11
HASIL DAN PEMBAHASAN
Berdasarkan isolasi dan identifikasi bakteri pada saluran reproduksi A.
atlas didapatkan hasil seperti tersaji pada Tabel 2 sampai Tabel 7 berikut ini.
Dari sampel yang diisolasi pada agar darah (Tabel 2) didapatkan dua jenis koloni bakteri berbeda. Koloni A yang berukuran sedang, berbentuk bulat, permukaan halus, aspek tidak mengkilat, tepi rata, elevasi cembung, berwarna krem, dan tanpa adanya hemolisis pada agar darah. Koloni B yang berukuran sedang, berbentuk bulat, permukaan halus, aspek tidak mengkilat, tepi tidak rata, elevasi cembung, berwarna krem, dan menghasilkan beta-hemolisis. Hal ini menunjukkan bahwa koloni B mampu melisiskan butir darah merah yang terlihat sebagai wilayah jernih di sekitar koloni. Bila proses lisis sempurna akan terlihat wilayah yang benar-benar jernih dan jenis hemolisisnya disebut beta-hemolisis (Lay 1994).
Dari media MCA (Tabel 3) didapatkan satu jenis koloni yang berukuran kecil, berbentuk bulat, permukaan halus, aspek mengkilat, tepi rata, elevasi cembung, berwarna krem. Warna koloni yang sama dengan warna media atau tidak memperlihatkan perubahan pada media menunjukkan bakteri yang tidak memfermentasikan laktosa. Bakteri yang tidak memfermentasikan laktosa biasanya bersifat patogen (Lay 1994).
Tabel 2 Hasil isolasi bakteri saluran reproduksi imago betina A. atlas dengan media agar darah
Sampel Agar Darah
1A 1B 2A 2B 3A 3B 4A 4B
Ukuran Sedang Sedang Sedang Sedang Sedang Sedang Sedang Sedang
Bentuk Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat
Permukaan Halus Halus Halus Halus Halus Halus Halus Halus
Aspek Tidak mengkilat Tidak mengkilat Tidak mengkilat Tidak mengkilat Tidak mengkilat Tidak mengkilat Tidak mengkilat Tidak mengkilat
Tepi Rata Tidak rata Rata Tidak rata Rata Tidak rata Rata Tidak rata
Elevasi Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung
Sifat tembus
- - - -
Warna Krem Krem Krem Krem Krem Krem Krem Krem
Hemolisis - β - β - β - β
Tabel 3 Hasil isolasi bakteri saluran reproduksi imago betina A. atlas dengan media Mac Conkey Agar
Sampel Mac Conkey Agar
1 2 3 4
Ukuran Kecil Kecil Kecil Kecil
Bentuk Bulat Bulat Bulat Bulat
Permukaan Halus Halus Halus Halus
Aspek Mengkilat Mengkilat Mengkilat Mengkilat
Tepi Rata Rata Rata Rata
Elevasi Cembung Cembung Cembung Cembung
Sifat tembus - - - -
12
Gambar 4 Koloni bakteri yang tumbuh pada media agar darah dan MCA. (A) koloni bakteri pada agar darah non-hemolitik, (B) koloni bakteri pada agar darah β-hemolitik, (C) koloni bakteri pada MCA.
Koloni bakteri terpisah yang didapatkan selanjutnya dibiakkan ke dalam media agar miring trypticasesoy agar (TSA) yang merupakan media agar yang
digunakan untuk kegiatan pengisolasian berbagai macam mikroorganisme yang bersifat aerobik. Biakan murni yang tumbuh pada media agar darah (Tabel 4) dan MacConkey Agar (Tabel 5) diuji dengan pewarnaan Gram untuk melihat bakteri tersebut merupakan bakteri Gram positif atau negatif. Biakan murni adalah biakan yang hanya berisi satu jenis bakteri (Pelczar dan Chan 1988). Koloni A yang berasal dari media agar darah berbentuk batang halus, susunan tunggal, dan berwarna merah yang menunjukkan bakteri Gram negatif. Koloni B yang berasal dari media agar darah berbentuk batang, susunan berantai, berwarna ungu dan memiliki spora yang menunjukkan bakteri Gram positif. Koloni yang berasal dari media MCA berbentuk batang, susunan tunggal, berwarna merah yang menunjukkan bakteri Gram negatif.
