III. METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian dilakukan selama 10 bulan dari bulan Maret – Desember 2008, di Balai Besar Riset Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan Jakarta.
3.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah natrium alginat dari
Sargassum sp., natrium alginat dari Turbinaria sp. dan natrium alginat komersial.
Bahan natrium alginat diperoleh dari hasil ekstraksi rumput laut Sargassum sp. dan
Turbinaria sp. yang diperoleh dari perairan Binuangeun, Provinsi Jawa Barat. Sebelum
ekstraksi, rumput laut diperlakukan dengan perendaman dalam alkali (KOH 0.1% selama 1 jam), dicuci dengan air tawar dan dikeringkan (Yunizal et al. 2000). Ekstraksi alginat dilakukan dengan metode yang dikembangkan di Balai Besar Riset Pengolahan Produk dan Bioteknologi kelautan dan Perikanan Jakarta, yang meliputi proses demineralisasi, pencucian, ekstraksi, penarikan asam alginat dengan larutan HCl, pencucian asam alginat, konversi ke natrium alginat dengan larutan NaOH, penarikan natrium alginat alginat dengan alkohol, pengeringan dan penggilingan (Anonim, 2000). Prosedur ekstraksi natrium alginat dapat dilihat pada Lampiran 1.
Alginat komersial yang digunakan dalam penelitian adalah alginat komersial viskositas sedang dari Sigma Co. dan alginat komersial yang tidak diketahui asalnya diperoleh dari toko kimia. Alginat komersial yang diproduksi oleh Sigma Co. berasal dari rumput laut Macrocystis pyrifera (Alvares & Carmona, 2007; Mancini et al.1999).
Bahan kimia yang dipergunakan terdiri dari: kalium hidroksida, natrium hidroksida, asam sulfat, asam nitrat, asam perklorat, isopropil alkohol, glukono-δ-laktone (GDL), locust bean gum (LBG), natrium sulfat, natrium karbonat, kalsium karbonat, standar logam berat/mineral (As, Pb, Ca) dan natrium hipoklorit
3.3 Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian meliputi: stable mycrosystem
TA-XT2 texture-analyze, lemaripembeku/coldstorage, mixer, batang pengaduk, grinder,
penyaring vibrator, cetakan gel, glassware, bak plastik, timbangan analitik, rapid
viscoanalyzer (RVA), Fourier Transmittance Infra Red (FTIR), dan Atomic Absorbtion Spectroscopy (AAS).
3.4 Metode Penelitian
Penelitian terdiri dari 3 tahapan yang meliputi (1) karakterisasi sifat fisiko kimia
natrium alginat, (2) penentuan konsentrasi CaCO3 untuk pembentukan gel dan
karakteristik gel alginat yang dihasilkan serta (3) pengaruh interaksi alginat dengan
locust bean gum (LBG) terhadap karakteristik gel dan viskositas yang dihasilkan.
Secara umum garis besar penelitian disajikan pada Gambar 3.
Tahap 1. Karakterisasi sifat fisiko kimia natrium alginat
Penelitian ini dilakukan untuk mengevaluasi karakteristik bahan baku natrium alginat hasil ekstraksi dari kedua jenis rumput laut serta alginat komersial yang dapat mempengaruhi pembentukan dan karakteristik gelnya. Terhadap natrium alginat yang diperoleh dilakukan pengamatan yang meliputi kadar air (gravimetri), bahan tidak larut air (gravimetri), kadar abu (gravimetri), logam/mineral Pb, As, Ca (spektrofotometri), viskositas apparent, rendemen untuk natrium alginat dari rumput laut lokal (gravimetri) serta estimasi M/G rasio (spektrofotometri).
Tahap 2. Penentuan konsentrasi CaCO3 untuk pembentukan gel dan karakteristik
gel alginat yang dihasilkan
Penenelitian ini bertujuan untuk menentukan konsentrasi kalsium karbonat
(CaCO3) untuk pembentukan gel alginat dari rumput laut lokal Sargassum sp. dan
Turbinaria sp., karakteristik gel yang dihasilkan serta mendapatkan konsentrasi CaCO3
yang dibutuhkan untuk meningkatkan viskositas alginat lokal tersebut apabila aplikasinya akan diarahkan sebagai bahan pengental. Dari tahap penelitian ini
diharapkan diperoleh informasi mengenai berapa jumlah CaCO3 yang diperlukan untuk
membentuk gel dari alginat, karakteristik gel yang dihasilkan serta informasi mengenai kemungkinan pemanfaatan ion tersebut untuk meningkatkan viskositas alginat.
Pengamatan: 1. viskositas apparent 2. stabilitas viskositas thd panas 3. recovery viskositas
Gambar 3. Skema penelitian
Senyawa CaCO3yang bersifat kurang larut dalam air dipakai sebagai sumber ion
Ca2+ dan untuk meningkatkan kelarutannya digunakan glucono-δ-lakton sebagai
pengatur keasaman sistem. Konsentrasi CaCO3 yang ditambahkan divariasi dari 0, 2.5,
5, 7.5, 10, 12.5, 15, 20, 25, 30 mM. Pembentukan gel dilakukan dengan melarutkan alginat pada konsentrasi 1% dalam akuades bebas ion dengan stirer selama 30 menit,
menambahkan CaCO3 sambil tetap distirer, dan penambahan GDL sampai semua larut.
Larutan kemudian dimasukan dalam cetakan berukuran diameter 3.5 cm tinggi 5 cm dan Pengamatan karakteristik gel: 1. visual 2. keteguhan gel 3. karakteristik tekstur - karakteristik pecah - kekuatan gel - modulus rigidity - elastisitas 4. sineresis Karakterisasi natrium alginat
dari Sargassum, Turbinaria, Komersial (Penelitian tahap 1)
Pengaruh CaCO3pada pembentukan
dan karakteristik gel alginat (Penelitian tahap 2)
Konsentrasi CaCO3 : 0, 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5,
15, 20, 25, 30 mM. Konsentrasi alginat 1 %, GDL 30 mM.
