ANALISIS CEMARAN DAGING BABI PADA SOSIS SAPI YANG BEREDAR DI PASAR PARUNG MENGGUNAKAN METODE REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

(1)

i

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ANALISIS CEMARAN DAGING BABI PADA SOSIS

SAPI YANG BEREDAR DI PASAR PARUNG

MENGGUNAKAN METODE REAL TIME

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

SKRIPSI

SAFIZAH UMMU HARISAH

1112102000010

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN JAKARTA

(2)

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ANALISIS CEMARAN DAGING BABI PADA SOSIS

SAPI YANG BEREDAR DI PASAR PARUNG

MENGGUNAKAN METODE REAL TIME

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

SAFIZAH UMMU HARISAH

1112102000010

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN JAKARTA

(3)

iii

(4)

iv

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING

(5)

v

(6)

vi

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta ABSTRAK

Nama : Safizah Ummu Harisah Program Studi : Strata-1 Farmasi

Judul : Analisis Cemaran Daging Babi pada Sosis Sapi yang Beredar di Pasar Parung Menggunakan Metode Real Time

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Sosis adalah produk makanan yang diperoleh dari campuran daging halus dengan tepung atau pati dengan atau tanpa penambahan bumbu-bumbu dan bahan tambahan makanan lain. saat ini kemajuan teknologi telah mengalami peningkatan di bidang analisis halal. Teknologi tersebut diaplikasikan untuk mempermudah pengujian bahan halal yang terkontaminasi bahan haram. Salah satu alat yang digunakan untuk deteksi kehalalan makanan adalah PCR. Pada penelitian ini, metode Real Time Polymerase Chain Reaction digunakan untuk mengidentifikasi cemaran DNA babi pada 6 produk sosis sapi yang beredar di Pasar Parung. DNA genom daging babi, daging sapi dan sampel sosis sapi diisolasi dengan reagen KIT (Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega). DNA diamplifikasi pada daerah spesifik DNA mitokondria sitokrom b dengan menggunakan sepasang primer spesifik DNA babi dan primer spesifik DNA sapi dengan jumlah siklus sebanyak 30 siklus. Hasil kurva amplifikasi menggunakan primer spesifik DNA sapi, menunjukkan bahwa semua DNA sampel sosis dan kontrol positif DNA sapi dapat teramplifikasi, sedangkan kontrol negatif DNA babi dan kontrol negatif ddH2O tidak teramplifikasi. Hasil primer spesifik DNA

babi menunjukkan bahwa hanya sampel kontrol positif (DNA babi) yang menghasilkan kurva amplifikasi pada CP 19.97. Dengan demikian, dari 6 sampel sosis yang diperiksa, tidak ada DNA mitokondria sampel yang teramplifikasi dengan menggunakan primer spesifik DNA babi.

(7)

vii

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta ABSTRACT

Name : Safizah Ummu Harisah Program Study : Strata-1 Pharmacy

Title : Analysis Contamination of pork in Sausage Beef which Distributed In Parung Region Using Real Time PCR

The sausage is a food product derived from a mixture of delicate meat with flour or starch with or without the addition of spices and other food additives. the current technological advances have improved in the areas of analysis kosher. The technology is applied to facilitate the testing of materials contaminated halal haram ingredients. One of the tools used for the detection of halal food is PCR. In this study, Real Time Polymerase Chain Reaction method was used to identify the pork contamination in 6 beef sausage products which distributed in the Parung market. DNA genome of pork, beef, and beef sausage samples was isolated using KIT reagents (Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega). DNA was amplified in a specific area of mitochondrial cytochrome b DNA by porcine specific primer and bovine specific primer as much as 30 cycle. The results of DNA amplification curves by bovine specific primers indicating that all the DNA samples of sausages and control positive bovine DNA can be amplified, while the negative control porcine DNA and negative control ddH2O are not amplified. Results of porcine DNA specific primers showed that only positive control samples (porcine DNA) which generate amplification curves in CP value 19.97. Therefore, from 6 samples of sausages which are examined there is no mitochondrial DNA samples are amplified by porcine specific primers.

(8)

viii

K

ATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang Maha pengasih dan Maha penyayang, yang telah memberi kekuatan kepada penulis, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Shalawat dan salam senantiasa terlimpahkan kepada Baginda Rasul, Nabi Muhammad SAW yang merupakan suri tauladan bagiumatnya.

Skripsi ini disusun dalam rangka memenuhi salah satu persyaratan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Dalam melaksanakan penyusunan skripsi ini, penulis menyadari bahwa penyusunan ini tidak lepas dari bantuan berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis menyampaikan terimakasih kepada :

1. Ibu Ofa Suzanti Betha, M.Si., Apt sebagai Pembimbing I dan Ibu Dr. Zilhadia, M.Si., Apt sebagai Pembimbing II yang telah memberikan ilmu, nasehat, waktu, tenaga dan pikiran selama penelitian dan penulisan skripsi ini.

2. Bapak Chris Adhiyanto, M.Biomed,Ph.D dan Bapak Hendri Aldrat, M.Si. Ph.D.Apt sebagai Penguji telah memberikan ilmu, saran dan nasehat kepada penulis.

3. Bapak Dr. Arif Sumantri S.K.M, M. Kes. Selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

4. Ibu Dr. Nurmeilis, M.Si., Apt., selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

5. Bapak Drs. Umar Mansur, M.Sc, Apt selaku pembimbing akademik yang telah memberikan arahan selama masa perkuliahan.

6. Bapak dan Ibu staf pengajar, serta karyawan yang telah memberikan bimbingan dan bantuan selama menempuh pendidikan di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

7. Kedua orang tua, Ayah tercinta Iljam Ebentap lubis, umma tersayang Asmia Hasibuan S.Pd.I yang selalu ikhlas memberikan kasih sayang,dukungan moral

(9)

ix

dan materil, nasehat-nasehat yang membantu penulis bersemangat tersenyum dan tertawa, serta lantunan do‟a setiap waktu.

8. Kakak tercinta, Ummu Salimah Albajaliah Lubis S.Pd.I, Abang M.Febryansah Hasibuan S.Pd.I. adek-adek tersayang Irwan Junaidi Lubis, M.Asril Husein Lubis, Hapipa Aswita Lubis, Rizki Khoirunnisa Lubis, yang memberikan semangat dan doa tanpa henti2nya, dan memberi tawa yang luar biasa.

9. Sahabat seperjuangan dalam suka maupun duka dalam menjalankan penelitian ini, semoga kita sama-sama sukses dunia dan akhirat “Vesty Anis Triana”. 10. Sahabat-sahabat terkasih Ayu Nopita, Apriliana Nur, Chalila Deli Gayo, Dwi

Putri Rahmawati, Vesty Anis Triana, Ratnika Sari, Tharlis Diansyah Lubis serta teman-teman Farmasi 2012 atas semangat dan kebersamaan kita selama perkuliahan berlangsung. Semoga ukhuwah yang telah terjalin tidak pernah putus dan akan terus berlanjut.

11. Sahabat dalam mencari ilmu di perantauan yang selalu memberikan semangat tanpa diminta M. Misbahuddin Mukhlis SE., Nasyidah Hannum.

12. Teman-teman seperjuangan selama di pondok pesantren Al-mukhlishin Sibuhuan selama merantau mencari ilmu di Jakarta “IKAYAMIN JAKARTA” 13. Teman-teman Himpunan Mahasiswa Padang Lawas (HIMAPALAS) atas semangat dan kebersamaan kita selama berperoses diorganisasi berlangsung. 14. Teman-teman seperjuangan “DIGOXYN” Farmasi UIN 2012 atas

kebersamaan kita selama ini.

15. Semua pihak yang telah membantu penulis selama melakukan penelitian dan penulisan yang tidak dapat disebutkan satu per satu.

Semoga semua bantuan yang telah diberikan mendapatkan balasan dari Allah SWT. Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penulisan ini, oleh karena itu kritik dan saran sangat diharapkan demi perbaikan skripsi ini. Dan semoga skripsi ini bisa bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan.