Tabel 4 Hasil pewarnaan Gram bakteri pada saluran reproduksi imago betina A. atlas dari media agar darah
Sampel Pewarnaan Gram
1A 1B 2A 2B 3A 3B 4A 4B
Morfologi Batang halus Batang Batang halus Batang Batang halus Batang Batang halus Batang
Susunan Tunggal Berantai Tunggal Berantai Tunggal Berantai Tunggal Berantai
Warna Merah Ungu Merah Ungu Merah Ungu Merah Ungu
Spora - Ada - Ada - Ada - Ada
Gram Negatif Positif Negatif Positif Negatif Positif Negatif Positif
Tabel 5 Hasil pewarnaan Gram bakteri pada saluran reproduksi imago betina A. atlas dari media Mac Conkey Agar
Sampel Pewarnaan Gram
1 2 3 4
Morfologi Batang Batang Batang Batang
Susunan Tunggal Tunggal Tunggal Tunggal
Warna Merah Merah Merah Merah
Gram Negatif Negatif Negatif Negatif
13
Gambar 5 Hasil pewarnaan Gram bakteri pada media agar darah dan MCA. (A) koloni bakteri pada agar darah non-hemolitik, (B) koloni bakteri pada agar darah β-hemolitik, (C) koloni bakteri pada MCA.
Tabel 6 Hasil pengujian biokimia bakteri pada saluran reproduksi reproduksi imago betina A. atlas dari media agar darah
Sampel Pengujian Biokimia
1A 1B 2A 2B 3A 3B 4A 4B
Oksidase + + + +
TSIA Slant Basa Basa Basa Basa
Butt Asam Asam Basa Basa
Gas + + + + H2S - - - - Indol + + - - Urea - - + + Sitrat + + + + Voges Proskauer + + - -
Glukosa +/Gas (+) +/Gas (+) -/Gas (-) -/Gas (-)
Sukrosa +/Gas (+) +/Gas (+) -/Gas (-) -/Gas (-)
Laktosa +/Gas (+) +/Gas (+) -/Gas (-) -/Gas (-)
Manitol +/Gas (+) +/Gas (+) +/Gas (+) +/Gas (+)
Maltosa +/Gas (+) +/Gas (+) -/Gas (-) -/Gas (-)
Hasil identifikasi Aeromonas
sp. Bacillus sp. Aeromonas sp. Bacillus sp. Pseudomonas sp. Bacillus sp. Pseudomonas sp Bacillus sp.
Tabel 7 Hasil pengujian biokimia bakteri pada saluran reproduksi imago betina A. atlas dari media MacConkey Agar
Sampel Pengujian Biokimia
1 2 3 4
Oksidase + + + +
TSIA Slant Basa Basa Basa Basa
Butt Asam Asam Asam Asam
Gas + + + + H2S - - - - Indol + + - - Motilitas - - - - Urea - - - - - Sitrat + + + + Voges Proskauer + + + +
Glukosa +/Gas (+) +/Gas (+) +/Gas (+) +/Gas (+)
Sukrosa +/Gas (+) +/Gas (+) +/Gas (+) +/Gas (+)
Laktosa +/Gas (+) +/Gas (+) +/Gas (+) +/Gas (+)
Manitol +/Gas (+) +/Gas (+) +/Gas (+) +/Gas (+)
Maltosa +/Gas (+) +/Gas (+) +/Gas (+) +/Gas (+)
Hasil identifikasi Aeromonas
sp. Aeromonas sp. Aeromonas schubertii Aeromonas schubertii A B C A B C
14
Gambar 6 Hasil uji oksidase. (A) kontrol negatif oksidase menggunakan Escherichia coli dan Salmonella sp., (B) hasil positif dari koloni bakteri gram negatif pada agar darah, (C) hasil positif dari koloni bakteri Gram negatif pada MCA.
Isolat bakteri yang berasal dari media agar darah (Tabel 6) dan MacConkey Agar (Tabel 7) selanjutnya dilakukan pengujian biokimia dengan menggunakan media Triple Sugar Iron Agar (TSIA), Indol, Simmon’s citrate agar, Voges-Proskauer (VP), urea, dan kaldu gula-gula (glukosa, sukrosa, laktosa, manitol, dan maltosa).
Hasil uji menggunakan media TSIA pada bagian slant dan butt bersifat basa-asam (merah-kuning) dengan gas, serta tidak memproduksi H2S mengarah pada genus Morganella, Providencia, Salmonella, Plesiomonas, Hafnia, Serratia,
Shigella, Yersinia, Aeromonas, Escherichia dan Enterobacter. Pada bagian slant
dan butt bersifat basa-basa (merah) mengarah pada Pseudomonas (Mahon et al. 2007). Hasil positif didapatkan pada uji oksidase terhadap semua isolat bakteri, hal ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut merupakan famili
non-Enterobacteriaceae yang terdiri dari genus Campylobacter sp., Helicobacter sp., Aeromonas sp., Pseudomonas sp., Vibrio sp., Neisseria sp., dan Alcaligenes sp..
