HASIL DAN PEMBAHASAN. Isolasi Bakteri

(1)

8

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi Bakteri

Sampel ditanam ke dalam media agar darah atau Blood agar (BA) dan MacConkeyAgar (MCA) dengan goresan T dan dimasukkan ke dalam inkubator selama 24 jam dengan suhu 37⁰C. Setelah inokulasi, dilakukan pengamatan makroskopik pada Agar darah dan MCA dari 5 sampel yang digunakan. Hasilnya terdapat beberapa koloni berbeda dari setiap sampel yang disajikan pada Tabel 2 dan Tabel 3.

Tabel 2 Hasil pengamatan morfologi koloni yang tumbuh pada media Agar darah

Parameter Agar Darah

A.1 B.1 B.2 C.1 C.2 D.1 D.2 E.1 E.2

Ukuran Sedang Sedang Sedang Sedang Sedang Sedang Sedang Sedang Sedang

Bentuk Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat

Permukaa n

Tidak halus

Tidak halus Aspek Tidak

mengkil at

Tidak mengkil at

Tidak mengkil

at

Tidak mengkil at

Tidak mengkil

at

Tidak mengkil at

Tidak mengkil

at

Tidak mengkil

at

Tidak mengkil at

Tepi Tepi

kasar

Tepi rata Tepi kasar

Tepi rata Tepi kasar Elevasi Cembun

g

Cembun g

Warna Krem Krem Krem Krem Krem Krem Krem Krem Krem

Hemolisis β - β - β - β - β

Sampel pertama hanya ditemukan 1 bentuk koloni. Pada Sampel kedua sampai kelima terdapat dua koloni berbeda. Perbedaan terdapat pada parameter hemolisis, dimana terdapat koloni yang menghasilkan hemolisis β dan koloni yang tidak menghasilkan hemolisis.β-hemolisis di media menampilkan lingkaran jernih yang jelas di sekitar koloni bakteri karena lisisnya seluruh sel darah merah (Difco Manual1984).

Gambar 4 Koloni β hemolitik pada media Agar darah

(2)

9 Tabel 3 Hasil pengamatan morfologi koloni yang tumbuh pada media Mac ConkeyAgar

(MCA)

Parameter MCA

A.1 B.1 C.1 C.2 C.3 D.1 D.2 E.1 E.2

Ukuran Sedang Sedang Sedang Sedang Sedang Sedang Sedang Sedang Sedang Bentuk Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Permukaa

n

halus halus halus halus halus halus halus halus halus

Aspek mengkil at

mengkil at

mengkil at Tepi Tepi rata Tepi rata Tepi rata Tepi rata Tepi rata Tepi rata Tepi rata Tepi rata Tepi rata Elevasi Cembun

g

Cembun g

Cembun g Warna Pink

(Tepi Putih)

Pink (Tepi Putih)

Merah Pink (Tepi Putih)

Putih Merah Pink (Tepi Putih)

Merah Pink (Tepi Putih)

Hemolisis - - - - - - - - -

Inokulasi pada media MCA terdapat beberapa koloni yang berbeda. Pada sampel 1 dan 2 hanya terdapat 1 koloni. Sampel 3 terdapat 3 koloni dengan perbedaan parameter warna koloni yaitu merah, pinkdengan tepi putih dan putih.

Sampel 4 dan 5 terdapat 2 koloni berbeda dengan perbedaan parameter warna yaitu merah dan pink dengan tepi putih.

Gambar 5 Koloni yang terbentuk pada media MCA

Setiap koloni yang tumbuh pada media agar darah maupun MCA di biakkan kembali ke agar miring TSA sebagai biakan murni isolat. Agar miring yang telah diinokulasi dimasukkan kedalam inkubator selama 24 jam pada suhu 37^°C. TSAberfungsi sebagai salah satu media yang umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni(Dwidjoseputro 1994). Lay (1994) menyatakan bahwa biakkan murni merupakan biakan yang hanya mengandung satu jenis bakteri.Hasil pengamatan makroskopis disajikan pada Tabel 4 dan Tabel 5. Untuk mengetahui kemurnian yang dari isolat yang ditanam pada TSA dilakukan pengamatan secara makroskopis pada sifat pertumbuhannya dan pengamatan secara makroskopis.