Ciputat, 28 Februari 2017

(10)

x

(11)

xi

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ... ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS ... iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... iv

HALAMAN PENGESAHAN ... v

ABSTRAK ... vi

ABSTRACT ... vii

KATA PENGANTAR ... viii

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ... x

DAFTAR ISI ... xi

DAFTAR TABEL ... xiv

DAFTAR GAMBAR ... xv

DAFTAR LAMPIRAN ... xvi

DAFTAR SINGKATAN ... xvii

DAFTAR ISTILAH ... xviii

BAB I PENDAHULUAN ... 1

1.1 Latar Belakang ... 1

1.2 Rumusan Masalah ... 2

1.3 Tujuan ... 2

1.4 Manfaat ... 2

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 4

2.1 Daging Babi ... 4

2.2 Organel Sel ... 4

2.3 Protein dan Asam Nukleat ... 6

2.4 DNA ... 6

2.4.1 Struktur dan Sifat Kimia DNA ... 6

2.4.2 Sifat Fisika DNA ... 8

2.4.3 Fungsi DNA ... 8

2.4.4 Isolasi DNA ... 8

2.5 DNA Mitokondria ... 11

2.6 Polymerase Chain Reaction (PCR) ... 13

(12)

xii

2.6.1 Komponen PCR... 14

2.6.2 Tahapan PCR... 15

2.6.3 Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Lenght Polimorfisme (PCR-RFLP) ... 17

2.7 Real Time PCR ... 18

2.7.1 Analisis Menggunakan Metode Hydrolysis Probe ... 20

2.8 Daging Sosis ... 23

BAB III METODE PENELITIAN ... 25

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ... 25

3.1.1 Tempat ... 25

3.1.2 Waktu ... 25

3.2 Alat dan Bahan ... 25

3.2.1 Alat ... 25 3.2.2 Bahan ... 25 3.3 Tahapan Penelitian ... 26 3.4 Prosedur Kerja ... 26 3.4.1 Pengumpulan Sampel ... 26 3.4.2 Isolasi DNA ... 26

3.4.3 Analisis DNA Hasil Isolasi dengan Spektrofotometri UV ... 27

3.4.4 Amplifikasi DNA dengan Metode Real Time PCR ... 28

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 29

4.1 Hasil Analisis DNA dengan Spektrofotometri UV ... 29

4.2 Uji Cemaran DNA Babi pada Sampel Sosis Sapi ... 32

4.2.1 Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi dan NTC Menggunakan Primer Sapi ... 34

4.2.2 Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Sampel Sosis Sapi dan NTC Menggunakan Primer Sapi ... 36

4.2.3 Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi dan NTC Menggunakan Primer Babi ... 38

4.2.4 Hasil Amplifikasi DNA Daging Babi, Sampel Sosis Sapi dan NTC Menggunakan Primer Babi ... 39

(13)

xiii

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 40

5.1 Kesimpulan ... 40

5.2 Saran ... 40

DAFTAR PUSTAKA ... 41

(14)

xiv

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

Tabel 1 Perbandingan Sel Prokariot dan Sel Eukariotik 5 Tabel 2 Kelebihan dan Kelemahan RFLP 18 Tabel 3 Kelebihan dan Kekurangan Real Time PCR 20 Tabel 4 Tahapan Proses Flurosensi Hydrolysis Probe 22 Tabel 5 Susunan Basa Primer dan probe 26 Tabel 6 Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA 30 Tabel 7 Program Dual Color Hydrolysis Probe-UPL Probe 96-II 33

(15)

xv

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 1 Sel Prokariot dan Eukariot 5 Gambar 2 Struktur Purin dan Pyrimidin 7 Gambar 3 Struktur Double Heliks DNA 7 Gambar 4 Struktur Mitokondria 12 Gambar 5 Struktur mtDNA 12 Gambar 6 Untai DNA Mengalami Denaturasi 16 Gambar 7 Penempelan Primer dengan Untai DNA 16 Gambar 8 Perpanjangan DNA Secara Semi-Konservatif 17 Gambar 9 Proses Amplifikasi DNA Target 17 Gambar 10 Bentuk Kurva pada Real Time PCR 19 Gambar 11 Kurva Real Time PCR yang Menunjukkan Hasil

Amplifikasi Menggunakan Primer Spesifik Sapi

34

Gambar 12 Kurva Real Time PCR yang Menunjukkan Hasil Amplifikasi Menggunakan Primer Spesifik Sapi dan sampel

36

Gambar 13 Kurva Real Time PCR yang Menunjukkan Hasil Amplifikasi Menggunakan Primer Spesifik Babi

38

Gambar 15 Kurva Real Time PCR yang Menunjukkan Hasil Amplifikasi Menggunakan Primer Spesifik Babi dan sampel

(16)

xvi

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

Lampiran 1. Konsentrasi dan Kemurnian Hasil Isolasi 46 Lampiran 2. Perhitungan Pembuatan Larutan Primer 47 Lampiran 3. Perhitungan Tm (Melting Temperature) Primer 48 Lampiran 4. Komponen Campuran Reaksi Real Time PCR 49 Lampiran 5. Hasil Kurva Amplifikasi 50 Lampiran 6. Alat-Alat yang digunakan dalam Penelitian 52

(17)

xvii

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR SINGKATAN

AFL : Arbitrary Fluorescence Level BLAST : Basic Local Aligment Search Tool CP : Crossing Point

cyt b : Cytochrome b

dATP : Deoxyadenosine Triphosphate dCTP : DeoxyCytidine Triphosphate dGTP : Deoxyguanosine Triphosphate dNTP : Deoxyribonucleaside Triphosphate dNTPS : Deoxyribonucleaside Triphosphates dTTP : Deoxythymidine Triphosphate DNA : Deoxyribonucleic Acid

EDTA : Etilen Diamin Tetra Asetat FAM : Fluorescein Amidite MtDNA : mitochondria DNA NLS : Nuclei Lysis Solution NTC : No Template Control pb : Pasang Basa

PCR : Polymerase Chain Reaction

PCR-RFLP : Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Lenght

Polimorfisme

Pfu : Pyrococcus Furiosus

PPS : Protein Precipitation Solution

qPCR : Quantitative Polymerase Chain Reaction RFLP : Restriction Fragment Lenght Polimorfisme

RNA : Ribonucleic Acid

RT-PCR :Real Time Polymerase Chain Reaction

SDS : Sodium Dodesil Sulfat Tag : Thermus Aquaticus Tm : Temperature Melting

(18)

xviii

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR ISTILAH

BLAST : Basic Local Aligment Search Tool merupakan

program untuk menganalisis kesejajaran sekuen query (DNA) atau protein dengan sekuen DNA atau protein pada database NCBI.

CP : Crossing Point merupakan siklus yang menunjukkan sinyal fluoresensi dari akumulasi amplikon telah melewati garis threshold.

Garis Treshold : Garis penanda siklus awal dari reaksi PCR yaitu

saat sinyal fluoresensi berada pada tingkat terendah (siklus 3-15).

Formasi Hairpin : Terbentuknya struktur loop/hairpin pada primer yang disebabkan oleh interaksi intramolekular yang dapat memicu terbentuknya amplifikasi yang nonspesifik.

Melting Curve : Analisis data pada Real time PCR digunakan untuk menguji spesifisitas amplikon yang terbentuk.

Mis-priming : Penempelan primer di luar sekuen target sehingga membentuk produk amplfikasi yang nonspesifik. NCBI : National Center for Biotechnology Information

merupakan suatu institusi milik United States

National Library of Medicine yang berperan

sebagai sumber informasi perkembangan biologi molekular. Situs NCBI berisi database meliputi

gene bank mengenai sekuens DNA atau protein

serta memuat publikasi ilmiah.

NTC : No Template Control merupakan kontrol negatif

karena well tidak dimasukkan DNA.

Primer-Dimer : berikatannya suatu primer dengan primer sejenis atau dengan primer lainnya sehingga membentuk produk amplifikasi yang nonspesifik

Query : Sekuen yang dimasukkan ke dalam program BLAST untuk diketahui kesejajarannya.

Tm : Temperature melting atau suhu melting adalah

suhu saat 50% bagian DNA telah terbuka menjadi untai tunggal.

(19)

1

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB I

PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang

Islam mengajarkan umat muslim untuk menghindari hal yang dilarang dalam Al Qur‟an dan Al Hadist. Al Qur‟an sangat tegas menyatakan kehalalan dan keharaman makanan. Aturan tentang kehalalan makanan termuat dalam banyak ayat, salah satunya pada Surat Al-Baqarah (2) : 173 :

“Sesungguhnya Allah hanya mengharamkan bagimu bangkai, darah, daging babi, dan binatang yang (ketika disembelih) disebut (nama) selain Allah”. Haramnya babi juga dijelaskan dalam firman Allah Surat Al-Ma‟idah (5) :

3, Surat Al-An‟am (6) : 145, dan Surat An-Nahl (16) : 115.

