BAB III
METODE PENELITIAN
A. Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan uji klinis experimental dengan pendekatan pre test dan post test pada kelompok perlakuan dan kontrol.
B. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di RSUD Dr. Moewardi Surakarta dan RSUD Ario Wirawan Salatiga dimulai pada tanggal 18 Maret sampai 7 April 2016.
C. Populasi Penelitian
Populasi target penelitian ini adalah penderita PPOK eksaserbasi akut yang di rawat di RSUD Dr. Moewardi Surakarta dan RSUD Ario Wirawan Salatiga pada tanggal 18 Maret sampai memenuhi besar sampel tanggal 7 April 2016.
D. Pemilihan Sampel
Sampel penelitian ini adalah penderita PPOK eksaserbasi akut yang menjalani perawatan inap di RSUD Dr. Moewardi Surakarta dan RSUD Ario Wirawan Salatiga pada tanggal 18 Maret sampai 7 April 2016. Pengambilan sampel dilakukan dengan cara consecutive sampling yaitu memilih subjek penelitian yang datang dan memenuhi kriteria pemilihan dimasukkan dalam penelitian sampai jumlah subjek yang diperlukan terpenuhi. Selanjutnya subjek penelitian dibagi menjadi dua kelompok yaitu kelompok perlakuan (mendapat terapi standar PPOK eksaserbasi akut dan resveratrol) dan kelompok kontrol (terapi standar PPOK eksaserbasi akut).
E. Besar Sampel
Penentuan besar sampel tergantung jenis penelitiannya. Gay dan Diehl (1992) dalam Soehardi Sigit (1992) dan dalam Kasjono dan Yasril (2013) menyatakan bahwa besar sampel harus diambil sebanyak-banyaknya sesuai kemampuan penelitian dengan mempertimbangkan waktu dan energi yang wajar. Besar sampel juga disesuaikan dengan jenis penelitiannya. Besar sampel minimal yang disarankan untuk penelitian eksperimental atau uji klinis adalah 15 orang untuk masing-masing kelompok (Kasjono dan Yasril, 2013). Penelitian ini dipakai
besar sampel sebanyak 30 orang terdiri dari 15 orang kelompok perlakuan (mendapat terapi standar PPOK eksaserbasi akut dan resveratrol) dan 15 orang kelompok kontrol (mendapat terapi standar PPOK eksaserbasi akut).
F. Kriteria Inklusi dan Ekslusi 1. Kriteria Inklusi
a. Penderita PPOK eksaserbasi akut yang terdiagnosis secara klinis.
Penegakan diagnosis PPOK eksaserbasi akut pada penelitian ini berdasarkan klinis dan radiologis. Gejala klinis PPOK eksaserbasi didapat perburukan gejala kondisi sehari-hari berupa sesak napas, batuk, dan perubahan purulensi dahak diluar variasi normal. Foto toraks didapatkan gambaran bronkitis kronis dan paru emfisematous.
b. Semua derajat eksaserbasi yang di rawat inap di RSUD dr. Moewardi Surakarta dan RSUD Ario Wirawan Salatiga.
Tipe 1 jika terdapat tiga gejala (peningkatan jumlah sputum, purulensi sputum dan sesak bertambah), tipe 2 jika terdapat dua dari tiga gejala, dan tipe 3 jika terdapat satu gejala ditambah salah satu dari kriteria yaitu infeksi saluran napas, demam, mengi, batuk bertambah, atau peningkatan denyut jantung lebih dari 20% nilai dasarnya.
c. Penderita PPOK eksaserbasi akut berumur 40-65 tahun
d. Penderita PPOK eksaserbasi akut dengan indeks massa tubuh (IMT) 18-22,9 kg/m2 2. Kriteria Eksklusi
Penderita PPOK eksaserbasi akut yang memerlukan perawatan ICU dan ventilator, penderita PPOK eksaserbasi akut dengan gagal ginjal, kanker paru, sepsis, HIV/AIDS, dan mendapat tambahan antioksidan dan antiinflamasi nonsteroid alternatif lain, serta memiliki riwayat alergi terhadap resveratrol.