(3)

10

Tabel 4 Hasil pengamatan dari agar darah ke TSA

Parameter Agar Darah

A.1 B.1 B.2 C.1 C.2 D.1 D.2 E.1 E.2

Jumlah Pertumbuhan

Subur Subur Subur Subur Subur Subur Subur Subur Subur

Warna Krem Krem Krem Krem Krem Krem Krem Krem Krem

Sifat tembus cahaya

Opaque Opaque Opaque Opaque Opaque Opaque Opaque Opaque Opaque

Tabel 5 Hasil pengamatan dari MCA ke TSA

Morfologi Koloni

MCA

A.1 B.1 C.1 C.2 C.3 D.1 D.2 E.1 E.2

Jumlah Pertumbuhan

Subur Subur Subur Subur Subur Subur Subur Subur Subur

Warna Krem Krem Krem Krem Krem Krem Krem Krem Krem

Sifat tembus cahaya

Opaque Opaque Opaque Opaque Opaque Opaque Opaque Opaque Opaque

Penanaman koloni ke media agar miring TSA baik dari koloni agar darah maupun dari MCA menghasilkan pertumbuhan yang subur dan seragam.

Pewarnaan Gram

Koloni yang telah tumbuh pada media agar miring dilakukan pewarnaan Gram untuk melihat bentuk, susunan dan sifat Gram. Pewarnaan Gram dilakukan pada setiap koloni dan diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 100x.

Bakteri Gram positif akan terlihat berwarna ungu sedangkan bakteri Gram negatif berwarna merah (Lay 1994). Hasil pengamatan mikroskopis pada setiap koloni dengan pewarnaan Gram disajikan pada Tabel 6.

Tabel 6 Hasil pengamatan mikroskopis pada koloni yang berasal dari agar darah

BA

A.1 B.1 B.2 C.1 C.2 D.1 D.2 E.1 E.2

Bentuk Batang Halus

Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Halus

Batang Susunan Tunggal Berantai Berantai Berantai Berantai Berantai Berantai Tunggal Berantai Gram Negatif Positif Positif Positif Positif Positif Positif Negatif Positif

Spora + + + + + + +

Dari pengamatan mikroskopis terdapat dua morfologi yang berbeda yakni batang dan batang halus. Dua bakteri gram negatif yakni A.1 dan E.1 memiliki susunan tunggal, sedangkan bakteri Gram Positif yakni B.1, B.2, C.1, C.2, C.3, D.1, D.2, dan E.2 memiliki susunan berantai.

Tujuh sampel yang menghasilkan Gram positif dan memperlihatkan bentuk batang dan berspora pada pengamatan mikroskopis. Berdasarkan diagram alir identifikasi bakteri oleh Bergey dan Breed (1994); Lay (1994), dapat disimpulkan 7 sampel tersebut merupakan genus Bacillus sp.. Menurut Wongsa dan Werukhamkul (2007), Bacillus sp. merupakan bakteri berbentuk batang, bersifat Gram Positif. Bacillus sp.juga menghasilkan spora yang merupakan ciri khas bakteri ini.

Bacillus sp. yang teridenfikasi pada kloaka imago A. atlasdiduga berasal dari lingkungan yaitu tanah karena menurut Pelczar dan Chan(1986),Bacillus sp.

(4)

11 dapat dijumpai di tanah dan di air. Pada penelitian Anand et al. (2010), Bacillus sp. di temukan pada larva instar ke lima dan merupakan flora normal pada Bombyx mori. Bakteri yang terdapat pada tahap larva ini diduga bertahan dan menyebar dalam tubuh A. atlas hingga imago karena menurut Keynan dan Sandler (1983), Bacillus sp. mempunyai ketahanan yang tinggi terhadap faktor kimia dan fisika, seperti suhu ekstrim, alkohol, dan sebagainya.

Dari pengamatan mikroskopis pada koloni yang berasal dari MCA di dapatkan 2 bentuk morfologi yakni batang halus dan batang yang didominasi bentuk batang. Susunan tidak terdapat perbedaan yakni tunggal. Sifat Gram juga tidak terdapat perbedaan yakni negatif karena media MCA menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif (Lay 1994). Hasil pengamatan mikroskopis dapat dilihat pada Tabel 7.

Tabel 7 Hasil pengamatan mikroskopis pada koloni yang berasal dari MCA

MCA

A.1 B.1 C.1 C.2 C.3 D.1 D.2 E.1 E.2

Bentuk Batang Halus

Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Susunan Tunggal Tunggal Tunggal Tunggal Tunggal Tunggal Tunggal Tunggal Tunggal Gram Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif

Identifikasi Bakteri

Lima koloni yang berbeda pada pengamatan makroskopis maupun mikroskopis dipilih untuk selanjutnya dilakukan identifikasi bakteri menggunakan uji biokimia. Uji biokimia hanya dilakukan pada isolat yang bersifat Gram negatif.

Lima koloni yang dipilih yakni 2 sampel berasal dari agar darah yang menghasilkan β hemolisis (A.1) dan yang tidak mengalami hemolisis (E.1). 3 sampel lainnya berasal dari MCA yaitu koloni yang berwarna merah (C.1), pink dengan tepi putih (C.2) dan putih (C.3).

