KULTUR JARINGAN TUMBUHAN PENDAHULUAN

KULTUR JARINGAN

TUMBUHAN

Pengertian

• Pembiakan tanaman secara in vitro merupakan

metode pengisolasian bagian tanaman (sel,

jaringan, atau organ) kemudian menumbuhkannya

pada media buatan dalam wadah tembus

pandang dan kondisi aseptik, hingga bagian-bagian

tanaman tersebut dapat memperbanyak diri,

tumbuh menjadi tanaman lengkap (plantlet)

kembali.

• Pelaksanaan teknik ini memerlukan berbagai

prasyarat untuk mendukung kehidupan jaringan

yang dibiakkan. Hal yang paling esensial adalah

• Media adalah tempat bagi jaringan untuk

tumbuh dan memperoleh nutrisi yang

mendukung kehidupan jaringan.

Media tumbuh menyediakan berbagai bahan

yang diperlukan jaringan untuk hidup dan

memperbanyak dirinya.

Media tumbuh dapat berupa media cair,

media padat atau semi padat. Untuk

menentukan bentuk media yang akan

digunakan, akan sangat bergantung pada jenis

eksplan dan spesies tanaman yang akan

• Teknik kultur jaringan memanfaatkan

prinsip

perbanyakan tumbuhan secara

vegetatif.

• Berbeda dari teknik perbanyakan tumbuhan

secara

konvensional,

teknik kultur jaringan

dilakukan dalam kondisi

aseptik

di dalam botol

kultur dengan medium dan kondisi tertentu.

Karena itu teknik ini sering kali disebut

kultur

in vitro. Disebut in vitro

(bahasa Latin)

, berarti

"di dalam kaca“, karena jaringan tersebut

ditumbuhkan dalam botol kaca yang tembus

pandang.

PRINSIP DASAR

• Kemampuan dari bagian tanaman yang dikulturkan

(eksplan) untuk memperbanyak diri (beregenerasi,

embriogenesis, organogenesis) hingga terbentuk

individu/tanaman baru (planlet) didasari oleh teori

sel yang dikemukakan oleh Schleiden dan Schwann

(1838).

Teori sel menyatakan bahwa sel merupakan suatu

kesatuan biologis terkecil yang mampu

mengadakan segala aktivitas yang berhubungan

dengan kehidupan, sehingga setiap sel yang hidup

mempunyai sifat yang disebut Totipotensi Sel (Total

genetik potensial dari sel).

PRINSIP DASAR

(lanjutan)

• Totipotensi sel dapat diartikan bahwa

setiap sel hidup mempunyai

potensi/kemampuan genetik secara

otonom untuk tumbuh dan berkembang

menjadi tanaman yang sempurna bila

ditumbuhkan pada lingkungan yang sesuai

(Gamborg dan Shyluk, 1981).

PRINSIP DASAR

(lanjutan)

• Selain totipotensi, kultur jaringan pada tanaman

dimungkinkan karena sel tanaman memiliki

kemampuan rediferensiasi dan kompetensi.

Rediferensiasi adalah kemampuan sel-sel dewasa

(mature) kembali menjadi ke kondisi meristematik

dan berkembang dari satu titik pertumbuhan baru

yang diikuti oleh rediferensiasi yang mampu

melakukan reorganisasi manjadi organ baru.

• Kemampuan kompetensi menggambarkan potensi

endogen dari sel atau jaringan untuk tumbuh dan

berkembang dalam satu jalur tertentu.

Aplikasi pembiakan in-vitro:

Dalam perkembangan selanjutnya, teknik in vitro

tidak hanya digunakan untuk memperbanyak

tanaman, tetapi juga digunakan untuk tujuan

lain,

aplikasinya

dibidang

pertanian

adalah

sebagai berikut:

1. Perbanyakan tanaman secara massal.

Perbanyakan tanaman dapat dilakukan secara

massal sehingga dapat dihasilkan bibit

tanaman dalam jumlah yang banyak dalam

waktu yang relatif singkat dengan

menggunakan bahan tanam (eksplan) yang

berukuran kecil (1 mm - 10 mm)

2. Menghasilkan bibit bebas patogen dan

meyelamatkan klon dari kepunahan.

Dpt dihasilkan bibit tan yg bebas patogen

dan utk mendapatkan/menyelamatkan

klon dari suatu tetua unggul yg langka atau

krn terserang suatu penyakit yg

mematikan, misalnya induk tanaman jeruk

yang terserang CVPD (dengan

menggunakan eksplan dari meristem apikal

yang berukuran 0,1 mm 1,0 mm).