3. Kriteria diskontinyu
a. Penderita PPOK eksaserbasi akut yang mengundurkan diri atau meninggal dunia.
b. Penderita PPOK eksaserbasi akut mengalami efek samping pemberian resveratrol antara lain gejala mual, muntah, peningkatan enzim transaminase (SGPT/SGOT) tiga kali diatas nilai normal, peningkatan ureum/kreatinin tiga kali diatas nilai normal.
G. Variabel Penelitian
1. Variabel bebas:
a. Pemberian resveratrol 2.Variabel terikat:
b. Kadar matriks metalloproteinase (MMP)-9 plasma penderita PPOK eksaserbasi akut.
H. Definisi Operasional 1. Resveratrol
Definisi : Resveratrol merupakan obat antioksidan golongan senyawa fitoaleksin polifenol yang dihasilkan dari kulit anggur, polygonum cuspidatum atau knotweed jepang, dan terdapat di red wine. Metabolit aktif resveratrol adalah trans-resveratrol. Resveratrol memiliki sifat antiinflamasi. Kapsul resveratrol dengan nama dagang polygonum extract berwarna bening dan berisi 500 mg atau setara 98% polygonum cuspidatum dengan bahan aktif 500 mg trans-resveratrol.
Alat ukur : kapsul resveratrol diberikan dengan dosis 1x500 mg peroral sesudah atau bersamaan dengan makan selama perawatan.
Skala ukur : miligram (mg),
Skala data : menggunakan skala nominal. 2. Interleukin (IL)-8
Definisi : Interleukin (IL)-8 merupakan salah satu sitokin proinflamasi yang berperan dalam amplifikasi inflamasi pada PPOK eksaserbasi.
Alat ukur : quantikine human IL-8 immunoassay dengan metode ELISA Skala ukur : picogram per milliliter (pq/mL).
Skala data : menggunakan skala rasio. 3. Matrik metalloproteinase (MMP)-9
Definisi : Matrik metalloproteinase (MMP) merupakan grup penting enzim zink dalam mendegradasi matriks ekstraselular yaitu gelatin, kolagen tipe IV, elastin, dan matriks protein lainnya.
Alat ukur : quantikine human MMP-9 immunoassay. Skala ukur : nanogram per milliliter (nq/mL).
Skala data : menggunakan skala rasio.
I. Instrumen Penelitian
1. Pengukuran kadar IL-8 menggunakan metode ELISA di laboratorium Klinik Prodia. Alat pemeriksaan menggunakan quantikine human IL-8 immunoassay.
2. Pengukuran kadar MMP-9 plasma menggunakan metode ELISA di laboratorium Klinik Prodia. Alat pemeriksaan menggunakan quantikine human MMP-9 immunoassay (ELISA; R&D system Inc., MN).
J. Prosedur Pengumpulan Data
Subjek penelitian terdiri dari penderita PPOK eksasrebasi akut yang telah terdiagnosis dan datang ke RSUD dr. Moewardi Surakarta dan RSUD Ario Wirawan Salatiga. Subjek penelitian diberi penjelasan mengenai tujuan dan manfaat penelitian.
1. Subjek yang bersedia ikut penelitian diminta menandatangani lembar persetujuan (informed concern).
2. Subjek yang memenuhi kriteria inklusi diberi penjelasan, dicatat identitas, riwayat merokok, penyakit lain yang diderita, dan lain-lain pada formulir yang disediakan. Data awal subjek diperoleh dari anamnesis, pemeriksaan fisik, laboratorium darah, dan rontgen toraks. Sampel subjek pada masing-masing kelompok diambil darah vena untuk diperiksa kadar IL-8 dan kadar MMP-9 plasma saat eksaserbasi dan setelah tercapai kondisi stabil. 3. Sampel subjek yang diambil secara consecutive sampling, kemudian dibagi menjadi dua
kelompok yaitu kelompok perlakuan Kelompok perlakuan mendapat terapi standar PPOK eksaserbasi akut dan resveratrol selama 7 hari. Kelompok kontrol mendapat terapi standar PPOK eksaserbasi akut.