(Bergey dan Breed 1994). Tidak ditemukannya bakteri famili Enterobacteriaceae disebabkan imago A. atlas yang sebelumnya sudah tidak melakukan aktivitas makan setelah menjadi pupa.
Hasil positif pada uji indol mengarah pada Aeromonas sp., Edwardsiella sp., Escherichia coli, Flavobacterium sp., Haemophilus influenza, Klebsiella
oxytoca, Proteus sp., Plesiomonas shigelloides, Pasteurella multocida, Pasteurella pneumotropica dan Vibrio sp.. Hasil negatif mengarah pada Actinobacillus sp., Aeromonas schubertii, Alcaligenes sp., Bordetella sp., Enterobacter sp., Haemophillus sp., Klebsiella sp., Neisseria sp., Pasteurella haemolytica, Pasteurella ureae, Proteus mirabilis, Proteus penneri, Pseudomonas
sp., Salmonella sp., Serratia sp., dan Yersinia sp. (MacFaddin 1980). Hasil uji indol positif yang didapatkan sesuai pernyataan Abbot et al. (2003) yang menyatakan sembilan spesies anggota Aeromonas (A. hydrophila, A. bestiarum, A.
salmonicida, A. caviae, A. media, A. eucrenophila, A. sobria, A. veronii, dan A. veronii bv. sobria) semuanya memberikan hasil positif untuk uji indol. Hasil
negatif hanya ditunjukkan satu spesies yaitu A. schubertii (Awan et al. 2005). Hasil uji urea mendapatkan hasil positif yang menunjukkan bahwa bakteri mampu menghasilkan enzim urease yang mengurai urea menjadi ammonium dan CO2, hidrolisis urea ditunjukkan dengan perubahan warna media dari merah-jingga menjadi merah ungu (Lay 1994). Hasil negatif menunjukkan tidak ada perubahan warna pada media. Hasil uji sitrat positif pada semua isolat bakteri hal ini menunjukkan bahwa bakteri dapat menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi (Lay 1994).
A
15 Hasil uji Voges-Proskauer positif mengarah pada Enterobacter sp.,
Klebsiella sp., Serratia marcescens, Hafnia alvei, Vibrio damsela, dan Vibrio alginolyticus. Hasil negatif mengarah pada Citrobacter sp., Shigella sp., Yersinia
sp., Edwardsiella sp., Salmonella sp., Vibrio furnissii, Vibrio fluvialis, Vibrio
vulnificus, dan Vibrio parahaemolyticus (Bergey dan Breed 1994).
Hasil uji kaldu gula-gula berupa glukosa, sukrosa, laktosa, manitol, dan maltosa menunjukkan hasil positif dan menghasilkan gas mengarah pada genus
Aeromonas sp. dan Vibrio sp. (Bergey dan Breed 1994). Hasil negatif pada semua
kaldu gula kecuali manitol mengarah pada genus Pseudomonas sp (Bergey dan Breed 1994). Menurut Woo dan Bruno (2011), Aeromonas sp. mampu memfermentasi fruktosa, galaktosa, maltosa, trehalosa, manitol, sukrosa, glukosa, dextrin dan glikogen, memberikan hasil uji positif pada uji indol, memproduksi gas dari glukosa.
Dari hasil isolasi dan identifikasi yang telah dilakukan, didapatkan hasil Gram positif, dengan bentuk morfologi batang, diisolasi pada kondisi aerob, dan memiliki spora mengarah pada genus Bacillus sp. (Bergey dan Breed 1994; Lay 1994). Bakteri Gram negatif dengan bentuk morfologi batang dan hasil positif pada uji oksidase mengarah pada Aeromonas sp., Pseudomonas sp., dan Vibrio sp. hal ini sesuai dalam Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (Bergey dan Breed 1994). Dari hasil pengujian secara biokimia isolat bakteri didapatkan hasil bakteri Gram positif berupa Bacillus sp., Gram negatif berupa Aeromonas sp.,
Aeromonas schubertii, dan Pseudomonas sp..
