3. METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di beberapa laboratorium, yaitu Laboratorium Fisiologi Tumbuhan Universitas Sumatera Utara, Laboratorium Kimia Dasar LIDA Universitas Sumatera Utara, Laboratorium Kesehatan Ikan dan Lingkungan DKP Propinsi Sumatera Utara dan berlangsung dari bulan Maret hingga Mei tahun 2011.
3.2 Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini dibagi menjadi dua kategori. Alat dan bahan yang digunakan untuk pemeliharaan makroalga Gracilaria edulis. disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1 Alat dan bahan untuk pemeliharaan Gracilaria edulis.
Alat
Bahan
Jenis Spesifikasi
Akuarium Bahan kaca uk. 40x20x20 cm3 Air laut alami filterisasi
Air Pump Merk BS-410 Gracilaria edulis
Thermometer DO meter pH meter Refraktometer Colorimeter Model gelas RST-03 (0-400 C)
Merk Lutron DO-5509 Merk Hanna
Merk S-Mill-E
Merk Hach model DR/890
Pecahan karang Aquades
Reagent 8039 Cadmium Reduction Reagent 8048 PhosVer 3 (Ascorbic Acid) Method
Alat dan bahan yang digunakan untuk pengukuran laju pertumbuhan, konsentrasi klorofil-a, kualitas air, dan pengamatan histologi struktur talus disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2. Alat dan bahan untuk pengukuran laju pertumbuhan, konsentrasi klorofil-a, dan pengamatan struktur talus.
Alat Bahan Jenis Spesifikasi Spektrofotometer Timbangan digital Labu ukur 100 ml Gelas beker Pipet ukur Atomic Absorption Spectrometer Mortar Hot plate
Model Milton Roy Spectronic 20D Model WkrCB 3K0,5N
Brand 100 ml Pyrex 50 ml Pyrex 25 ml
Merk Shimadzu model AA-6300
Larutan HNO3 Aseton 80% Alkohol 70%
Tembaga bubuk (CuSO4.5H2O)
3.3 Persiapan Penelitian
3.3.1 Penentuan Konsentrasi Toksikan Cu
Studi literatur dan lapangan dilaksanakan untuk menentukan konsentrasi Cu terlarut dalam perairan laut alami. Berdasarkan studi literatur dan latar belakang di atas ditetapkan konsentrasi Cu yang akan diuji toksisitasnya pada makroalga adalah Cu yang terlarut di Perairan Kepulauan Seribu (Perairan Pulau Lancang dan Perairan Pulau Pari) dan hasil pengamatan lapangan, konsentrasi Cu terlarut di perairan tersebut berkisar antara 0.01-0,4 ppm Cu sehingga dipilih 4 konsentrasi Cu sebagai perlakuan toksisitas logam berat terhadap Gracilaria edulis (Tabel 3).
Tabel 3 Konsentrasi Cu sebagai konsentrasi toksikan terhadap makroalga
Toksikan Konsentrasi Cu (ppm) Keterangan
Tembaga (Cu)
0+0,01 Kontrol (air laut alami tanpa penambahan Cu)
0,01+0,03 Perlakuan 1 (air laut alami + Cu)
0,01+0,05 Perlakuan 2 (air laut alami + Cu)
0,01+0,49 Perlakuan 3 (air laut alami + Cu)
3.3.2 Penyediaan Makroalga
Bibit Gracilaria edulis diperoleh dari tambak budidaya rumput laut Dusun 4 Desa Selotong Kecamatan Secanggang Kabupaten Langkat Sumatera Utara. Pemilihan lokasi relatif bebas dari kawasan industri sehingga diharapkan bibit Gracilaria edulis diambil dari tanaman induk budidaya yang sehat dan segar dengan ciri morfologi berupa talus berwarna coklat kehijauan. Bibit diambil
dengan cara memotong bagian ujung vegetatif kira kira 10-20 cm. Bagian ujung tanaman dipilih karena bagian ini terdiri dari sel dan jaringan muda yang akan memberikan pertumbuhan yang optimal (Indriyani dan Suminarsih, 2004).
3.3.3 Aklimatisasi Makroalga
Makroalga dicuci dibawah air mengalir untuk menghilangkan epifit yang menempel pada talus setelah tiba di laboratorium. Setelah bersih, makroalga segera dimasukkan ke dalam akuarium untuk proses aklimatisasi dengan tujuan dapat beradaptasi dan hidup pada lingkungan media uji. Tiap hari dilakukan penimbangan bobot basah makroalga, sampai hari ke-14 bobot makroalga stabil atau tidak mengalami penurunan, kemudian dilakukan penimbangan bibit untuk sampel uji toksisitas.