4. Terapi standar PPOK eksarsebasi akut meliputi bronkodilator, kortikosteroid sistemik, dan antibiotik.
5. Penderita di follow-up (gejala klinis dan efek samping resveratrol) dilakukan setiap hari sampai kriteria pemulangan penderita terpenuhi. Kriteria pemulangan pasien PPOK eksaserbasi akut menurut Global initiative for chronic obstructive lung disease tahun 2016 adalah sebagai berikut:
a. Pasien secara klinis stabil dalam waktu 12-24 jam. b. Analisis gas darah stabil dalam waktu 12-24 jam.
c. Pasien dapat makan, minum, tidur dengan nyaman, dan berjalan antar ruangan tanpa mengeluhkan sesak napas.
d. Penggunaan terapi inhalasi dengan short acting- β-2-agonist (SABA) tidak lebih dari satu kali tiap 4 jam.
e. Pasien dapat menggunakan long acting-β-2- agonist (LABA) atau long acting anti muscarinic agent (LAMA) dengan atau tanpa inhalation corticosteroid (ICS).
g. Pasien, keluarga, dan dokter percaya bahwa pasien dapat dirawat di rumah.
6. Penderita yang memenuhi kriteria pemulangan (kondisi stabil) diambil darah vena untuk pemeriksaan kadar IL-8 plasma dan kadar MMP-9 plasma.
7. Respons terapi pemberian resveratrol dinilai penurunan kadar IL-8 plasma dan kadar MMP-9 plasma.
K. Teknik Pemeriksaan 1. Pemeriksaan kadar IL-8
Kadar IL-8 yang diteliti diambil dari darah. Sebanyak 5 mL darah vena diambil 1-2 jam setelah penderita masuk IGD sebelum penderita mendapatkan tambahan terapi resveratrol. Darah dimasukan ke dalam tabung EDTA kemudian dibolak-balik secara perlahan.
Prosedur pemeriksaan kadar IL-8:
a. Siapkan semua reagen dan standar kerja
b. Hapus kelebihan strip lempeng dari frame plat, kembalikan ke kantong foil mengandung paket pengering.
c. Tambahkan 100 μL dari Assay Pengencer RD1-85 sama dengan baik.
d. Tambahkan 50 μL dari standard, kontrol, atau sampel. Tutup cekungan dengan sealer dan mebiarkan selama 2 jam pada suhu kamar. Pastikan pencampuran menyeluruh.
e. Aspirasi setiap mencuci, ulangi proses tiga kali untuk mencuci. Cuci wash buffer (400 μL) menggunakan botol semprot, multi channel pipet, dispenser manifold atau autowasher. Penghapusan cairan lengkap pada setiap tahap adalah penting untuk kinerja yang baik. Setelah cucian terakhir, menghapus sisa buffer dengan aspirasi.
f. Tambahkan 100 μL IL-8 conjugate untuk semua tabung. Tutup cekungan dengan sealer dan biarkan selama 1 jam pada suhu kamar.
g. Ulangi aspirasi / mencuci seperti pada langkah 5.
h. Tambahkan 200 μL dari substrat solusi untuk setiap sampel. Inkubasiselama 30 menit di kamar temperatur. Lindungi dari cahaya.
i. Tambahkan 50 μL stop solution untuk setiap baik. Warna dalam tabungharus berubah dari biru kuning. Jika warna dalam tabung berwarnahijau atau jika perubahan warna tidak muncul seragam, goyang lembut cekungan untuk memastikan pencampuran menyeluruh. j. Tentukan kerapatan optik masing-masing dalam 30 menit, menggunakan microplate
reader set ke 450 nm. Jika koreksi panjang gelombang tersedia, diatur ke 540 nm atau 570 nm. Jika koreksipanjang gelombang tidak tersedia, kurangi pembacaan pada 540 nm atau
570 nm dari bacaan pada 450 nm. Pengurangan ini akan mengkoreksi ketidaksempurnaan optik di cekungan. Bacaan dilakukan secara langsung di 450 nm tanpa koreksi mungkin lebih tinggi dan kurang akurat.