Indonesia merupakan negara dengan mayoritas penduduknya beragama Islam. Hal ini seharusnya menjadi kewajiban bagi pemerintah untuk melindungi konsumen dari beredarnya makanan haram yang ada dipasaran. Namun pencampuran makanan halal dengan bahan yang diharamkan masih terjadi di masyarakat. Pada tahun 2012 ditemukan adanya bakso sapi yang dicampur dengan daging babi di wilayah Jakarta. September 2015 juga ditemukan kasus pencampuran daging babi pada bakso di pasar tradisional kota malang (Wardani, 2015). Tujuan pencampuran tersebut untuk menghasilkan produk akhir dengan harga yang lebih murah dibandingkan menggunakan bahan aslinya, mengingat harga daging sapi yang semakin mahal (Margawati dan Ridwan, 2010). Oleh sebab itu, untuk menghindari adanya makanan yang dicampur dengan bahan haram, dibutuhkan pengembangan uji analisis yang dapat dipercaya dan sensitif dalam pendeteksian bahan makanan (Rahmawati, 2012).

Pada saat ini kemajuan teknologi telah mengalami peningkatan di bidang analisis halal. Teknologi tersebut dapat diaplikasikan dan mempermudah pengujian bahan halal yang terkontaminasi bahan haram. Salah satu alat yang digunakan untuk deteksi kehalalan makanan adalah PCR. Seperti halnya

(20)

2

pengujian cemaran daging babi pada makanan diperoleh dari hipermarket lokal yang berbeda di Saudi Arabia melalui amplifikasi PCR (Alaraidha, 2008). Pratami 2011 telah melakukan identifikasi daging babi pada burger sapi melalui amplifikasi real time PCR. Begitu juga Mulyana (2010) yang melakukan identifikasi daging babi pada kornet sapi dengan menggunakan metode

polymerase chain reaction (PCR).

Walaupun PCR memberikan hasil yang cukup sensitif dan akurat, metode ini membutuhkan pemisahan produk pasca PCR dengan menggunakan gel elektroforesis yang memakai waktu lebih lama dan hanya semi-kuantitatif (Vivikananda, 2014). Tetapi kelemahan ini dapat di atasi dengan real time PCR yang menggunakan sistem fluoresensi sehingga hasil amplifikasi dapat dideteksi secara cepat dan dilihat secara langsung. Keunggulan teknik real time PCR dibandingkan dengan PCR konvensional antara lain adalah akurasi dan sensitivitas yang lebih tinggi, menurunkan kemungkinan terjadinya kontaminasi dan waktu analisa yang lebih singkat karena tidak perlu melakukan elektroforesis dan identifikasi suatu produk makanan dengan menggunakan pewarna dye SYBR green dan primer spesifik sapi (Liyana, K. et a.l, 2009).

Penelitian ini bertujuan untuk menganalisa cemaran DNA babi pada bahan makanan olahan dengan menggunakan metode real time PCR. Bahan makanan yang diuji adalah sosis sapi dengan merek yang berbeda yang diperoleh dari pasar Parung.

1.2 Rumusan Masalah

Apakah sosis sapi yang beredar di Pasar Parung tercemar daging babi.

1.3 Tujuan Penelitian

Menganalisis cemaran daging babi pada sosis sapi yang beredar di Pasar Parung menggunakan metode real time PCR

1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini adalah memberikan informasi untuk masyarakat tentang kehalalan sosis sapi yang beredar di pasar Parung. Hal ini dilakukan

(21)

3

sebagai dharma UIN terhadap masyarakat sekitar sehingga masyarakat lebih berhati-hati dan bijaksana dalam mengonsumsi olahan daging seperti sosis sapi.

(22)

4

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Daging Babi

Babi adalah sejenis hewan ungulata yang bermancung panjang dan berhidung ceper pemakan daging maupun tumbuh-tumbuhan dan merupakan hewan yang berasal dari Eurasia. Daging babi merupakan daging yang sangat sulit dicerna karena banyak mengandung lemak. Meskipun dagingnya empuk dan terlihat begitu enak dan lezat. Babi juga memiliki lemak punggung yang tebal dan bersifat oxidative rancidity, sehingga secara struktur kimia sudah tidak layak dikonsumsi. Penelitian ilmiah modern di dua negara yaitu Cina dan Swedia menyatakan bahwa daging babi merupakan penyebab utama kanker anus dan kolon. Babi banyak mengandung parasit, bakteri, bahkan virus yang berbahaya sehingga dikatakan sebagai Reservoir penyakit (Hilda, 2013).

2.2 Organel sel

Sel yang menyusun makhluk hidup tingkat tinggi memang sangat kecil ukurannya sehingga tidak dapat dilihat dengan alat bantu yang sederhana, tetapi memiliki tugas yang sangat besar layaknya sebuah kota yang memiliki bagian-bagian untuk menunjang kehidupan kota. Bagian-bagian-bagian yang menunjang kehidupan sel disebut organel-organel (Yuni et al, 2006).

Organisme yang hidup saat ini dibagi menjadi dua kelompok besar, yaitu prokariot dan eukariot.

(23)

5

Prokariot Eukariot

Gambar 2.1. Sel Prokariot dan Eukariot (Widyastuti, 2012).

Tabel 1. Perbandingan Sel Prokariotik dan Sel Eukariotik

Ciri Sel Prokariotik Sel Eukariotik

Ukuran ~ 1-10 mm ~10-100 mm (sel sperma, terpisah dari bagian ekornya, berukuran lebih kecil) Tipe inti Daerah nukleoid;

tanpa inti sejati

Inti sejati dengan membran ganda

DNA Umumnya sirkular Linear (kromosom) dengan protein histon Sintesis

RNA/Protein

Keduanya berlangsung di sitoplasma

Sintesis RNA berlangsung di dalam hati. Sintesis protein berlangsung di sitoplasma Ribosom 50S dan 30S 60S dan 40S

Struktur sitoplasmatik

Sederhana Sangat terstruktur dengan adanya membran intraseluler dan sitoskeleton

Pergerakan sel Flagela yang tersusun atas protein flagelin

Flagela dan silia yang tersusun atas protein tubulin

Mitokondria Tidak ada Satu sampai beberapa lusin (beberapa tidak memiliki mitokondria)

Kloroplas Tidak ada Pada alga dan tanaman

Organisasi Umumnya satu sel Sel-sel tunggal, koloni, organisme tingkat tinggi dengan sel terspesialisasi

Pembelahan sel Pembelahan biner Mitosis (pembelahan inti) dan sitokinesis (pembelahan sitoplasmatik)

(24)

6

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Jenis organisme Bakteri dan archaea Protista, fungi, tanaman, hewan

2.3 Protein dan Asam Nukleat

Protein dan asam nukleat merupakan senyawa polimer utama yang terdapat pada sel. Protein merupakan produk dari aliran informasi genetik. Sel membutuhkan ribuan protein yang berbeda setiap waktu.

Asam nukleat merupakan polimer dari ratusan, ribuan, bahkan jutaan nukleotida yang bergabung satu sama lainnya melalui ikatan fosfodiester. Asam nukleat merupakan suatu polinukleotida, yaitu polimer linier yang tersusun dari monomer-monomer nukleotida yang berikatan melalui ikatan fosfodiester. Fungsi utama asam nukleat adalah sebagai tempat penyimpanan dan pemindahan informasi genetik. Informasi ini tersusun dari sel induk ke sel anak melalui proses reflikasi. Sel memiliki dua jenis asam nukleat yaitu asam deoksiribonukleat (deoxyribonucleic acid/DNA) dan asam ribonukleat (ribonucleic acid/RNA) (Kusuma, 2010).

2.4 DNA

2.4.1 Struktur dan Sifat Kimia DNA

DNA dan RNA merupakan polimer linier (polinukleotida) yang tersusun dari subunit atau monomer nukleotida. Komponen penyususn nukleotida terdiri dari tiga jenis molekul, yaitu gula pentosa (deoksiribosa pada DNA atau ribosa pada RNA), basa nitrogen dan gugus fosfat. Basa yang ditemukan pada nukleotida adalah basa purin (adenin = A, guanin = G) dan basa pirimidin (cytosin = C, tymin = T, urasil = U). Monomer nukleotida mempunyai gugus hidroksil pada posisi karbon 3‟, gugus fosfat pada posisi karbon 5‟ dan basa pada posisi karbon 1‟ molekul gula. Nukleotida satu dengan yang lainnya berikatan melalui ikatan fosfodiester antara gugus 5‟ fosfat dengan gugus 3‟ hidroksil (Gaffar, 2007).