3. Seleksi tanaman terhadap kondisi

tertentu.

Teknik in vitro dapat digunakan untuk

melakukan seleksi terhadap berbagai jenis

galur/varietas tanaman untuk

mendapatkan jenis yang tahan terhadap

tingkat ketahanan tertentu, misalnya

tingkat ketahanan pada pH tertentu,

tingkat salinitas dan lainnya.

4. Koleksi dan konservasi plasma nutfah.

Mengoleksi dan mengkonservasi berbagai

jenis tanaman sebagai sumber keragaman

genetik dapat dilakukan dengan teknik in

vitro hanya dalam suatu laboratorium yang

berukuran kecil dan mudah untuk

dipertukarkan ke tempat lain/kota/negara

lain karena ukurannya yang kecil dan dalam

wadah botol/tabung gelas yang aseptik.

5. Mendapatkan mutan-mutan harapan

Teknik in vitro dapat digunakan untuk menghasilkan mutan-mutan yang diharapkan mempunyai sifat-sifat unggul, seperti tahan terhadap kekeringan, tahan

terhadap kadar Aluminium yang tinggi dsb.

6. Menghasilkan senyawa sekunder.

Dapat dihasilkan senyawa sekunder yang mempunyai manfaat dalam bidang kesehatan (obat-obatan) dan industri hanya dengan menghasilkan sel-sel dari

suatu tanaman tertentu yang nantinya akan

diekstrak untuk mendapatkan senyawa sekunder tersebut, misalnya saponin dari tanaman ginseng.

Kultur in-vitro memiliki peran yg sangat

penting utk mendapatkan hasil-hasil yg

tidak mungkin dicapai melalui kultur

in-vivo.

Berikut disajikan aplikasi sejunlah metode

kultur jaringan beserta tujuan dr aplikasi

tersebut menurut Pierik (1997)

TIPE KULTUR TUJUAN

KULTUR EMBRIO -Mempersingkat siklus pemuliaan tnm -Mengatasi aborsi embrio

-Sebagai sumber pembentukan kalus

KULTUR BIJI ANGGREK -Mempersingkat siklus pemuliaan -Menggantikan simbiosis (mikoriza) -Meniadakan kompetisi dgn

mikro-organisme lain.

KULTUR MERISTEM -Eliminasi patogen (virus, cendawan, dan bakteri)

-Perbanyakan vegetatif pd anggrek melalui plb (protocorm-like bodies) -Perbanyakan klon tanaman.

TIPE KULTUR TUJUAN

KULTUR TUNAS DAN BUKU TUNGGAL

-Perbanyakan anggrek

-Percabangan aksilar sbg sarana perbanyakan klon tanaman

KULTUR KALUS DAN SUSPENSI SEL

-Perbanyakan klon tnm melalui pembentukan organ dan embrio. -Regenerasi varian-varian genetika. -Mendapatkan tnm bebas virus

-Sbg sumber utk produksi protoplas -Produksi metabolit sekunder.

KULTUR ANTERA DAN MIKROSPORA

-Produksi tnm haploid.

-Sbg titik awal utk induksi mutasi. -Mendptkan tnm mandul yg

semuanya berjenis kelamin jantan. -Melakukan pemuliaan pd tingkat

TIPE KULTUR TUJUAN

KULTUR OVUL -Mengatasi absisi bunga yg terlalu dini. -Mendapatkan pembuahan secara

in-vitro.

KULTUR PROTOPLAS -Hibridisasi somatik (dg fusi protoplas). -Penciptaan hibrida sel (cybrib).

-Pencangkokan inti, kromosom, dan organel-organel sel.

-Penelitian transformasi. KULTUR SEL,

JARINGAN, DAN ORGAN

Sbg sarana pd penelitian fisiologi tnm: -Penelitian siklus sel

-metabolisme tanaman -penelitian nutrisi

-penelitian morfogenetik dan perkembangan.

Protoplast

Dinding sel dihilangkan dengan menggunakan enzyme yang memecah selulosa.

