METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Praktikum dilakukan pada hari Rabu, 14 September sampai 19 Oktober 2016 pukul 13.00 WIB sampai selesai di Laboratorium Pendidikan Departemen Biokimia IPB.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan yaitu mortar, perangkat elektroforesis, sentrifus, tabung sentrifus, neraca,pipet mikro, tip, tabung effendorf, gelas piala, labu takar, pH meter, tabung Erlenmeyer, gelas piala, Uv transiluminator, incubator dan vortex.
Bahan-bahan yang digunakan adalah daun jahe merah, daun kunyit, Tris Hcl 25 mM, EDTA 10 mM, sukrosa 15 %, NaOH 0.2 M, SDS 1 %, larutan Na asetat 3 M pH 4.6, larutan fenol:kloroform, etanol absolut, etanol 70 %, dH2O steril, akuades, media NB, 0.5 g ekstral khamir, 1 g tripton, 0.5 g NaCl, 50 ppm ampicillin, DNA plasmid, Buffer restriksi, enzim retriksi, pewarna Etbr, buffer ekstraksi, buffer lisis 1 (SDS 20 %), buffer lisis 2 (potassium asetat 5 M), larutan kloroform;isoamilalkohol (24:1), alcohol dingin 100%, buffer TE, agarosa, asam borat, loading dye, es batu dan DNA marker 1 kb.
Prosedur Pembuatan Larutan Isolasi DNA Plasmid
Larutan isolasi DNA plasmid terdiri dari larutan 1 (Tris-HCl 1 M pH 7.5, EDTA 0.5 M, Sukrosa 20%), larutan 2, larutan 3, buffer TE, dan Nutrient Broth (NB).
Stok Tris-HCl 1 M pH 7.5 pada larutan 1. Dibuat dari 3.0285 g Tris-HCl yang dilarutkan dalam 25 mL akuades. Stok EDTA 0.5 M dibuat dari 4.655 g EDTA yang dilarutkan dalam 25 mL akuades. Stok sukrosa 20% dibuat dengan melarutkan 5 g sukrosa dalam 25 mL akuades. Larutan 1 akhir dibuat dengan mencampur 1,25 mL Tris-HCl, 2 mL EDTA dan 37.5 mL sukrosa dan dilarutkan dengan akuades hingga volume akhirnya 50 mL.
Stok NaOH 0.2 M larutan 2. Dibuat dari 0.5 g NaOH yang dilarutkan dalam 25 mL akuades. Stok SDS 1% dibuat dengan melarutkan 2.5 g SDS dalam 25 mL akuades. Larutan 2 akhir dibuat dengan mencampur 20 mL NaOH dan 5 mL SDS 1% lalu dilarutkan dengan akuades hingga volume akhirnya 50 mL.
Na-asetat 3 M pH 4.6. Dibuat dengan melarutkan 6.1570 g Na-asetat dalam akuades lalu diadjust pHnya dengan asetat glasial hingga pH menjadi 4.6 lalu akuades ditambahkan hingga volume akhirnya 25 mL.
Buffer TE. Dibuat dengan mencampur Tris-HCL dan EDTA dengan konsentrasi sama yaitu 0.025 M
Isolasi dan pemurnian DNA plasmid
Kultur bakteri yang telah dibiakkan semalaman dalam media NB (Nutrient Broth) sebanyak 1.5 mL di pipet ke dalam tabung eppendorf lalu disentrifugasi 8.000 rpm selama 3 menit. Pelet diambil dan dicuci 3 kali dengan buffer TE dengan perbandingan 1 mL Tris HCl dan 1 mL EDTA. Larutan 1 ditambahkan ke supernatan sebanyak 1 mL kemudian larutan divorteks sehingga pelet tersuspensi. Tabung diinkubasi di atas es selama 5 menit kemudian ditambahkan larutan 2 sebanyak 2 mL lalu tabung ditutup dan isinya dihomogenkan dengan membolak-balik tabung. Tabung disimpan di atas es selama 5 menit dan ditambahkan larutan 3 sebanyak 1.5 mL lalu tabung ditutup dan dibolak-balik agar homogen kemudian diinkubasi di atas es selama 5 menit. Tabung lalu disentrifugasi selama 10 menit pada suhu 4°C dan diambil supernatannya kemudian ditambahkan larutan fenol/kloroform sebanyak 300 µL. Supernatan kemudian divorteks lalu disentrifugasi selama 5 menit. Lapisan atas dipindahkan ke tabung eppendorf baru dengan hati-hati lalu ditambahkan etanol absolut 1 mL kemudian divorteks dan diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Tabung disentrifugasi selama 5 menit, diambil peletnya dan disuspensi dengan 1 mL etanol 70% lalu divorteks 1 menit dan disentrifugasi. Pelet diambil dan dikeringkan lalu disuspensi dalam 20-50 µL dH2O/ Buffer TE (10 mL Tris HCl pH 7.5-8 dan 1 mM EDTA).