Pencucian :
c. Bersihkan cairan dari cekungan dengan aspirasi atau membalik lempeng dan menuang isinya.
d. Hapus kelebihan cairan dengan memegang lempeng dan mengetuk lempeng secara terbalik pada handuk kertas 5 kali.
e. Isi cekungan dengan 200 μL Wash Buffer menggunakan botol semprot, pipet multi channel, dispenser, atau autowasher.
f. Hapus cairan dari cekungan dengan aspirasi atau membalik piring dan menuang isinya. g. Tambahkan 200 μL IL-8 Conjugate pada setiap cekungan. Tutup dengan strip perekat
baru. Inkubasi selama 2 jam pada suhu kamar.
h. Tambahkan 200 μL dari Substrate Solution untuk setiap cekungan. Tutup dengan strip perekat baru. Inkubasi selama 20 menit di suhu ruang.
i. Tambahkan 50 μL Stop Solution pada tiap cekungan.
j. Tentukan kepadatan optik masing-masing cekungan dalam 30 menit, gunakan set pembaca lempeng 450 nm.
2. Pemeriksaan MMP-9
Sampel darah vena +/- 6 cc dan ditempatkan dalam tabung SST (seperator spesimen tube), sampel dibarcode, dan dikirim ke Laboratorium Klinik Prodia Surakarta. Sampel kemudian disentrifuge dengan seting 3000 rpm selama 15 menit menggunakan alat sentrifug merk Thermo. Serum kemudian dipisahkan pada tabung fisher 3 buah menggunakan transfer pipet. Dua tabung dikirim ke jakarta sebelumnya disimpan dengan suhu 20 derajat celcius, 1 tabung disimpan di Laboratorium Klinik Prodia Surakarta. Sampel yang berada di Lab. Klinik Prodia Jakarta dimasukkan dalam reagen MMPs (RRDS) dan subtrat ACL 10. Sampel kemudian dicuci lagi dengan aquades dengan pencucian 100x sampai pengenceran 1: 100 agar tidak terlalu pekat. Sampel dimasukkan dalam mikro plate leader untuk dilakukan pembacaan dengan metode elisa secara otomatis. Hasil akhir dikirim ke lab. Klinik Prodia Surakarta.
L. Etika Penelitian
Persetujuan penelitian diajukan penulis ke Panitia Kelaikan Etik RSUD.Dr. Moewardi dan Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret (FK UNS) Surakarta sebelum dilakukan
penelitian. Penjelasan mengenai tujuan, manfaat, dan prosedur penelitian dijelaskan dengna rinci kepada masing-masing subjek penelitian sebelum penelitan dimulai. Subjek yang setuju dan bersedia mengikuti penelitian diminta menandatangani lembar persetujuan (informed consent) dan isian data penderita.
M. Analisa Data
Analisis data dilakukan dengan memakai SPSS 21 for Windows. 1. Uji Beda
Uji beda adalah uji statistik yang digunakan untuk melihat perbedaan antara kelompok perlakuan (mendapat terapi standar PPOK eksaserbasi akut dan resveratrol) dan kelompok kontrol (terapi standar PPOK eksaserbasi akut).
a. Data berdistribusi normal
Analisis data dengan uji parametrik atau uji t-test berpasangan. b. Data tidak berdistribusi normal
Analisis data dengan melakukan transformasi data. Jika data hasil transformasi berdistribusi normal maka dilakukan uji parametrik dengan uji t-test tidak berpasangan. Jika data hasil transformasi berdistribusi tidak normal maka dilakukan uji nonparametrik untuk kelompok tidak berpasangan yaitu dengan uji Mann Whitney (Dahlan, 2013).
Batas kemaknaan:
Nilai p >0,05: tidak bermakna. Nilai p ≤ 0,05: bermakna.
Nilai p < 0,01: sangat bermakna.
N. Alur Penelitian
Penderita datang di
IGD Anamnesis, pemeriksaan
fisik, laboratorium darah, dan rontgen toraks
Gambar 25. Konsep alur penelitian tentang pengaruh pemberian resveratrol terhadap kadar IL-8 plasma dan MMP-9 plasma
Keterangan: : alur penelitian, ---: area analisis statistik Memenuhi kriteria inklusi
Setuju ikut penelitian Tidak setuju ikut penelitian
Pemeriksaan kadar IL-8 plasma, MMP-9 plasma, dan perbaikan klinis
Terapi standar Terapi standar +
Resveratrol 1x 500 mg Analisis
statistik
Pemeriksaan kadar IL-8 plasma, MMP-9 plasma, dan perbaikan klinis
Informed concern
Ekslude
consecutive sampling