Bibit terendam seluruhnya dalam media, dengan menggunakan metode dasar (bottom method) yang telah dimodifikasi sesuai keadaaan akuarium (Alamsjah et al., 2009). Tiap akuarium dipelihara sebanyak 3 rumpun makroalga, dan setiap rumpun beratnya 10 gram.
3.3.4 Pembuatan Larutan Stok
Larutan induk (stock solution) Cu dibuat dari Tembaga (II) sulfat pentahidrat (CuSO4.5H2O) (Merck), formula pembuatan larutan induk adalah sebagai berikut:
BM A
BM B x C………(1)
Keterangan :
Bm A = berat molekul senyawa CuSO4.5H2O Bm B = berat molekul Cu
C = konsentrasi larutan induk yang diinginkan
3.3.5 Penyediaan Media Uji
Media uji menggunakan air laut murni sebanyak 10 liter dalam akuarium kaca berukuran 40x20x20 cm3 dengan kandungan nitrat 0,55 ppm dan fosfat 0,07 ppm serta 0,01 ppm Cu. Nutrien dan konsentrasi Cu dalam media sudah memenuhi dan tidak bersifat toksik pada kehidupan makroalga (Huang et al., 2010; Lobban dan Harrison, 1997) (Gambar 7). Akuarium dialiri oksigen dengan
sistem aerasi. Oksigen disalurkan dari aerator, lalu dimasukkan ke dalam akuarium dengan menggunakan selang air yang diberi batu pemberat. Pengaerasian dilakukan untuk membuat pergerakan air dalam akuarium (Mamboya et al., 2007). Pergantian air media uji dilakukan 2 kali seminggu (semistatik) untuk mempertahankan nutrien bagi makroalga dan konsentrasi Cu (sebagai perlakuan toksisitas) tetap stabil hingga akhir penelitian.
Gambar 7 Skema akuarium terkontrol pada pemeliharaan Gracilaria edulis.
3.4 Perlakuan Penelitian 3.4.1 Rancangan Percobaan
Percobaan penelitian ini menggunakan rancangan acak kelompok (RAK) terdiri atas satu faktor perlakuan kuantitatif tetap yaitu konsentrasi Cu yang dibedakan menjadi 4 taraf yaitu 0,01 ppm sebagai kontrol, 0,04 ppm sebagai perlakuan pertama, 0,06 sebagai perlakuan kedua, dan 0,5 sebagai perlakuan ketiga sedangkan waktu pengamatan termasuk dalam kelompok atau blok (Mattjik dan Sumertajaya, 2006). Bagan percobaan dapat digambarkan sebagai berikut (Gambar 8).
P3 P1 P4 P2
P1 P4 P2 P3
P3 P1 P4 P2
Gambar 8 Pengacakan dan bagan percobaan RAK
P1 P3 P4 P2
P2 P3 P4 P1
Blok 2 (Hari ke-7)
Blok 3 (Hari ke-14) Blok 4 (Hari ke-21)
Blok 5 (Hari ke-28) Blok 1 (Hari ke-0)
3.4.2 Pengamatan Percobaan 3.4.2.1 Parameter Kualitas Media
Kualitas air media disesuaikan dengan keadaan lingkungan tropis tempat G. edulis hidup. Parameter kualitas air diusahakan tetap dan konstan antara kontrol dan akuarium dengan logam berat Cu di dalamnya selama masa kultivasi dengan salinitas berada dalam kisaran 30–31, suhu dengan kisaran 27–28 oC, pH dengan kisaran 7–8, dan DO berada dalam kisaran 5–6 mg/l. Oleh karena itu, parameter kualitas air pada seluruh akuarium termasuk kontrol tidak memiliki respon toksik atau strees pada Gracilaria edulis. Pengamatan dilakukan 1 kali dalam seminggu.
3.4.2.2 Parameter Respon Fisiologi 3.4.2.2.1 Laju Pertumbuhan
Pengamatan pertumbuhan diukur dalam beberapa tahap yaitu, (1) menimbang bobot segar (basah) Gracilaria edulis menggunakan timbangan digital dengan kepekaan 0,5 gram. Sebelum ditimbang, Gracilaria edulis dikeringkan menggunakan kertas tisu agar tetesan air tidak mempengaruhi penimbangan; (2) menghitung laju pertumbuhan spesifik (specific growth rate) menurut Lobban dan Harrison (1997). Kedua tahapan dilakukan pada hari ke-0, ke-7, ke-14, ke-21, dan ke-28.
