelum dihidrolisis.

No. Nama Senyawa Golongan Waktu Retensi Persentase (%) Kualitas 1 Pentadekana Alkana 7.44 2.90 97 9.05 5.39 99 2 Heptadekana Alkana 9.00 2.90 98 3 Cholesta-3,5-diena Alkana 17.05 2.45 99 4 9-Oktadekanal Aldehida 13.66 0.88 59 5 cis,cis-7,10,-Heksadekadienal Aldehida 12.55 0.83 89 6 Asam Dodekanoat

(Asam Laurat) SFA 12.65 1.77 38

7 Asam Tetradekanoat (Asam Miristat) SFA 9.45 4.00 99 9.69 0.18 87 11.42 0.44 59 8 Asam Heksadekanoat (Asam Palmitat) SFA 10.74 6.80 95 10.85 15.32 99 11.05 0.57 89 11.08 0.24 90 16.75 0.70 43 9 n-Asam Oktadekanoat SFA 13.03 6.62 70

10 Asam Thiosulfurat MUFA 12.10 4.63 98

11 9-Asam Oktadekanoat (Asam Oleat) MUFA 11.99 2.71 99 12.01 3.76 99 12.83 0.89 70 12.92 1.98 62 13.15 2.86 48 13.92 1.15 43 14.00 0.97 55 12 5,8,11,14,17-Asam Eikosapentanoat PUFA 11.50 0.98 70 14.59 0.83 46 13 Squalan Squalan 16.13 2.25 95 14 Cholest-5-en-3-ol (3.beta.) Kolesterol 19.45 25.00 99

Berdasarkan hasil tersebut total omega-3 yang terkandung adalah asam eikosapentanoat sebesar 1,81%.

63

2. Analisis GC-MS 2

Kondisi hidrolisis : pH 5 dan suhu 45 o

No.

C di dalam media air

Nama Senyawa Golongan Waktu Retensi Persentase (%) Kualitas 1 5,8,11,14,17-Asam Eikosapentanoat PUFA 12.85 9.58 94 13.39 0.65 74 13.94 2.20 74 2 4,7,10,13,16,19-Asam Dokosaheksanoat PUFA 13.86 0.86 92

Berdasarkan hasil tersebut total omega-3 yang terkandung adalah asam eikosapentanoat sebesar 12,43% dan asam dokosaheksanoat sebesar 0,86%.

3. Analisis GC-MS 3

Kondisi hidrolisis : pH 7 dan suhu 45 o

No.

C di dalam media air

Nama Senyawa Golongan Waktu Retensi Persentase (%) Kualitas 1 5,8,11,14,17-Asam Eikosapentanoat PUFA 12.81 7.05 95 15.82 0.10 95 2 4,7,10,13,16,19-Asam Dokosaheksanoat PUFA 13.84 0.56 49

Berdasarkan hasil tersebut total omega-3 yang terkandung adalah asam eikosapentanoat sebesar 7,15% dan asam dokosaheksanoat sebesar 0,56%.

4. Analisis GC-MS 4

Kondisi hidrolisis : kadar air 1%, pH 5 dan suhu 45 o

No.

C di dalam media yang ditambahkan toluena

Nama Senyawa Golongan Waktu Retensi

Persentase

(%) Kualitas

1 5,8,11,14,17-Asam

Eikosapentanoat PUFA 12.84 3.01 95

Berdasarkan hasil tersebut total omega-3 yang terkandung adalah asam eikosapentanoat sebesar 3,01%.