(25)

7

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Gambar 2.2 Struktur Purin dan Pirimidin (Adenin dan Guanin;

Cytosin, Tymin dan Urasil) (Gaffar, 2007)

Struktur molekul DNA terdiri atas dua rangkaian nukleotida yang tersusun secara linier. Kedua rangkaian yang saling berikatan itu terbentuk seperti tali berpilin, sehingga molekul DNA dikatakan sebagai double helixs (heliks ganda). Untuk membentuk rangkaian molekul DNA heliks ganda, basa nitrogen dari setiap nukleotida dalam satu rangkaian akan berpasangan dengan basa nitrogen dari setiap nukleotida pada rangkaian lainnya melalui ikatan hidrogen. Pengikatan basa nitrogen dari masing-masing nukleotida tersebut sangat spesifik. Basa A dari satu nukleotida selalu berikatan dengan basa T dari nukleotida lainnya, sedangkan basa G selalu berikatan dengan basa C. Pasangan A dan T terbentuk dengan dua ikatan hidrogen, sedangkan pasangan G dan C terbentuk dengan tiga ikatan. Oleh karena itu, pasangan G dan C lebih stabil dari pada pasangan A dan T (Pratami, 2011).

Gambar 2.3. Struktur Double Helixs DNA

Untai ganda molekul DNA dapat dipisahkan atau terdenaturasi dengan perlakuan suhu maupun senyawa alkali sehingga konformasinya berubah. Tingkat denaturasi DNA tergantung pada tingginya suhu. Semakin tinggi suhunya maka

(26)

8

semakin banyak bagian DNA yang berubah menjadi struktur untai tunggal. Denaturasi lengkap biasanya terjadi pada suhu 90OC. Selain dapat terdenaturasi, DNA juga dapat terrenaturasi, yaitu untai tunggal yang terdenaturasi menjadi untai ganda kembali dengan adanya ikatan hidrogen. Suhu renaturasi biasanya sekitar 60OC. Faktor lain yang menentukan laju renaturasi adalah konsentrasi DNA. Semakin tinggi konsentrasinya maka probabilitas tumbukan antara molekul untai tunggal DNA menjadi semakin besar (Sriati, 2011).

2.4.2 Sifat Fisika DNA

DNA akan terpisah dari rantai komplemennya (denaturasi) pada suhu mendekati titik didih dan pH ekstrim (pH<3 atau pH>10) dan bisa bergabung kembali (renaturasi) pada suhu ± 60OC. DNA menyerap sinar UV pada panjang gelombang 260 nm. (Pratami, 2011).

2.4.3 Fungsi DNA

DNA adalah dasar kimiawi hereditas dan penyususn gen yang menjadi unit fundamental informasi genetik. Informasi genetik yang disimpan dalam nukleotida berfungsi untuk memenuhi dua tujuan, yaitu sumber informasi bagi sintesis semua molekul protein pada sel serta organisme dan memberikan informasi yang diwariskan kepada anak atau generasi berikutnya (Pratami, 2011).

2.4.4 Isolasi DNA

Semua organisme disusun oleh sel yang mengandung elemen genetik yang sama yaitu DNA yang terdapat dalam kromosom. Kromosom eukariot berbentuk linear sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. Selain itu prokariot juga mengandung satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan molekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh lebih kecil dibanding kromosom (Gaffar, 2007).

Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganisme, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan buffer yang mengandung satu atau lebih detergen, contohnya SDS, NP-40, atau Triton X-100 untuk membebaskan isinya. Kotoran sel yang ditimbulkan akibat

(27)

9

pengrusakan oleh detergen tersebut dibersihkan dengan cara sentrifugasi. Kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan proteinase yang berfungsi untuk mendegradasi RNA, sehingga tertinggal hanyalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90OC untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air (Danuz, 2014).

Isolasi DNA saat ini lebih mudah dengan adanya bantuan teknologi canggih yang disebut purifikasi DNA yang menghasilkan isolasi DNA dengan kemurnian tinggi, hasil yang cepat, dan penggunaan yang mudah. Purifikasi DNA menggunakan seperangkat mesin dengan reagen kit pemurnian DNA yang bekerja secara otomatis, singkat dan efisien. Pemurnian DNA dapat dilakukan dari darah, sel-sel, dan sampel jaringan. Instrumen ini dapat memproses sampai dengan 16 sampel dalam waktu 30-45 menit. DNA yang telah dimurnikan dapat digunakan langsung dalam berbagai aplikasi termasuk PCR, restriksi oleh enzim endonuklease, dan elektroforesis gel agarosa. Instrumen ini dapat memproses sampel cair dan padat. Dilengkapi dengan cartridge yang berisi lysis buffer, MagnesiI® PMPs dan wash buffer (Promegaa, 2007). Pada mesin purifikasi DNA, sampel yang telah dilisis oleh buffer lisis, dicuci dengan wash buffer dan dielusi dengan elution buffer menggunakan bantuan Magnesil PMPs (Pratami, 2011). Berikut adalah uraian tahapan isolasi DNA :

1. Penghancuran Membran Sel (lisis)

Penghancuran membran sel bisa dilakukan secara fisik misalnya dengan cara sonikasi, maupun dengan cara kimia yaitu dengan menggunakan enzim lisozim, etilen diamin tetra asetat (EDTA), atau kombinasi dari keduanya (Radji, 2011). Penggunaan lisozim biasanya untuk ekstraksi dan isolasi DNA dari sel tumbuhan. EDTA merupakan zat yang dapat merusak membran sel dengan cara mengikat ion Mg2+ yang berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat (Izzah, 2014). Pada kondisi tertentu pemecahan dinding sel cukup dilakukan dengan lisozim dan EDTA, akan tetapi juga sering ditambahkan bahan lain yang dapat melisiskan dinding sel antara lain

(28)

10

detergent triton X-100 atau sodium dodesil sulfat (Radji, 2011). SDS merupakan detergent yang dapat merusak integritas membran sel dengan cara mengikat lipid yang terdapat pada membran sel (Izzah, 2014). Setelah sel lisis, tahapan selanjutnya adalah memisahkan sel dibris dengan cara sentrifugasi sehingga meninggalkan ekstrak sel dalam supernatan yang jernih (Radji, 2011).

2. Pemisahan DNA dari Protein Sel

Disamping DNA, ekstrak sel juga mengandung protein dan RNA dalam jumlah yang cukup besar. Umumnya cara pemisahan DNA dilakukan dengan penambahan larutan fenol atau campuran fenol dan kloroform dengan perbandingan 1:1. Sedangkan untuk pengendapan protein dengan cara sentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA (Radji, 2011).

3. Pemurnian DNA

Tahap akhir dari isolasi DNA adalah proses pemurnian DNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan cara presipitasi etanol. Dengan adanya larutan garam (kation monovalen seperti Na+), pada suhu -20oC etanol absolut dapat mengendapkan DNA dengan baik sehingga mudah dipisahkan dengan cara sentrifugasi (Radji, 2011).

Pada umumnya, isolasi DNA dengan metode konvensional yang dijelaskan sebelumnya cukup melelahkan karena membutuhkan waktu hingga beberapa jam bahkan sampai beberapa hari (Izzah, 2014). Seiring berkembangnya ilmu pengetahuan dan teknologi, metode isolasi DNA telah banyak dikembangkan dan digunakan dalam sebuah penelitian. Salah satu metode yang mudah pengerjaannya serta dapat menghasilkan DNA dengan kemurnian tinggi yaitu dengan menggunakan metode kit komersial (Nishiguchi Michele K et al, 2002).

Metode kit komersial tidak hanya digunakan untuk mengisolasi DNA dari produk makanan olahan tetapi juga dirancang untuk mengisolasi DNA yang berasal dari sel darah putih, sel kultur jaringan hewan, jaringan tanaman, dan juga

(29)

11

dari bakteri gram negatif serta gram positif (Promega, 2014). Keuntungan yang dihasilkan dari metode isolasi DNA dengan menggunakan kit diantaranya menghemat waktu selama proses isolasi karena dapat menghasilkan jumlah DNA hanya beberapa menit saja, meningkatkan sensitifitas dan keunggulan PCR dalam menganalisis karena pada proses isolasi menghasilkan DNA dengan kemurnian yang tinggi, mengurangi seminimal mungkin jumlah kontaminan pada DNA yang dihasilkan, dan dapat digunakan untuk penelitian karena metode kit komersial dapat memurnikan DNA yang berasal dari berbagai sumber (Roche, 2007).

Pengukuran kemurnian dan jumlah DNA hasil isolasi dapat dilakukan melalui spektrofotometer yang didasarkan pada prinsip iradiasi sinar ultraviolet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam larutan. Penyerapan iradiasi sinar UV secara maksimal oleh DNA dicapai pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan penyerapan oleh protein pada panjang gelombang 280 nm. Perbandingan absorbansi pada 260 nm dan 280 nm (A260/A280) dapat memberikan

validasi kemurnian DNA. Hasil isolasi DNA dikatakan murni jika nilai rasio A260/280 antara 1,8-2,0. Nilai rasio yang lebih rendah dari 1,8 menunjukkan adanya

kontaminasi protein sedangkan nilai rasio melebihi 2,0 menunjukkan adanya kontaminasi RNA (Hidayat, 2015).

