17 MATERI DAN METODE
Lokasi dan Waktu
Penelitian ini berlangsung dari bulan Februari sampai Mei 2011 bertempat di Laboratorium Pengembangan Teknologi Industri Agro dan Biomedika (LAPTIAB, BPPT), Tangerang; Laboratorium Biokimia, Fisiologi, dan Mikrobiologi;
Laboratorium Nutrisi Ternak Perah, Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor; dan Pusat Penelitian Surfaktan dan Bioenergi, Bogor.
Materi
Peralatan yang dipergunakan dalam penelitian ini meliputi, piston, syring, waterbath, spoit, autoclave, shaker waterbath, oven 60°C, counting chamber, mikroskop cahaya.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah meliputi ransum (rumput gajah, konsentrat dan tepung daun kembang sepatu dan tepung ampas teh), cairan rumen, larutan mikro mineral, larutan McDougall, larutan resazurin 0,1%, gas CO2,
garam formalin (formalin salin), K2HPO4, NaCl, (NH4)2SO4, KH2PO4, MgSO4, CaCl2, Na2CO3, cystein, Na2HPO4, KCl, tricloro acetic acid (TCA) dan sulfo salicylic acid (SSA), media BHI powder, carboxy methyl cellulose, kasein, susu skim, pati, agar, glukosa, larutan hemin 0,05% dan vitamin.
Cairan rumen yang dipergunakan diambil dari sapi berfistula pada bagian rumen yang dipelihara di Laboratorium Lapang Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Selama pemeliharaan pakan yang diberikan yaitu terdiri dari rumput dan konsentrat. Air minum diberikan secara ad libitum.
Prosedur Pembuatan Ransum Penelitian
Ransum komplit mengandung bahan baku pakan yang terdiri dari rumput gajah, konsentrat, tepung daun kembang sepatu dan ampas teh. Rumput gajah yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari laboratorium Agrostologi, kandang B, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Rumput segar yang diambil sebanyak
18 1000 gram segar, kemudian rumput tersebut dikeringkan dengan matahari selama ± 6 jam dan selanjutnya digiling. Berat rumput kering adalah 220,86 gram, atau rendemen 22%. Konsentrat dibuat dengan kandungan protein kasar sebesar 15,43%.
Bahan yang digunakan dalam pembuatan konsentrat meliputi : Pollard (34,25%);
Bungkil kelapa (29,33%); Onggok (25,07%); Tetes (5,26%); CaCO3 (3,04%); Urea (1,31%); Premix (0,66%); Bungkil kedelai (0,64%); NaCl (0,44%). Bahan dicampur di dalam ember besar dengan bahan yang lebih sedikit dicampur terlebih dahulu.
Pembuatan Tepung Daun Kembang Sepatu. Bahan tepung daun kembang sepatu berasal dari tanaman kembang sepatu yang berada di kawasan Pusat Penelitian Ilmu Pengetahuan dan Teknologi (PUSPIPTEK) Serpong dan Laboratorium Pengembangan Teknologi Industri Agro dan Biomedika (LAPTIAB, BPPT). Daun kembang sepatu dikering matahari selama 48 jam. Setelah itu dikeringkan menggunakan oven (60oC) selama 24 jam, kemudian daun yang sudah kering digiling menggunakan mesin penggiling (disc mill) untuk mendapatkan tepung daun kembang sepatu.
Persiapan Ampas Teh. Ampas teh didapatkan dari PT. Sinar Sosro, Bekasi. Ampas teh dibersihkan, dikering anginkan selama 48 jam dibawah terik matahari. Setelah itu dikeringkan dengan menggunakan oven (60oC) selama 24 jam. Ampas teh yang sudah kering digiling dengan menggunakan mesin penggiling (disc mill) untuk mendapatkan tepung ampas teh. Selanjutnya ampas teh dan tepung daun kembang sepatu dianalisis untuk mengetahui kadar tanin dan saponin.