SGR = ………...(1)
Keterangan :
SGR = laju pertumbuhan spesifik (SGR)
Nt = berat basah/biomassa pada waktu ke-t (gram) No = berat basah/biomassa awal (gram)
t = waktu
3.4.2.2.2 Klorofil-a
Konsentrasi klorofil-a diukur menggunakan spektrofotometrik dan nilai yang terbaca dikalkulasi menurut Arnon (1949) dalam Meeks (1974). Gracilaria edulis dipotong dengan pisau dan ditimbang seberat 1 gram talus segar. Talus kemudian dilumatkan dengan mortal dan ditambahkan aseton 80%. Setelah
kurang lebih selama 5 menit dan talus Gracilaria edulis menjadi partikel yang sangat kecil, larutan tersebut disaring dengan kertas saring 0,22 μm dan ditambahkan aseton sedikit demi sedikit, hingga ampas benar-benar berwarna coklat muda. Filtrat tersebut kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 50 ml, dan ditambahkan aseton hingga volume ekstrak tepat 50 ml. Ekstrak ini siap diukur dengan bantuan spektrofotometer.
Ekstrak tersebut dibaca pada panjang gelombang 663 nm dan 645 nm. Angka digital yang ditunjukkan adalah angka skala absorban (OD/D = optical density). Pengukuran dilakukan pada hari ke-7, ke-14, ke-21, dan ke-28.
Chl-a (mg L-1) = 12,7 x D663nm – 2,69 x D645 ………...……….. (2)
Keterangan :
Chl-a = konsentrasi klorofil-a dalam ekstrak (mg L-1)
D663nm = absorbansi pada spektrofotometri yang diperiksa pada panjang gelombang 663 nm
D645nm = absorbansi pada spektrofotometri yang diperiksa pada panjang gelombang 645 nm
3.4.2.2.3 Struktur Talus
Struktur talus diamati dalam 2 cara yaitu, pengamatan struktur talus secara eksternal dan pengamatan struktur talus secara internal (dilakukan pembedahan). cara pertama dilakukan secara visual dan dicatat perubahan yang tampak pada masing-masing perlakuan dan pengambilan data dilakukan pada akhir pengamatan (hari ke-28). Cara kedua membuat preparat segar atau semipermanen dengan cara mengiris talus setipis mungkin dan diamati di bawah mikroskop pada hari ke-14 dan ke-28. Tujuan dari pembuatan preparat segar atau semipermanen adalah meminimalkan kerusakan dari struktur talus sehingga kerusakan jaringan hanya dikarenakan terpaparnya logam berat Cu.
Preparat dilakukan di bawah mikroskop cahaya merk Boeco dengan micro digital camera eyepiece (MDCE) dengan nomor produk 5A pada perbesaran100 dan 400 kali. Sel-sel talus diukur dengan mikrometer yang terpasang pada lensa okuler
3.5 Analisa Data
Analisis terhadap laju pertumbuhan dan klorofil-a makroalga dilakukan secara deskriptif dan melalui uji ragam (ANOVA). Persamaan umum model rancangan tersebut adalah sebagai berikut :
Yij = μ + τi + βj + εij ………(1)
Keterangan:
Yij = nilai pengamatan pada perlakuan ke-i kelompok ke-j μ = nilai tengah populasi
τi = pengaruh perlakuan τ taraf ke-i
βj = pengaruh kelompok β taraf ke-j
εij = galat percobaan pada perlakuan ke-i kelompok ke-j
Hipotesis yang digunakan adalah : 1. Hipotesis perlakuan
H0 : pengaruh perlakuan tidak berbeda nyata
H1 : minimal ada 1 perlakuan yang memberikan pengaruh berbeda nyata 2. Hipotesis kelompok/blok
H0 : pengaruh kelompok tidak berbeda nyata
H1 : minimal ada 1 kelompok/blok yang memberikan pengaruh berbeda nyata Apabila pengaruh perlakuan dan kelompok berbeda nyata dengan selang kepercayaan 95 % (P<0,05), maka dilakukan uji lanjut Duncan (Mattjik dan Sumertajaya, 2006).