Tabel 8 Hasil uji Indol, TSIA, Oksidase, Urea, Sitrat dan VP

Koloni Indol Motilitas TSIA Oksidase Urea Sitrat VP

Slant Butt Gas H2S A.1

(BA)

- - Asam Asam + - + - + -

E.1 (BA)

- - Asam Asam + - + - + -

C.1 (MCA)

- - Basa Basa + - + - + +

C.2 (MCA)

- - Basa Basa + - + - + +

C.3 (MCA)

- - Basa Basa + - + - + +

Uji biokimia yang pertama dilakukan yakni uji Oksidase yang berfungsi untuk mengetahui ada tidaknya enzim oksidase (MacFaddin2000). Selain itu, uji oksidase berfungsi untuk membedakan bakteri Enterobactericeae jika hasilnya negatif dan non-Enterobactericeaejika hasilnya positif (Bergey dan Breed 1994).

Isolat yang telah diuji oksidase menghasilkan hasil positif pada semua sampel.

Hal ini menjelaskan bahwa bakteri yang terdapat pada sampel termasuk dalam famili Enterobactericeae. Selanjutnya, untuk membedakan famili

(5)

12

Enterobactericeaedilakukan uji lain yaitu uji TSIA, uji Indol, uji Sitrat, uji Urea dan fermentasi karbohidrat serta uji VP sebagai tambahan (Lay 1994).

Gambar 6 Uji Oksidase

Uji TSIA berperan untuk melihat kemampuan bakteri dalam memfermentasi karbohidrat serta kemampuan menghasilkan H2S dan gas (MacFaddin2000). Hasil uji TSIA dapat dilihat pada Tabel 7. Uji TSIA dari 2 isolat yakni isolat A.1 dan E.1 menghasilkan slant asam dan butt asam dengan gas positif dan tidak menghasilkan H2S. Hasil tersebut mengarah pada 8 bakteri yakni Aeromonas sp., E. Coli, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter intermedius, Proteus rettgeri, Serratia sp. dan Erwinia herbicola(Jang et al 1976). Uji TSIA pada 3 isolat (C.1, C.2, dan C.3) lainnya menghasilkan slant basa dan butt basa dengan gas positif dan tidak menghasilkan H2S. Hasil ini mengarah pada 5 genus bakteri yakni Alcaligenes sp., Bordetella sp., Pseudomonas sp., Flavobacterium sp. dan Chromobacterium sp (Jang et al. 1976).

Gambar 7 Uji TSIA

Uji biokimia selanjutnya yakni uji urea. Uji urea bertujuan untuk melihat kemampuan bakteri dalam mengurai urea menggunakan enzim urease (MacFaddin2000). Semua isolat yang diuji urea menghasilkan hasil negatif. Dari

(6)

13 hasil ini, isolat A.1 dan E.1 mengarah pada Aeromonas sp. dan E. Coli (Jang et al 1976). Isolat C.1, C.2 dan C.3 mengarah pada Alcaligenes sp., Pseudomonas sp., Flavobacterium sp. dan Chromobacterium sp. (Jang et al. 1976).

Gambar 8 Uji Urea

Setelah uji Urea, dilakukan uji indol berfungsi untuk melihat kemampuan bakteri dalam memecah asam amino tryptophan menggunakan enzim tryptophanase (Isenberg dan Sundheim 1958). Hasil uji indol dapat dilihat pada tabel 7. Hasil negatif dari uji indol pada isolat A.1 dan E.1 mengarah pada Aeromonas sp. (Jang et al 1976). Hasil negatif juga ditemukan pada isolat C.1, C.2 dan C.3 yang mengarah pada Alcaligenes sp., Pseudomonas sp. dan Chromobacterium sp. (Jang et al. 1976).

Gambar 9. Uji Indol

Uji Sitrat berfungsi untuk mendeteksi kemampuan bakteri dalam menggunakan sitrat sebagai sumber karbon tunggal dan energi (MacFaddin2000).

Uji sitrat menghasilkan hasil positif pada semua isolat. Isolat A.1 dan E.1 masih mengarah Aeromonas sp. sedangkan isolat C.1, C.2 dan C.3 mengarah ke genus Pseudomonas sp. (Jang et al. 1976).

(7)

14

Gambar 10 Uji Sitrat

Uji VP merupakan uji tambahan yang dilakukan. Uji ini dilakukan untuk mendeteksi adanya butylene glycol yang diproduksi bakteri(Madigan dan Martinko2008). Menurut Spring (2009), isolat A.1 dan E.1 menghasilkan hasil negatif mengarah ke genus Aeromonas sp.. Pada sampel C.1, C.2 dan C.3 menghasilkan hasil positif pada uji VP yang mengarah pada genus Pseudomonas sp.