Pengujian Fermentasi in vitro (Tilley dan Terry, 1963)
Pengambilan Cairan Rumen. Termos yang akan dipakai untuk tempat cairan rumen diisi dengan air panas sehingga suhunya mencapai 39oC kemudian ditutup.
Cairan rumen diambil dari sapi berfistula, kemudian diperas dengan menggunakan kain kasa dan dimasukkan kedalam termos hangat.
Pembuatan Larutan Mc Dougal (Saliva Buatan). Sebanyak 5 liter air destilasi dimasukkan ke dalam labu takar yang bervolume 6 liter kemudian dimasukkan bahan-bahan sbagai berikut NaHCO3 (58,8 gram), Na2HPO4.7H2O (42 gram), KCL (3,42 gram), NaCl (2,82 gram), MgSO4.7H2O (0,72 gram) dan CaCl2 (0,24 gram).
Semua bahan tresebut dilarutkan kecuali CaCl2, setelah semua bahan larut
19 ditambahkan CaCl2. Kemudian leher labu di cuci dengan air destilasi hingga permukaan air mencapai tanda tera. Campuran lalu dikocok dengan gas CO2 secara perlahan-lahan.
Fermentasi Pakan. Tabung fermentor diisi dengan 0,5 gram sampel ransum perlakuan terdiri dari 0,02 gram tepung rumput gajah, 0,03 gram konsentrat, ampas teh (0; 1; 2; 3) mg/ml cairan rumen, dan tepung daun kembang sepatu (0; 0,15; 0,3) mg/ml cairan rumen lalu ditambahkan 10 ml cairan rumen dan 40 ml larutan McDougal. Tabung fermentor dikocok dengan cara mengaliri gas CO2 selama 30 detik (pH 6,5-6,9) dan ditutup dengan karet berventilasi. Tabung dimasukkan kedalam shaker water bath dengan suhu 39 oC, dilakuan fermentasi selama 4 jam untuk sampel VFA/NH3.
Pembuatan Larutan Media (Close dan Menke, 1986). Proses pembuatan larutan media untuk gas test, 0,1 ml larutan mineral mikro dicampur dengan 200 ml larutan buffer rumen, lalu 200 ml larutan mineral makro juga ditambahkan, 1,0 ml larutan resazurin 0,1% ditambahkan ke dalam campuran tadi, ditambah 40 ml larutan pereduksi. Larutan ini dicampur menjelang akan digunakan dan dijaga pada temperatur 39oC.
Persiapan Sampel Gas Test. Larutan media yang sudah diaduk dan dialiri gas CO2
ditempatkan dalam waterbath 39oC. Selanjutnya, cairan rumen sebagai sumber inokulum diambil dan disaring. Satu bagian cairan rumen dicampur dengan 2 bagian media dan diaduk dengan magnetic stirer lalu disimpan dalam waterbath dan dialiri gas CO2. Sebanyak 30 ml campuran cairan rumen dan media dimasukkan kemasing- masing syring menggunakan spuit. Udara yang ada didalam syring dikeluarkan dan klep syringe ditutup. Posisi piston pada waktu sebelum inkubasi dicatat (Gb0). Piston diinkubasi dalam waterbath selama 48 jam dan pencatatan posisi piston dilakukan pada jam ke 2, 4, 6, 8, 12, 24, dan 48. Produksi gas diukur dengan menggunakan rumus di bawah ini:
20
Keterangan: FH = produksi gas standar dibagi dengan produksi sebenarnya dari hijauan, asumsi = 1 FC = produksi gas standar dibagi dengan produksi sebenarnya dari konsentrat, asumsi =1
Pengambilan Sampel Gas Metan. Sampel gas metan (CH4) diambil menggunakan spoit 1 ml pada fase gas masing-masing syringe. Fase gas tersebut kemudian dinjeksikan dan ditampung dalam tabung vakum untuk selanjutnya dianalisis konsentrasi gas metan menggunakan Gas Chromatography. Dengan membaca kromatogram standar acuan CH4 yang konsentrasinya sudah diketahui maka konsentrasi CH4 sampel dapat diukur.