Perkembangan kalus-protocorm-plantlet Kultur jaringan anggrek

Perkecambahan biji anggrek

Biji anggrek tanpa endosperm

Perkembangan protocorm anggrek

menjadi tunas pucuk

TAHAPAN PERKEMBANGAN

DAN PELAKSANAAN KULTUR JARINGAN

• Pembiakan in vitro melibatkan serangkaian

perubahan morfologis dan fisiologis yg

dipengaruhi oleh berbagai factor-- karena

bbrp tahapan perkembangan harus dilalui

eksplan sehingga dapat kembali menjadi

1. Morfogenesis, Organogenesis, dan

Embryogenesis

a. Morfogenesis

Morfo berarti bentuk dan genesis berarti asal mula, sehingga morfogenesis bisa diartikan dengan asal mula terjadinya

suatu bentuk.

• Morfogenesis dipengaruhi oleh dua faktor utama yaitu genotipe dan lingkungan tumbuh tanaman. Genotipe tanaman akan menentukan bagaimana pertumbuhan jaringan tanaman, dan morfogenesisnya secara in vitro. Faktor penting lain yang mempengaruhi morfogenesis

adalah lingkungan, yaitu aspek pertukaran gas, temperatur, cahaya, dan komposisi media kultur.

• Morfogenesis baik secara langsung maupun tidak, sangat tergantung pada keseimbangan komposisi yang tepat

antara bahan organik, anorganik dan senyawa pengatur tumbuh tanaman.

b. Organogenesis

Organogenesis merupakan istilah yang merujuk

pada proses terbentuknya organ (pucuk dan/atau

akar adventif) dari kalus.

• Kalus yang telah diberi perlakuan mutagen

kemudian diarahkan kembali pertumbuhannya

untuk membentuk pucuk dan/atau akar adventif

• Proses organogenesis ditandai dengan

pembentukan struktur unipolar yaitu hanya

pembentukan titik tumbuh daun atau akar secara

terpisah. Karena prosesnya mirip dengan

perkembangan pada biji, tanaman klonal yang

dihasilkan dengan teknik somatik embriogenetik

secara morfologis/arsitektural sangat mirip dengan

tanaman asal dari biji.

c. Embriogenesis

Istilah ini digunakan untuk menyatakan

perkembangan embrio lengkap dari sel-sel

vegetative yang dihasilkan dari berbagai

sumber eksplan yang ditumbuhkan pada

system kultur jaringan (Hartmann et al., 1990).

Sama seperti embrio zigotik yang berkembang

dari penyatuan gamet jantan dan gamet

betina, embrio somatik pun tumbuh dan

berkembang melewati tahapan-tahapan yang

sama. Tahapan-tahapan tersebut adalah

oktan, globular, awal hati, hati, torpedo, dan

embrio dewasa.

Pembentukan kalus

Massa sel parenkim yang terjadi karena proliferasi jaringan awal dan belum terdiferensiasi.

•Somaklonal variation

•Material utk mempelajari perkembangan

•Dieksploitasi utk produksi bahan, antara lain: metabolit sekunder (minyak atsiri, alkaloid,

dll)

Kumpulan sel amorphous dari sel-sel yang membelah diri terus menerus.

Sterilisasi eksplan

Inisiasi

Enam kali subkultur

Sterilisasi planlet Siap tanam Akli matisasi dalam

seedbed Tanaman

sehat

Desi gned by: Agus Sutanto

Designed by : Moch. Ramadhoni

Teknik InokulasiTanaman Pisang Secara Kultur Jaringan

2. Tahapan Pelaksanaan Kultur Jaringan

a. Pemilihan dan Penyiapan Tan. Induk Sumber eksplan.

Memilih bahan induk yang akan diperbanyak harus

tanaman yg jelas jenis (spesies) dan varietasnya

serta harus sehat dan bebas dari hama dan

penyakit.

Tanaman indukan sumber eksplan tersebut harus

dikondisikan dan dipersiapkan secara khusus di

rumah kaca atau green house agar eksplan yang

akan dikulturkan sehat dan dapat tumbuh baik

serta bebas dari sumber kontaminan pada waktu

dikulturkan secara in vitro.

b. Inisiasi Kultur

• Tujuan utama dari propagasi secara in-vitro tahap ini adalah pembuatan kultur dari eksplan yang bebas mikroorganisme serta inisiasi pertumbuhan baru (Wetherell, 1976).

• Tahap ini mengusahakan kultur yang aseptik (aseptik: bebas dari mikroorganisme).