2.5 DNA Mitokondria

DNA mitokondria (mtDNA) adalah molekul DNA rantai ganda yang berbentuk sirkuler yang ditransmisikan secara maternal dan ukurannya relative sangat kecil dibandingkan dengan ukuran genom intinya. DNA mitokondria merupakan DNA yang ada di mitokondria yang berperan dalam sintesis protein. Mitokondria adalah organel yang terletak di dalam sitoplasma eukariota yang diselaputi oleh dua membran dan dua kompartemen, yaitu membran dalam dan membran luar; matriks mitokondria (yang diselimuti langsung oleh membran dalam) dan ruang antar membran (Hidayat, 2015).

(30)

12

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Gambar 2.4. Struktur Mitokondria (Aparna, 2015)

Mitokondria memiliki diameter 1-2 µm dan mengandung bermacam-macam salinan DNA yang berbentuk sirkular. Jumlah dan bentuk setiap mitokondria berbeda-beda untuk setiap sel dengan tipe yang berbeda dan dapat beruba (Mulyana, 2010).

Struktur organisasi mtDNA bersifat stabil, sehingga mtDNA hewan memiliki jumlah gen dan ukuran yang sama, yakni terdiri atas 13 gen yang menyandikan protein yaitu URF1, URF2, URF3, URF4, URF5, URF6, URFA6L, URF4L, Cytochrom Oxidase unit I, Cytochrom Oxidase unit II, Cytochrom

Oxidase unit III, Cytochrom b dan ATPase 6 (terlibat dalam respirasi sel), 2 gen

menyandikan rRNA (12S dan 16S), 22 gen menyandikan tRNA dan beberapa daerah lain yang tidak menyandikan protein D-loop (Control Region) dan daerah

intergenic (Hidayat, 2015).

(31)

13

DNA mitokondria memiliki karakteristik yang mendukung dalam keperluan analisis biologi dan keragaman genetik, yaitu mtDNA mampu mengcopy diri dalam jumlah yang tinggi (menjadikannya mudah diisolasi), ukuran yang relatip kecil sekitar 14 kb sampai 34 kb sehingga dapat dipelajari sebagai satu kesatuan yang utuh, dan memiliki laju evolusi yang tinggi sekitar 5-10 kali lebih cepat dari DNA inti (Hidayat, 2015).

2.6 Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR merupakan suatu teknik amplifikasi DNA secara in vitro yang mampu mengamplifikasi segmen tertentu dari keseluruhan genom bakteri. Proses amplifikasi PCR melibatkan variasi suhu yang mendekati suhu didih air, maka diperlukan enzim polimerase yang tetap stabil dalam temperatur yang tinggi. Pada proses PCR, enzim polimerase yang digunakan berasal dari bakteri Thermus

aquaticus (Taq) yang hidup di lingkungan bersuhu lebih dari 90OC (Agung, 2010).

Target PCR yaitu asam nukleat (DNA) untai ganda yang diekstraksi dari sel dan terdenaturasi menjadi asam nukleat beruntai tunggal. Proses yang terjadi dalam mesin PCR meliputi tiga tahap utama yaitu pemisahan untai ganda DNA (denaturasi), penempelan primer (annealing) dan pemanjangan primer ekstensi

(ekstensi). Proses yang dimulai dari denaturasi, penempelan dan ekstensi disebut

sebagai satu siklus. Produk PCR dapat berlangsung melalui proses elektroforesis dan digunakan untuk analisis lebih lanjut. Produk PCR dipisahkan dengan elektroforesis gel yang diwarnai dengan bromida dan divisualisasikan dengan sinar ultraviolet (Esti, 2013).

PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer, dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkan ke dalam sel (in vivo). Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan yang mengandung DNA-target (yang akan di amplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir

(32)

14

fragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon 3‟. Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan nukleotida templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3‟ dengan gugus 5‟ fosfat dNTP yang ditambahkan. Proses penambahan dNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan arah 5‟-3‟ dan disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya akan menambahkan dNTP yang komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA templat (Gaffar, 2007).

2.6.1 Komponen PCR

Berikut adalah komponen yang diperlukan untuk reaksi PCR, yaitu : a. DNA cetak / DNA target

Merupakan keseluruhan DNA sampel yang di dalamnya terkandung fragmen DNA target.

b. Primer

Primer adalah suatu oligonukleotida yang memiliki 10 sampai 40 pb (pb = pasangan basa) dan merupakan komplementer dari DNA target. Pemilihan primer yang tidak sesuai dapat menyebabkan tidak terjadinya reaksi polimerasi antara gen target dengan primer. Berikut adalah kriteria pemilihan primer, yaitu :

1. Panjang primer : 15-30 pb 2. Kandungan GCsekitar 50%

3. Temperatur penempelan kedua primer tidak jauh berbeda 4. Urutan nukleotida yang sama harus dihindari

5. Tidak boleh terjadi self dimmer, pair dimmer, atau hairpin c. Enzim Taq DNA Polymerase

Polimerase adalah suatu molekul komplek yang memiliki tiga aktivitas diantaranya sebagai aktivitas polimerase dari ujung 5‟-3‟, aktivitas exonuclease (aktivitas pengoreksian) dari ujung 3‟-5‟dan bisa juga dari 5‟-3‟ (Viljoen.Gerrit.J et al, 2005). Enzim DNA polimerase berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA. Pada proses PCR,

(33)

15

enzim ini diperlukan untuk tahap ekstensi DNA. Enzim polimerase DNA yang digunakan untuk proses PCR diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik oleh karena itu enzim ini bersifat termostabil sampai temperatur 95oC. Aktivitas polimerase DNA bergantung dari jenisnya dan dari mana bakteri tersebut diisolasi. Sebagai contoh adalah enzim Pfu polimerase (diisolasi dari bakteri Pyrococcus furiosus) mempunyai aktivitas spesifik 10x lebih kuat dibandingkan aktivitas spesifik enzim

Taq polimerase (diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus). Penggunaan

jenis polimerase DNA berkaitan erat dengan buffer PCR yang dipakai (Handoyo, et al., 2001). Enzim ini tetap stabil mengamplifikasi DNA walaupun amplifikasi berjalan pada suhu mendekati titik didih air. d. Buffer / Dapar

Buffer atau Dapar yang digunakan umumnya mengandung MgCl2 yang

mempengaruhi stabilitas dan kerja enzim polimerase. e. dNTPS

dNTPS atau deoxynukleotide Triphosphates merupakan suatu nukleotida bebas yang berperan penting dalam perpanjangan primer melalui pembentukan pasangan basa dengan nukleotida dari DNA target.

2.6.2 Tahapan PCR

Ada tiga tahap pengulangan yang penting dalam proses PCR yaitu : 1. Denaturasi

Pada tahap ini molekul DNA dipanaskan sampai suhu 94OC yang menyebabkan terjadinya pemisahan untai ganda menjadi untai DNA tunggal. Untai DNA tunggal inilah yang menjadi cetakan bagi untai DNA baru yang akan dibuat.

(34)

16

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Gambar 2.6. Untai DNA mengalami denaturasi (Agung, 2010)

2. Penempelan (Annealing)

Enzim Tag polimerase dapat memulai pembentukan suatu untai DNA baru jika ada seuntai DNA berukuran pendek (DNA yang mempunyai panjang sekitar 10 sampai 30 pasang basa) yang menempel pada untai DNA target yang telah terpisah. DNA yang pendek ini disebut primer. Agar suatu primer dapat menempel dengan tepat pada target, diperlukan sushu yang rendah sekitar 55OC selama 30-60 detik.

Gambar 2.7. Penempelan primer dengan untai DNA yang telah

terdenaturasi (Agung, 2010) 3. Pemanjangan (Ektension)

Setelah primer menempel pada untai DNA target, enzim DNA polimerase akan memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang baru dari gabungan antara primer, DNA cetakan dan nukleotida. (Agung, 2010)

(35)

17

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Gambar 2.8. Perpanjangan DNA secara Semi-konservatif (Agung, 2010)

Ketika tiga tahap diatas dilakukan pengulangan, maka untai DNA yang baru dibentuk akan kembali mengalami proses denaturasi, penempelan dan pemanjangan untai DNA menjadi untai DNA baru. Pengulangan proses PCR akan menghasilkan amplifikasi DNA cetakan baru secara eksponensial. (Agung, 2010).

Gambar 2.9. Proses Amplifikasi DNA Target (Agung, 2010).