Perhitungan Populasi Protozoa (Ogimoto dan Imai, 1981) dan Bakteri (Hungate, 1966)
Perhitungan Populasi Protozoa. Sampel cairan diteteskan pada counting chamber dan ditutup dengan cover glass sampai rata. Counting chamber yang digunakan mempunyai ketebalan 0,1 mm, dengan luas kotak terkecil 0,0625 mm yang terdapat 16 kotak dan kotak yang dibaca sebanyak 5 kotak. Populasi protozoa diamati dengan mikroskop lensa obyektif dengan pembesaran 40x dan okuler 10x. Populasi protozoa dihitung dengan rumus:
Keterangan: C = jumlah koloni yang dihitung Fp = faktor pengencer (2)
Perhitungan Populasi Bakteri Total, Selulolitik, Amilolitik, dan Proteolitik.
Media tumbuh yang digunakan untuk menghitung populasi bakteri total adalah medium BHI yaitu dengan cara mencampur bahan-bahan seperti BHI bubuk dengan bahan sumber nutrisi mikroba lainnya, kemudian dimasukkan ke dalam botol yang telah diautoclave. Campuran tersebut dipanaskan perlahan-lahan sambil dialiri gas CO2 sampai terjadi perubahan warna dari coklat menjadi merah dan berubah lagi menjadi coklat muda, lalu didinginkan. Selanjutnya media dimasukkan ke dalam tabung Hungate masing-masing sebanyak 5 ml yang sebelumnya telah diisi agar Bacto sebanyak 0,15 g, kemudian media disterilkan dalam otoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit dengan tekanan 1,2 Kgf/cm3. Setelah siap, medianya digunakan untuk pembiakan bakteri, media agar dimasukkan ke dalam penangas air pada suhu 47ºC. Pada prinsipnya perhitungan populasi bakteri amilolitik, selulolitik dan
21 proteolitik sama seperti perhitungan populasi total bakteri. Perbedaan terdapat pada penggunaan medium yang disesuaikan dengan jenis bakteri tersebut. Medium tumbuh bakteri selulolitik ditambah dengan carboxyl methyl celluloce (CMC), medium tumbuh bakteri amilolitik ditambah dengan pati dan medium tumbuh bakteri proteolitik ditambah dengan susu skim. Pengenceran dilakukan sebagai berikut : 0,05 ml cairan rumen dimasukkan ke dalam 4,95 ml media pengencer. Selanjutnya diambil kembali 0,05 ml lalu dimasukkan ke dalam 4,95 ml media pengencer berikutnya, perlakuan tersebut dilakukan sampai 4 kali (4 seri tabung). Selanjutnya dari masing-masing seri tabung pengenceran diambil sebanyak 0,1 ml lalu ditransfer ke media agar dan diputar sambil dialiri air, sehingga media dapat memadat secara merata pada dinding tabung dalam. Tabung selanjutnya diinkubasi selama 2-3 hari.
Populasi bakteri dapat dihitung dengan rumus:
Keterangan: n = jumlah koloni yang terdapat pada tabung seri pengenceran ke-x
Rancangan dan Analisis Data
Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Kelompok (RAK) faktorial 4x3 dengan 4 kali ulangan secara duplo. Cairan rumen ternak sapi berfistula digunakan sebagai ulangan yang dikelompokkan berdasarkan waktu pengambilan yang berbeda.
22 Gambar 5. Diagram Rancangan Percobaan
Model matematik yang digunakan dalam analisa adalah : Yijk = µ + αi + βj + αiβ + τk + εijk
Keterangan :
Yij : nilai faktor A ke-i, Faktor Bke-j, dan pengamatan kelompok ke-k µ : rataan umum
αi : pengaruh faktor A (taraf pemberian tepung ampas teh) ke-i
βj : pengaruh faktor B (taraf pemberian tepung daun kembang sepatu) ke-j αiβ : pengaruh interaksi faktor A ke-i dan faktor B ke-j
τk : pengaruh kelompok (cairan rumen) ke-k
εijk : galat percobaan untuk faktor A ke-i, faktor B ke-j, & kelompok ke-k