• Dalam tahap ini juga diharapkan bahwa eksplan yang dikulturkan akan menginisiasi pertumbuhan baru, sehingga akan memungkinkan dilakukannya pemilihan bagian tanaman yang tumbuhnya paling kuat, untuk perbanyakan (multiplikasi) pada kultur tahap selanjutnya (Wetherell, 1976).

b. Inisiasi Kultur (lanjutan)

• Untuk mendapakan kultur yang bebas dari kontaminasi, eksplan harus disterilisasi. Sterilisasi merupakan upaya untuk menghilangkan kontaminan mikroorganisme yang menempel di permukaan eksplan.

• Beberapa bahan kimia yang dapat digunakan untuk mensterilkan permukaan eksplan adalah NaOCl, CaOCl₂, etanol, Na₂H₂O₂ dan HgCl₂.

Kultur bebas kontaminan

• Yang perlu diperhatikan dalam sterilisasi

permukaan bahan eksplan adalah konsentrasi

sterilan dan lamanya perendaman. Angka yang

tepat biasanya diperoleh melalui penelitian awal

(trial and error), karena sangat spesifi k untuk

masing-masing spesies tanaman serta jenis dan

umur bahan eksplan. Konsentrasi yang terlalu

tinggi akan menyebabkan kematian pada sel-sel

tanaman, sedangkan konsentrasi yang terlalu

rendah tidak efektif karena tidak mampu

membunuh

mikroorganisme

yang

ada

di

b. Inisiasi Kultur (lanjutan)

Kesesuaian bagian tanaman untuk dijadikan eksplan, dipengaruhi oleh banyak faktor. Tanaman yang memiliki hubungan kekerabatan dekat pun, belum tentu menunjukkan respon in-vitro yg sama (Wetherell, 1976). Hal-hal penting, al:

• Penggunaan eksplan yg tepat.

• Ukuran eksplan bagian tanaman yang digunakan sebagai eksplan.

• Bagi kebanyakan tanaman, eksplan yang sering digunakan adalah tunas pucuk (tunas apikal) atau mata tunas lateral pada potongan batang berbuku.

b. Inisiasi Kultur (lanjutan)

• Umur fisiologis dan umur ontogenetik

jaringan tanaman yang dijadikan eksplan

juga

berpengaruh

terhadap

potensi

morfogenetiknya. Umumnya, eksplan yang

berasal dari tanaman juvenil mempunyai

daya regenerasi tinggi untuk membentuk

tunas lebih cepat dibandingkan dengan

eksplan yang berasal dari tanaman yang

sudah dewasa.

b. Inisiasi Kultur (lanjutan)

• Masalah yang sering dihadapi pada kultur tahap

ini

adalah

terjadinya

pencokelatan

atau

penghitaman bagian eksplan (browning). Hal ini

disebabkan oleh oksidasi senyawa fenol yang

timbul akibat stress mekanik yang timbul akibat

pelukaan pada waktu proses isolasi eksplan dari

tanaman

induk.

Efek

oksidasi

tsb.

dpt.

menyebabkan medium mjd coklat, efeknya dpt

menghambat pertumbuhan atau bahkan dapat

mematikan jaringan eksplan.

c. Multiplikasi atau Perbanyakan Propagul.

• Tahap ini bertujuan untuk menggandakan propagul dan memeliharanya dalam keadaan tertentu sehingga sewaktuwaktu bisa dilanjutkan untuk tahap berikutnya (Yusnita, 2004). Propagul adalah bentukan baru hasil morfogenesis yg terbentuk dari jaringan eksplan yg ditanam. Propagul dpt berupa kalus, tunas atau embrio somatik.

• Pada tahap ini, perbanyakan dapat dilakukan dengan cara merangsang terjadinya pertumbuhan tunas cabang dan percabangan aksiler atau merangsang terbentuknya tunas pucuk tanaman secara adventif, baik secara langsung maupun melalui induksi kalus terlebih dahulu.

c. Multiplikasi atau Perbanyakan Propagul. (lanjutan)

• Di dalam media harus terkandung mineral, gula,

vitamin, dan hormon dengan perbandingan yang

dibutuhkan secara tepat (Wetherell, 1976).

Hormon yang digunakan untuk merangsang

pembentukan

tunas

tersebut

berasal

dari

golongan sitokinin seperti BAP, 2-iP, kinetin, atau

thidiadzuron (TDZ).

c.

Multiplikasi atau Perbanyakan Propagul.