2.6.3 Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Lenght Polimorfisme (PCR-RFLP)

Banyak metode yang dapat digunakan untuk melakukan analisis DNA, salah satunya yaitu amplifikasi dengan PCR-RFLP. Teknik ini adalah salah satu teknik penandaan DNA yang didasarkan pada perbedaan sisi pemotongan (situs

Amplifikasi secara

eksponensial

(36)

18

restriksi). Enzim restriksi endonuklease yang dapat mendigesti DNA akan memotong DNA pada sisi-sisi restriksi tertentu menjadi fragmen-fragmen yang kemudian dengan analisis elektroforesis gel dapat ditentukan analisis yang diinginkan sesuai dengan markernya masing-masing (Uswahdani, 2013).

Metode PCR-RFLP yang memanfaatkan amplifikasi dengan primer spesifik atau universal yang diikuti dengan pemotongan menggunakan enzim restriksi endonuklease telah banyak digunakan untuk penentuan filogeni tanaman. Pemanfaatan PCR-RFLP dalam identifikasi dan penentuan filogeni pada tanaman telah banyak dilakukan, antara lain pada fungi, Phaseolus dan pisang (Ekasari, 2011).

Tabel 2. Kelebihan dan Kelemahan Restriction Fragment Lenght Polimorfisme (RFLP)

Kelebihan Kelemahan

Bersifat kodominan sehingga sangat baik untuk komparatif pemetaan genom. Polymorphisme akan menghasilkan perbedaan ukuran fragmen yang terpotong, sehingga setiap siklus restriksi dapat dipetakan, dapat diturunkan dari nuclear genom, kloroplas genom, dan mitokondria genom (Nurlaily, 2012).

Menyita banyak tenaga dan waktu, kuantitas dan kualitas DNA yang diperlukan sangat tinggi, prosedur hibridisasinya rumit, sehingga menyulitkan otomatisasi, dan memerlukan pustaka probe untuk spesies-spesies tanaman yang belum pernah dieksplorasi sebelumnya (Nurlaily, 2012).

2.7 Real Time PCR

Real time polymerase chain reaction (RT-PCR) adalah salah satu teknik

yang paling banyak digunakan dalam biologi molekuler. Real time PCR memiliki berbagai keunggulan. Selain amplifikasi atau perbanyakan DNA fragmen dapat diamati secara cepat, teknik ini juga dapat menentukan konsentrasi DNA yang

(37)

19

terdapat pada sampel. Maka teknik ini disebut quantitative PCR (qPCR) (Sriati, 2011).

Instrumen real time PCR mendeteksi amplikon dengan mengukur peningkatan pewarna (dye) fluorescent yang berpendar ketika terikat dengan

double-stranded DNA. Karena sifat inilah maka pertumbuhan fragment DNA

hasil amplifikasi dapat diikuti secara seketika, semakin banyak DNA yang terbentuk semakin tinggi pula intensitas fluorescent yang dihasilkan.

Quantitative PCR dimunginkan dapat mendeteksi secara akurat konsentrasi DNA

hingga hitungan pikogram atau setara dengan sel tunggal karena sensitifitas dye yang sangat tinggi. Hasil peningkatan fluorescent digambarkan melalui kurva amplifikasi yang menunjukkan tiga fasa yaitu fasa awal, fasa eksponensial atau puncak dan fasa plateau atau stabil (Pratami, 2011)

Gambar 2.10. Bentuk Kurva pada Real Time PCR (Pratami, 2011) Gambar 2.10. Bentuk Kurva pada Real Time PCR (Pratami, 2010).

Instrument real time PCR memiliki tiga komponen utama yaitu thermal

block cycler sebagai akurasi data, optical system sebagai deteksi data, dan sofware

sebagai analisa data. Real time PCR juga dapat menganalisa banyak sampel dalam waktu bersama menggunakan multiwell plates (Pratami, 2011).

(38)

20

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tabel 3. Kelebihan dan kelemahan Real Time PCR

Kelebihan Kelemahan

pada real time PCR jumlah DNA yang diamplifikasi bisa langsung diamati secara real time sehingga tidak memerlukan analisis dengan elektroforesis gel untuk mengetahui produk PCR. Real time PCR lebih dikenal sebagai quantitative PCR karena kemampuan analisanya yang akurat, sensitif dan spesifik sehingga mengurangi kesalahan pada hasil (Pratami, 2012).

Real time PCR juga mempunyai kelemahan yaitu memerlukan peralatan dan reagen yang mahal serta pemahaman teknik yang benar untuk hasil yang akurat (Ayu, et al. 2014).

2.7.1 Analisis Menggunakan Metode Hydrolysis Probe

Instrumen real time PCR menggunakan pewarna fluoresensi secara langsung dan real time, baik untuk memonitor hasil dari produk PCR selama siklus berlangsung maupun setelah siklus pada proses melting hasil produk PCR untuk menganalisis melting curve.

Ada beberapa analisis pewarnaan yang dapat dilakukan antara lain : 1. Uji Deteksi Sequence Independent

Mengandalkan fluorophores yang mengikat semua DNA molekul untai ganda (dsDNA) terlepas dari urutan basanya : misalnya SYBR Green I.

2. Uji Sequence-Specific Probe Binding

Mengandalkan fluorophores yang berpasangan ke probe oligo nukleotida dengan Sequence-Specific yang berhibridisasi dengan urutan komplementernya dalam target produk PCR yaitu Metode

(39)

21

Simpel Probe, Hybridization Probe (Hyb Probe) dan Hydrolysis Probe.

Probe dilabelin oleh dua molekul, yaitu reporter pada ujung 5‟ probe yang merupakan pewarna fluoresensi dan quencher pada ujung 3‟ probe yang merupakan molekul penerima sinyal fluoresensi. Hydrolysis probe memiliki prinsip kerja, yaitu saat probe belum berkomplemen dengan target, molekul reporter akan mengeksitasikan sinyal fluoresensi ke molekul quencher. Karena jarak antara kedua molekul berdekatan. Probe akan berkomplemen dengan DNA target saat mencapai suhu annealing lalu mekanisme eksitasi sinyal fluoresensi dari reporter ke quencher terhenti karena jarak kedua molekul berjauhan. DNA polimerase akan mengelongasi DNA target sampai DNA polimerase dan probe berdekatan maka 5‟ nuklease yang terdapat pada DNA polimerase akan menghidrolisis molekul reporter sehingga emisi sinyal fluoresensi dapat tertangkap oleh detektor pada real time PCR (Rasyid, 2015).

(40)

22

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tabel 3. Tahapan Proses Fluoresensi Hydrolysis Probe

No Gambar Keterangan

1 Hydrolysis probe membawa dua

fluorescent dye berdekatan dengan quencher dye menekan sinyal

fluorescent reporter. Ujung 3‟ dari

probe terfosforilasi sehingga tidak dapat memanjang selama PCR.

2 Di tahap annealing, primer dan probe sama-sama menempel ke urutan basa pada target spesifik

3 Ketika DNA polimerase memanjangkan primer dan bertemu dengan probe. Kemudian memecah probe pada ujung 5‟ sehingga menggantikan posisinya dan terus memanjang sampai membentuk amplikon baru.

4 Saat probe terpecah, reporter tidak lagi berdekatan dengan quencher sehingga dapat mengemisikan cahaya

fluorescent yang dibaca oleh detektor.

Semakin tinggi fluoresensi yang dipancarkan dari reporter secara langsung berkolerasi dengan akumulasi pelepasan molekul reporter

dye (sekaligus menandakan jumlah

(41)

23

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Hydrolysis probe biasa digunakan dalam multipleks quantitative real time

PCR yang menggunakan DNA target dan pasangan lebih dari satu dalam satu reaksi karena probe akan berikatan secara spesifik dengan beberapa DNA target yang berbeda. Metode hydrolysis probe memiliki keunggulan dibandingkan dengan SYBR Green karena dapat mengamplifikasi DNA lebih spesifik (Izzah, 2014).

Pewarna fluorescent yang digunakan dalam hydrolysis probe bermacam ragamnya yang disesuaikan dengan penggunaannya. Metode hydrolysis probe dapat digunakan secara terpisah atau dengan kombinasi pewarna. Dalam penggunaannya dengan format deteksi monocolor biasa digunakan reporter FAM dengan nilai eksitasi dan emisis berturut-turut 483 dan 533, pewarna lainnya yang tersedia untuk deteksi multicolor antara lain Cyan 500, Hex, Red 610 dan Cy 5 dengan nilai eksitasi dan emisi dalam keadaan normal berturut turut 450 dan 500, 523 dan 568, dan 558 dan 610 serta 615 dan 670. Sebagai quencher terutama untuk deteksi multicolor digunakan quencher dye gelap, direkomendasikan menggunakan BHQ1 atau DABCYL (Rasyid, 2015).