Hasil penelitian ini sesuai dengan Anand et al. (2010) yang berhasil mengisolasi Bacillus circulans, Aeromonas sp. dan Pseudomonas aeruginosa pada saluran pencernaan B. mori. Ditemukannya bakteri tersebut berguna sebagai pendegradasi polisakarida dalam proses pencernaan B. mori terhadap daun murbei. Bakteri ini diisolasi dari saluran reproduksi imago betina A. atlas diduga berasal dari fase larva sebagai mikroflora normal yang kemudian bertahan sampai fase imago. Hasil ini juga sesuai dengan Sakthivel et al. (2012) yang berhasil mengidentifikasi Pseudomonas fluorescence, Bacillus subtilis dan Bacillus cereus pada larva ulat sutera B. mori yang sakit. Hal ini dikuatkan dengan pernyataan Cappellozza et al. (2011) dan Manimegalai (2009) dalam buku Silk Biomaterials
for Tissue Engineering and Regenerative Medicine (Kundu 2014), yang
menyatakan bahwa bakteri yang paling umum yang menginfeksi B. mori adalah
Streptococcus sp., Pseudomononas aeruginosa, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus bombyseptiseus, Staphylococcus aureus, Serratia marcescens dan Enterococcus mundtii.
Hasil penelitian ini juga sesuai dengan pernyataan Badan Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan (BKIPM 2011) yang melakukan pemantauan daerah sebar Hama dan Penyakit Ikan Karantina (HPIK) di wilayah Purwakarta yang mengidentifikasi Aeromonas hydrophila, Yersinia
enterocolitica, Aeromonas schubertii, Aeromonas media, Citrobacter freundii, Bacillus sp., dan Aeromonas popoffii. Hal ini membuktikan bahwa bakteri yang
berhasil diidentifikasi berasal dari penyebaran Aeromonas sp. Aeromonas
schubertii, dan Bacillus sp. pada lingkungan di wilayah Purwakarta.
Bacillus sp. secara alami terdapat dimana-mana, dan termasuk spesies
yang hidup bebas atau bersifat patogen. Beberapa spesies Bacillus menghasilkan enzim ekstraseluler seperti protease, lipase, amilase, dan selulase yang bisa
16
membantu pencernaan dalam tubuh hewan (Wongsa dan Werukhamkul, 2007).
Aeromonas hydrophila dan Aeromonas schubertii dapat ditemukan diberbagai
lingkungan perairan seperti air tanah, air permukaan, air payau, air laut, dan air limbah (EPA 2006) termasuk di air kolam ikan (Wulandari 2012). Bakteri ini biasanya patogenik pada hewan seperti ikan, reptil, dan jarang pada mamalia (Quinn et al. 2002).
Aeromonas sp. merupakan patogen, baik pada manusia maupun hewan
(ikan, amfibi, reptil) (EPA 2006). Pseudomonas sp. secara luas dapat ditemukan di alam, contohnya di tanah, air, tanaman, dan hewan. Pseudomonas sp. adalah patogen oportunistik yaitu memanfaatkan kerusakan pada mekanisme pertahanan inang untuk memulai suatu infeksi (Boel 2004). Bakteri ini merupakan salah satu jenis mikroflora normal pada saluran pencernaan dan kulit manusia, namun terkadang bakteri ini juga dapat berubah menjadi patogen oportunistik yang menyebabkan bronkopneumonia kronis pada manusia saat kondisi imun tubuh menurun (Tellez et al. 2010).
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Berdasarkan hasil penelitian telah diidentifikasi tiga genus bakteri, terdiri dari Bacillus sp., Aeromonas sp., dan Pseudomonas sp. dengan satu spesies bakteri Gram negatif yakni Aeromonas schubertii dari saluran reproduksi imago betina ulat sutera liar A. atlas yang berasal dari perkebunan teh PTPN VIII Purwakarta, Jawa Barat. Semua bakteri yang berhasil diidentifikasi merupakan bakteri patogen dan patogen oportunistik.
Saran
Diperlukan studi lanjutan untuk mengidentifikasi bakteri sampai tingkatan spesies dengan memperbanyak jenis uji biokimiawi dan atau menggunakan
polymerase chain reaction (PCR). Selain itu perlu penelitian lain untuk
mengidentifikasi mikroorganisme selain bakteri yang hidup dalam saluran reproduksi imago betina ulat sutera liar A.atlas atau organ yang lain.
DAFTAR PUSTAKA
Abbot SL, Sharon W, Cheung KW, Janda JM. 2003. The genus Aeromonas : biochemical characteristics, atypical reaction, and phenotypic identification schemes. J. Clin. Microbiol 41: 2348.
Anand AAP, Vennison SJ, Sankar SG, Prabhu DIG, Vasan PT, Raghuraman T, Geoffrey CJ, Vendan SE. 2010. Isolation and characterization of bacteria from the gut of Bombyx mori that degrade cellulose, xylan, pectin, and starch and their impact on digestion. Journal of Insect Science 10: 107.