Gambar 11 Uji VP

Uji gula-gula untuk mendeteksi kemampuan bakteri dalam memfermentasi karbohidrat (Volk dan Wheeler 1993). Hasil uji fermentasi karbohidrat dapat dilihat pada tabel 8. Isolat A1 dan E.1 mampu memfermentasikan semua uji dan memperlihatkan adanya gas pada tabung durham namun pada isolat C.1, C.2 dan C.3 yang diuji hanya mampu memfermentasi sukrosa, glukosa, maltosa dan manitol serta terbentuk gas pada tabung durham, sedangkan uji laktosa tidak terfermentasi tetapi terbentuk gas.

(8)

15 Tabel 9 Hasil uji kaldu gula-gula

Koloni Uji Karbohidrat

Sukrosa Laktosa Glukosa Manitol Maltosa

A.1 (BA)

Asam/Gas Asam/Gas Asam/Gas Asam/Gas Asam/Gas

E.1 (BA)

Asam/Gas Asam/Gas Asam/Gas Asam/Gas Asam/Gas

C.1 (MCA)

Asam/Gas Basa/Gas Asam/Gas Asam/Gas Asam/Gas

C.2 (MCA)

C.3 (MCA)

Gambar 12 Hasil uji kaldu gula-gula

Berdasarkan hasil semua uji biokimia dapat disimpulkan bahwa isolat A.1 dan E.1 mengarah pada genus Aeromonas sp.. Isolat C.1, C.2 dan C.3 mengarah pada genus Pseudomonas sp.. Aeromonas sp. merupakan bakteri gram negatif, berbentuk batang dan bersifat non-spora. Bakteri ini termasuk dalam famili Vibrionaceae (Popoff 1984). Bakteri Aeromonas sp. yang berhasil diisolasi dan diidentifikasi pada kloaka ulat sutera liar A. atlas berasal dari lingkungan sekitar.

Hal ini karena daerah Purwakarta merupakan salah satu daerah yang telah tercemar bakteri Aeromonas sp. (BKIPM 2011). Bakteri ini merupakan salah satu flora normal pada saluran pencernan Bombyx mori yang berfungsi sebagai pendegradasi polysakarida (Anand et al. 2010). Bakteri ini dapat menyebabkan diare dan cellulitis jika terinfeksi pada manusia (Janda dan Duffey 1988). Akan tetapi, kemampuan Aeromonas sp. menyebabkan penyakit dipengaruhi oleh jumlah paparan, usia, imunokompetensi, dosis infeksi dan faktor virulensi yang menginfeksi organisme (Nichols et al. 1996).

(9)

16

Gambar 13 Aeromonas sp., pewarnaan Gram, perbesaran objektif 100x

Genus Pseudomonas sp. merupakan bakteri Gram negatif. Bakteri ini berbentuk batang dan memiliki flagella yang berperan dalam patogenisitasnya (Arwiyanto et al. 2007). Pseudomonas sp. yang berhasil disolasi dan diidentifikasi berasal dari lingkungan sekitar karena bakteri ini banyak ditemukan di lingkungan seperti air, tanah, dan tanaman (Palleroni 1992, Schroth et al. 1992).Berdasarkan penelitian Sakthivel et al. (2012), Pseudomonas sp. juga ditemukan pada ulat sutera spesies lain yakni Bombyx mori. Selain itu, pada penelitian Anand et al.

(2010), juga menemukan bakteri Pseudomonas sp. pada saluran pencernaan Bombyx mori.

Pseudomonas sp. merupakan bakteri yang patogen karena dapat menginfeksi saluran pernafasan, saluran pencernaan dan kornea (Driscoll et al.

2007). Kemampuan Pseudomonas sp. menyerang jaringan tergantung pada produksi enzim dan toksin yang merusak barier fisik dan sel-sel inang serta serta resistensi terhadap fagositosis dan pertahanan kekebalan tubuh inang (Kipnis et al.

2006).

SIMPULAN DAN SARAN Simpulan

Isolasi dan identifikasi bakteri pada kloaka imago betina ulat sutera liar A.

atlas mendapat 3 genus bakteri yakni Bacillus sp., Aeromonas sp. dan Pseudomonas sp.

Saran

Penelitian berikutnya diharapkan dapat melakukan uji yang lebih spesifik terhadap bakteri pada kloaka imago betina ulat sutera liar A. atlas, sehingga dapat diketahui jenis bakteri hingga tahap spesies. Dengan penelitian ini disarankan dalam budidaya agar melakukan desinfeksi terlebih dahulu pada telur-telur yang diproduksi untuk mencegah terjadinya penularan bakteri yang terdapat pada imago.