2.8 Daging Sosis

Kata sosis berasal dari bahasa latin “salsus” yang berarti garam. Sosis merupakan salah satu produk daging olahan atau giling yang diberi bumbu dan dimasukkan ke dalam selongsongan atau casing menjadi bentuk silindris. Casing yang digunakan dapat berupa usus hewan atau bahan sintesis. Dalam adonan sosis biasanya ada tambahan tepung, susu skim, lemak, es atau air dan protein nabati (Irawati, 2001).

Sosis adalah daging giling yang diberi bumbu dan juga mengalami proses

curing, pemanasan dan pengasapan. Curing adalah proses pengolahan daging

dengan menambahkan garam NaCl, natrium nitrit atau natrium nitrat dan bumbu-bumbu. Bumbu-bumbu yang biasa digunakana seperti pala, bunga pala, lada, kapulaga, cengkeh, ketumbar, paprika, jahe dan bawang putih. Penambahan nitrit pada proses curing berguna sebagai bahan pembangkit warna khas curing (merah

(42)

24

cerah dan stabil) dan memberi cita rasa yang khas. Fosfat juga sering ditambahkan untuk menurunkan pH dan memperbaiki warna (Irawati, 2001).

Klasifikasi sosis ada empat jenis yaitu sosis segar, sosis kering, sosis setengsh kering dan sosis fermentasi kering dan setengah kering, sosis rebus asap dan tanpa asap. Kategori sosis menurut USDA (United State Department of

Agriculture) dibagi menjadi lima yaitu sosis segar, sosis mentah diasap, sosis

matang, sosis kering dan semi kering serta sosis spesialitas daging masak. Sosis segar terbuat dari 50% atau lebih daging segar. Daging yang dipakai biasanya berasal dari daging sapi, unggas dan babi. Pembuatan sosis segar ini tidak melalui proses curing, pengasapan atau pemanasan, sehingga sosis yang dihasilkan harus dimasak sebelum dikonsumsi. Sosis kering dan semi kering berbeda pada kadar air yang terkandung dalam produk akhir. Biasanya kadar air sosis semi kering sekitar 70-80% dari berat awal, sedangkan kadar air sosis kering antara 60-70% dari berat awal (Irawati, 2001).

Sosis asap adalah sosis yang mengalami pengasapan dalam rumah asap (smooked house) untuk menghasilkan citarasa yang khas (Pearson dan Tauber, 1984). Tahap-tahap pembuatan sosis meliputi grinding (penggilingan), mixing (pencampuran), chopping (penghalusan dan pencampuran semua bahan-bahan),

emulsifying (pengemulsian), stuffing (pengisian), linking dan tying (pengikatan), smooking dan cooking (pengasapan dan pemasakan) kecuali untuk sosis segar, chilling (pendinginan) dan pengepakan (Irawati, 2001).

Sosis adalah makanan yang dibuat dari daging yang telah di cincang kemudian dihaluskan dan diberi bumbu-bumbu, dimasukkan ke dalam pembungkus yang berupa usus hewan atau pembungkus buatan, dengan atau tidak dimasak. Menurut SNI 01-3020-1995 sosis adalah produk makanan yang diperoleh dari campuran daging halus (mengandung daging tidak kurang dari 75%) dengan tepung atau pati dengan atau tanpa penambahan bumbu-bumbu dan bahan tambahan makanan lain yang diizinkan dan dimasukkan ke dalam selongsong sosis (Sriati, 2011).

(43)

25

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB III

METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

3.1.1 Tempat

Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Analisa Obat dan Pangan Halal dan Laboratorium Penelitian II Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.1.2 Waktu

Waktu pelaksanaan penelitian dilakukan dari bulan Agustus 2016 hingga September 2016.

3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat

Real Time PCR (LightCycler® 480-Roche), Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega), Multiwell Plate 96 (Roche®), tabung mikrosentrifuge volume 1,5 (Biogenix), Mikropipet 0,5-10 µl (Biorad), Mikropipet 20-200 µl (Biorad), Mikropipet 100-1000 µl (Biorad), Mikrotip volume 10 µl, 200 µl, dan 1000 µl (Genfollower), Sentrifugator (5417R-Eppendrof), Vortex, Digital Waterbath (SB-100 Eyela), Freezer, Autoklaf, Spektrofotometer UV DNA (DeNovix®), Timbangan Analitik, Spatula, Batang pengaduk, Gelas beaker, Kertas perkamen, Kaca arloji, Pipet tetes, Lumpang dan Alu.

3.2.2 Bahan

Daging sapi segar, daging babi segar, 6 produk sosis sapi yang beredar di Pasar Parung, satu set kit komersial Wizard® Genomic DNA Purification Kit, (meliputi: Nuclei Lysis Solution, Protein Precipitation Solution, DNA

Rehydration Solution, RNase Solution), LC TaqMan Probe Master (terdiri dari: Fast Start Taq DNA Polymerase, dNTP mix, MgCl2 6,4 mM), Isopropanolol

(44)

26

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tabel 3.1. Susunan Basa Primer dan Universal Probe Library untuk DNA

Sapi dan Babi (Roche®) dengan Modifikasi

Spesies Primer Sequencing

Babi (Sus scrofa) Forward 5'- TGGGGTGTTTAGTGGGTTTG -3‟

Reverse 5'- TCCTTGTACTATTCTCACCAGACCT -3„

UPL 5'- (FAM)GACCCAGA -3'

Sapi (Bos taurus) Forward 5'- TGAGGGGGTGTGTTGAGTG -3„

Reverse 5'- TACTATTCGCACCCGACCTC -3„

UPL 5'- (FAM)GACCCAGA -3'

2.7 Tahapan Penelitian

1. Pengumpulan sampel 2. Isolasi DNA

3. Analisis DNA Hasil Isolasi dengan Spektrofotometri UV 4. Amplifikasi DNA Menggunakan Metode Real Time PCR

2.8 Prosedur Kerja 2.8.3 Pengumpulan sampel

Sampel sosis sapi dikumpulkan dari semua merek yang beredar di Pasar Parung dengan jumlah sampel sebanyak 6 merek sosis sapi dari produsen yang berbeda.

3.4.2 Isolasi DNA

Proses isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega).

1. Preparasi Jaringan Hewan

Sebanyak 20 mg dari masing-masing daging sapi segar, daging babi segar, dan sampel sosis sapi dihancurkan sampai halus menggunakan pisau steril, lumpang alu dan blender. Masing-masing daging dan sampel dimasukkan ke dalam mikrosentrifuge tube 1,5 ml lalu ditambahkan 600 μl nuclei lysis solution. Masing-masing campuran tersebut

(45)

27

dihomogenkan selama 10 detik kemudian diinkubasi pada suhu 650C selama 30 menit.

2. Pelisisaan Sel dan Presipitasi Protein

Masing-masing campuran yang sudah diinkubasi ditambahkan 3 μl larutan RNAse lalu diinkubasi kembali pada suhu 370C selama 30 menit. Selanjutnya ditambahkan 200 μl protein precipitation solution dan divortex, kemudian didiamkan dalam ice selam 5 menit lalu disentrifus dengan kecepatan 16.000 rpm selama 4 menit.

3. Presipitasi dan Rehidrasi DNA

Endapan dan supernatan yang terbentuk dipisahkan lalu ditambahkan 600 μl isopropanol kedalam supernatan tersebut. Campuran dikocok dan disentrifus dengan kecepatan 16.000 rpm selama 1 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang lalu ditambahkan 600 μl etanol 70%. Campuran dikocok dan disentrifus kembali dengan kecepatan 16.000 rpm selama 1 menit. Endapan yang terbentuk dipisahkan dengan etanol lalu endapan di

hairdry selama 15 menit. Kemudian ditambahkan 100 μl rehidration DNA solution dan didiamkan selama 1 jam pada suhu 650C atau selama semalam pada suhu 40C.

3.4.3 Analisis DNA Hasil Isolasi dengan Spektrofotometri UV

DNA yang sudah diisolasi dianalisis menggunakan Spektrofotometri UV DNA (DeNovix®). Proses analisis dilakukan dengan cara pada layar Spektrofotometri UV DNA (DeNovix®) dipilih Nucleic Acid. Kemudian Sample

port dibersikan menggunkan tisu steril. Siapkan DNA Rehidration Solution yang

digunakan sebagai blanko sebanyak 1 μl lalu ditaruh di atas Sample port dan dianalisis. Sample port dibersihkan kembali menggunakan tisu steril. Identitas sampel dimasukkan pada kolom Sampel ID dan sebanyak 1 μl DNA sampel tersebut ditaruh di atas Sample port. Analisis dilakukan untuk mengukur kemurnian dan kuantitas DNA dengan menekan tombol “Measure”. DNA dianalisis pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Tunggu beberapa detik akan muncul data kemurnian dan kuantitas DNA.