(

lanjutan

)

• Eksplan yang dalam kondisi bagus dan tidak

terkontaminasi

dari

tahap

inisiasi

kultur

dipindahkan atau disubkulturkan ke media yang

mengandung sitokinin. Subkultur dapat dilakukan

berulang-ulang kali sampai jumlah tunas yang kita

harapkan, namun subkultur yang terlalu banyak

dapat

menurunkan

mutu

dari

tunas

yang

dihasilkan, seperti terjadinya penyimpangan genetik

(aberasi),

menimbulkan

suatu

gejala

ketidaknormalan

(vitrifikasi)

dan

frekuensi

d. Pemanjangan Tunas, Induksi, dan Perkembangan Akar.

• Tujuan dari tahap ini adalah untuk membentuk akar dan pucuk tanaman yang cukup kuat.

• Dalam tahap ini, kultur tanaman akan memperoleh ketahanannya terhadap pengaruh lingkungan, sehingga siap untuk diaklimatisasikan (Wetherell, 1976).

• Tunas-tunas yang dihasilkan pada tahap multiplikasi di pindahkan ke media lain untuk pemanjangan tunas.

• Media untuk pemanjangan tunas mengandung sitokinin sangat rendah atau tanpa sitokinin.

• Tunas tersebut dapat dipindahkan secara individu atau berkelompok.

d. Pemanjangan Tunas, Induksi, dan Perkembangan Akar.

(lanjutan)

• Pemanjangan tunas dan pengakarannya dapat

dilakukan sekaligus atau secara bertahap, yaitu

setelah dipanjangkan baru diakarkan. Pengakaran

tunas

in-vitro

dapat

dilakukan

dengan

memindahkan tunas ke media pengakaran yang

umumnya memerlukan auksin seperti NAA atau

IBA. Keberhasilan tahap ini tergantung pada

tingginya mutu tunas yang dihasilkan pada tahap

sebelumnya.

Induksi akar pada kultur tanaman kelapa sawit.

Induksi tunas pada

kultur jaringan tanaman pisang

e. Aklimatisasi

• Dalam proses perbanyakan tanaman secara

kultur

jaringan,

tahap

aklimatisasi

planlet

merupakan salah satu tahap kritis yang sering

menjadi kendala dalam produksi bibit secara

massal. Pada tahap ini, planlet atau tunas mikro

dipindahkan ke lingkungan di luar botol seperti

rumah kaca, rumah plastik, atau screen house

(rumah kaca kedap serangga).

e. Aklimatisasi (lanjutan)

• Aklimatisasi adalah proses pengkondisian planlet atau tunas mikro di lingkungan baru yang aseptik di luar botol, dengan media tanah, pakis, atau media lainnya sehingga planlet dapat bertahan dan terus menjadi bibit yang siap ditanam di lapangan.

• Tahap aklimatisasi planlet merupakan salah satu tahap kritis yang sering menjadi kendala dalam produksi bibit secara massal. Pada tahap ini, planlet atau tunas mikro dipindahkan ke lingkungan di luar botol seperti rumah kaca, rumah plastik, atau screen house (rumah kaca kedap serangga).

e. Aklimatisasi (lanjutan)

• Tahap ini merupakan tahap kritis karena kondisi iklim mikro di rumah kaca, rumah plastik, rumah bibit, dan lapangan sangatlah jauh berbeda dengan kondisi iklim mikro di dalam botol. Kondisi di luar botol bekelembaban nisbi jauh lebih rendah, tidak aseptik, dan tingkat intensitas cahayanya jauh lebih tinggi drpd kondisi dalam botol. Planlet atau tunas mikro lebih bersifat heterotrofik karena sudah terbiasa tumbuh dalam kondisi berkelembaban sangat tinggi, aseptik, serta suplai hara mineral dan sumber energi tersedia.

• Prosedur pembiakan dengan kultur jaringan baru bisa dikatakan berhasil jika planlet dapat diaklimatisasi ke kondisi eksternal dengan keberhasilan yang tinggi.

• Aklimatisasi dapat dilakukan secara majemuk pada bedengan di bawah tempat yang teduh atau secara tunggal pada gelas bekas aqua yang diisi tanah subur ditambahkan pasir dengan perbandingan 1 : 1 . Pada saat aklimatisasi ini umumnya 2 minggu dengan sungkup dan 4 minggu tanpa sungkup. Dan pada saat itu planlet sudah mencapai tinggi 20 – 25 cm.

Selanjutnya bibit siap ditumbuhkan dalam polibag pot tuggal (single pot)

Nursery

• Tanaman perlu ditumbuhkan di nursery sampai mencapai tinggi 50 – 60 cm kemudian dipindahkan ke lapangan. Pisang hasil kultur yang siap ditanam di lapang.