Pembuatan Larutan Isolasi DNA Kromosom
Pembuatan buffer lisis 1 dibuat dari 10 g SDS yang diencerkan dalam labu takar 50 mL sehingga konsentrasinya menjadi 20%. Buffer lisis 2 dibuat dari 24.53 g K-asetat yang dilarutkan dalam 50 mL akuades sehingga konsentrasinya menjadi 5 M. Buffer ekstraksi terdiri dari akuades steril, Tris-HCl 1 M pH 8, EDTA 0.5 M pH 8, NaCl 5 M, CTAB 2%, β-merkaptoetanol 2% dan buffer TE 0.01 M pH 7.6. Stok Tris-HCl 4 M diencerkan menjadi 1 M dengan melarutkan 625 mL stok dalam 25 mL akuades steril. Stok EDTA 0.79 M diencerkan menjadi 0.5 M dengan melarutkan 15.82 mL stok dalam 25 mL akuades steril. NaCl 5 M dibuat dari 7.3125 g serbuk NaCl yang dilarutkan dalam 25 mL akuades steril. CTAB 2% dibuat dari 0.5 g CTAB yang dilarutkan dalam 25 mL akuades steril. β-merkaptoetanol 2% dibuat dengan melarutkan 0.5 mL larutan dalam 25 mL akuades steril. Buffer TE dibuat dari 10 mM Tris-HCl pH 7.6 dicampur 1 mM Na2EDTA.2H2O pH 8.
Isolasi Kromosom Daun Jahe Merah dan Kunyit
dibuang, dan pellet dikeringkan dengan cara membalikan tabung. Setelah kering, pellet ditambahkan dengan 50 µL larutan TE maka didapatkan DNA kromosom. DNA kromosom tersebut didimpan pada lemari es.
Pemotongan DNA Plasmid dengan Enzim Retriksi
Sebanyak 16 µL NFW (Nuklease Free Water) dimasukan kedalam tabung effendorf dalam keadaan dingin. Selanjutnya ditambahkan 2 µL buffer enzim, 1 µL DNA plasmid dan 1 µL enzim retriksi. Setiap penambahan larutan dilakukan homogenasi dengan pipeting. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 oC selama 1 jam. Kemudian ditambahakan Etbr dan diinkubasi kembali pada suhu 65 sampai 70 oC selama 1 jam. Kemudian dilakukan elektroforesis dengan 75 sampai 100 volt selama 1 sampai 2 jam. Hasil plasmid pemotongan dibandingkan dengan DNA plasmid utuh.
Pembuatan Larutan dan Gel untuk Elektroforesis Agarosa
Larutan buffer TBE 5X dibuat dari Tris HCl 1 M pH 8.3, asam borat 0.83 M dan EDTA 10 mM. Gel agarosa terbuat dari agarosa yang ditimbang 0.5 g lalu dilarutkan dalam 50 mL buffer TBE 5X. Gel lalu dituang ke dalam cetakan gel agarosa dan setelah membeku diletakkan ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi buffer TBE 5X sampai gel terendam.
Elektroforesis Gel Agarosa