(46)

28

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3.4.4 Amplifikasi DNA dengan metode Real Time PCR

a. Pembuatan Primer 50 μM Dari Larutan Induk 100 μM

Sebanyak 50 μl larutan induk primer 100 μM dimasukkan kedalam

mikrosentrifuge tube volume 1,5 ml. Kemudian ditambahkan 50 μl

aquadest kedalam masing-masing tube tersebut. Larutan tersebut dihomogenkan dengan menaik turunkan pegas pada mikroppipet.

b. Pembuatan Primer 5 μM Dari Seri Larutan Induk 50 μM

Sebanyak 3 μl larutan induk primer 50 μM dimasukkan kedalam

mikrosentrifuge tube volume 1,5 ml. Kemudian ditambahkan 27 μl

aquadest kedalam masing-masing tube tersebut. Larutan tersebut dihomogenkan dengan menaik turunkan pegas pada mikroppipet.

c. Pembuatan Mastermix Real Time PCR

Master mix dibuat dengan volume total 20 μl yang terdiri dari 5 μl DNA template; 3,8 μl Aquabidest; 0,4 μl primer forward 5 μM; 0,4 μl primer

reverse 5 μM; 0,4 μl UPL 10 μM; dan 10 μl LightCycler® 480 probe

master (enzim Taq DNA Polymerase, dNTP mix, dan 6,4 mM MgCl2).

d. Loading Sampel dan Taqman Probe Mastermix kedalam Multiwell Plate (Roched, 2008)

Campuran reaksi dimasukkan ke dalam multiwell plate pada well yang diinginkan. Kemudian dihomogenkan dengan menaik turunkan pegas secara perlahan dan ditutup dengan sealing foil. Dilakukan proses pengaturan program LightCycler® 480 real time PCR yang akan digunakan untuk proses amplifikasi. Setelah campuran reaksi total PCR dan program amplifikasi telah siap, campuran reaksi total PCR diletakkan pada multiwell plate yang ditutup menggunakan sealing foil, kemudian diletakkan pada mesin real time PCR. Instrumen real time PCR akan mengamplifikasi DNA secara otomatis dan langsung memberikan hasil amplifikasi melalui monitor dalam bentuk kurva.

(47)

29

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada penelitian ini dilakukan analisis cemaran daging babi pada produk sosis sapi yang beredar di Pasar Parung menggunakan metode Real Time

Polymerase Chain Reaction. Pemilihan alat real time dikarenakan pada real time

PCR jumlah DNA yang diamplifikasi bisa langsung diamati secara real time sehingga tidak memerlukan analisis dengan elektroforesis gel untuk mengetahui produk PCR. Real time PCR lebih dikenal sebagai quantitative PCR karena kemampuan analisanya yang akurat, sensitif dan spesifik sehingga mengurangi kesalahan pada hasil. Selain amplifikasi atau perbanyakan DNA fragmen dapat diamati secara cepat, teknik ini juga dapat menentukan konsentrasi DNA yang terdapat pada sampel. Cytochrome b adalah salah satu bagian dari sitokrom yang terlibat dalam transportasi elektron dalam mitokondria. Cyt b berisi delapan transmembran heliks yang dihubungkan oleh intramembran atau domain ekstramembran. Gen cyt b dikodekan oleh DNA mitokondria. Adanya variasi urutan pada cyt b menyebabkan gen ini banyak digunakan untuk membandingkan spesies dalam genus atau famili yang sama. Keunikan sekuen cyt b yaitu terdapat bagian yang bersifat kekal (conserve sequence) di dalam tingkat spesies, sehingga dapat digunakan untuk pengelompokan berdasarkan jenis hewan atau untuk penentuan hubungan kekerabatan antar jenis hewan. Sekuen gen cyt b yang berasal dari sapi (Bos taurus) dan babi (Sus scrofa) mempunyai panjang sekuen 1140 pb (Primasari, 2011). Analisis dilakukan melalui beberapa tahap yaitu isolasi DNA, pengukuran kemurnian dan kuantifikasi DNA hasil isolasi, amplifikasi DNA dan analisis DNA hasil amplifikasi.

(48)

30

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 4.1. Hasil Analisis DNA dengan Spektrofotometri UV

Tabel 4.1 Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA

No Sampel Konsentrasi (ng/µl) Kemurnian (A260/A280) 1. Daging Babi 127.419 1.84 2. Daging Sapi 84.086 1.89 3. Sampel 1 146.477 1.87 4. Sampel 2 164.050 1.69 5. Sampel 3 145.785 1.90 6. Sampel 4 48.115 1.87 7. Sampel 5 73.760 1.82 8. Sampel 6 90.532 1.90

Isolasi DNA dilakukan terhadap daging sapi, daging babi, dan 6 sampel sosis sapi yang beredar di Pasar Parung. Metode isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega. Prinsip kerja isolasi DNA menggunakan Wizard Genomic DNA Purification Kit yaitu lisis, ekstraksi, homogenisasi, presipitasi protein, dan rehidrasi DNA. Bahan-bahan yang digunakan pada proses isolasi DNA pada daging sampel adalah nuclei lysis

solution, RNAse, protein precipitation solution, isopropanol, etanol 70%, dan

DNA rehydration solution (Promega, 2012). nuclei lysis solution untuk penghancur dinding sel maupun membran sel. Reagen yang digunakan pada proses lisis adalah NLS. Penambahan NLS merupakan cara kimia yang berfungsi untuk menghancurkan membran sel dan nukleus. NLS menghancurkan membran sel dengan cara mengganggu ikatan kimia pada membran tersebut. Ekstraksi bertujuan untuk menghancurkan sel sehingga materi yang ada didalam sel dapat keluar. Homogenisasi bertujuan untuk mencampurkan zat. Homogenisasi biasanya dilakukan pada setiap penambahan suatu zat. Presipitasi atau pengendapan bertujuan untuk memisahkan supernatan dengan endapan. Reagen yang digunakan pada proses presipitasi adalah protein precipitation solution. PPS tersusun atas garam penyangga (salt buffer) sehingga reagen ini dapat menurunkan kelarutan

(49)

31

protein sehingga protein dapat mengendap. DNA yang telah dibersihkan dari protein masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. RNAse merupakan enzim yang berfungsi untuk mendegradasi RNA. Hal tersebut dapat memudahkan proses isolasi karena RNAse akan merusak RNA sedangkan DNA tidak. Molekul DNA yang telah diisolasi kemudian dimurnikan dengan cara presipitasi etanol. Dengan adanya larutan garam (kation monovalen seperti Na+ pada suhu -200C etanol absolut dapat mengendapkan DNA dengan baik sehingga mudah dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Rehidrasi DNA merupakan tekhnik pemurnian DNA dengan cara mengeringkan atau menguapkan (Radji, 2011).

Isolat DNA yang dihasilkan dari tahapan kerja di atas, didapatkan konsentrasi dan kemurniannya dengan menggunakan spektrofotometri DNA (DeNovix). Hasil isolasi diukur konsentrasinya dengan menggunakan spektrofotometer Denovix pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Pengukuran kuantitas (konsentrasi) dan kualitas (kemurnian) didasarkan pada prinsip penyinaran sinar ultra violet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam larutan (Muladno, 2010). Konsentrasi yang dihasilkan dari masing-masing sampel bervariasi antara 48,115 ng/µl-164,050 ng/µl (Lampiran 1). Berdasarkan hasil isolasi dan konsentrasi DNA (Lampiran 1), sampel nomer 2 memiliki konsentrasi paling besar yaitu 164,050 ng/µl. Sampel nomer 4 dengan konsentrasi terendah yaitu 48.115 ng/µl. Dengan demikian, konsentrasi DNA yang didapatkan dari tiap sampel masih dapat dilanjutkan ke tahap amplifikasi DNA menggunakan

real time PCR karena batas konsentrasi minimal untuk melanjutkan real time PCR

adalah 0,03-0,80 pg (Andreo et al, 2005).

Perbandingan antara panjang gelombang 260 nm dan 280 nm merupakan nilai kemurnian DNA. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada panjang gelombang 260 nm, sedang protein akan menyerap cahaya UV pada panjang gelombang 280 nm. Sehingga kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 nm (A260/A280), dan

nilai kemurnian DNA berkisar antara 1,8-2,0 (Stephenso, 2003; Muladno, 2010; Sambrook, et al, 1989; Fatchiyah, 2010). Nilai kemurnian yang dihasilkan dari genom yang diperoleh memiliki nilai antara 1,69-1,90 (Lampiran 1). Sampel yang