Pengaruh interaksi natrium alginat Dengan locust bean gum (LBG)
(Penelitian tahap 3)
Konsentrasi LBG: 0, 10, 20, 30, 40, 50 g / 100 g alginat. Konsentrasi alginat yang digunakan 1 %, GDL 30 mM.
Konsentrasi CaCO3 20 mM untuk gel dan
3.5 mM untuk larutan viskous. Karakteristik gel dan viskositas LBG tanpa alginat diamati pada konsentrasi
CaCO3 20 mM
tidak terbentuk gel
terbentuk gel
Pengamatan: - kadar air
- Bahan tak larut air - kadar abu
- Kadar Pb, As, Ca - viskositas apparent - rendemen
dibiarkan selama 1 jam pada suhu ruang. Selanjutnya gel dilepaskan dari cetakan. Pengamatan yang dilakukan meliputi visual (bagaimana bentuk gel yang dihasilkan), karakteristik gel yang meliputi keteguhan gel, karakteristik tekstur diukur dengan alat
Stable Micro System TA-XT2 Texture-Analyzer dan sineresis. Pada konsentrasi
penambahan CaCO3 yang tidak membentuk gel, terhadap larutan alginat dilakukan
pengukuran viskositas dengan RVA.
Pada konsentrasi penambahan CaCO3 yang tidak membentuk gel, dilakukan
pengamatan viskositas. Penelitian tahap 2 menunjukkan bahwa hanya konsentrasi
CaCO3 2.5 mM yang tidak menghasilkan gel, sedangkan konsentrasi 5 mM
menghasilkan gel yang sangat lemah (cairan viskoelastis). Oleh karena itu untuk mengetahui berapa besar peningkatan viskositas alginat yang dapat dihasilkan dari
penambahan CaCO3 perlakuan dipecah langi menjadi konsentrasi 2.5; 3.5 dan 4.5 mM.
Larutan ditambahkan CaCO3 sesuai perlakuan sambil diaduk, kemudian ditambahkan
GDL sambil diaduk sampai larut dan dibiarkan selama 1 jam pada suhu ruang.
Viskositas diamati dengan RVA pada suhu 200C dan kecepatan putaran 130 rpm.
Terhadap alginat dengan viskositas tertinggi yang tidak menghasilkan pembentukan gel diamati ketahanan viskositas terhadap panas dengan RVA (rapid viscoanalyzer).
Tahap 3. Pengaruh interaksi alginat dengan locust bean gum (LBG) terhadap karakteristik gel dan viskositas yang dihasilkan
Penelitian bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh interaksi natrium alginat dengan locust bean gum (LBG) baik terhadap karakteristik gel maupun karakteristik viskositas yang dihasilkan. Perlakuan yang dicobakan adalah penambahan LBG sebanyak 0, 10, 20, 30, 40, 50 g/100g alginat. Pembentukan gel dilakukan pada konsentrasi larutan alginat 1% dengan konsentrasi CaCO3 terpilih dari penelitian tahap
2 (20 mM) dan glukono-δ-lactone yang tetap. Untuk melihat pengaruh penambahan LBG terhadap karakteristik viskositas alginat penambahan LBG dilakukan pada
konsentrasi CaCO3 terpilih (3.5 mM) dan konsentrasi GDL tetap. Pengamatan terhadap
gel yang dihasilkan meliputi visual (bagaimana bentuk gel yang dihasilkan), karakteristik gel yang meliputi keteguhan gel, karakteristik tekstur diukur dengan alat
Stable Micro System TA-XT2 Texture-Analyzer dan sineresis.
Pada produk yang tidak membentuk gel pengamatan yang dilakukan meliputi viskositas apparent dan stabilitas viskositas terhadap panas serta recovey viskositas.
Untuk melihat ada tidaknya sinergisme dilakukan pengamatan karakteristik viskositas dan gel LBG tanpa alginat dengan penambahan Ca terpilih dan GDL yang tetap.
3.5 Pengamatan
Pengamatan yang dilakukan dalam penelitian ini meliputi:
3.5.1 Kadar air (metode gravimetri) (FAO, 2006)
Ditimbang sampel 1-2 g dalam cawan porselen atau botol yang diketahui beratnya (sebelumnya cawan / botol dikeringkan pada oven selama 30 menit), dan
dimasukkan dalam oven pada suhu 1050C selama 4 jam. Cawan berisi sampel
didinginkan dalam desikator dan ditimbang beratnya segera setelah mencapai suhu ruang. Perlakuan diulang sampai diperoleh berat konstan. Kadar air dihitung sebagai: kadar air (%) = (berat awal-berat akhir) / berat sampel x 100%.
3.5.2 Bahan tidak larut air (metode gravimetri) (FAO, 2008)
Sebanyak 2 g sampel dilarutkan dengan 800 ml air dalam labu 2000 ml. Larutan dinetralkan sampai pH 7 dengan larutan NaOH 6.5% (w/v) dan dilebihkan dengan menambahkan 3 ml. Ditambahkan 40 ml larutan hidrogen peroksida yang mengandung
30% berat H2O2, ditutup dan dipanaskan sampai mendidih selama 1 jam sambil sering
diaduk. Selagi panas larutan disaring dalam cawan gooch yang telah diketahui beratnya (A) yang dilengkapi penyaring fibre glass no 934 AH Reeve angel & co, atau yang setara. Apabila sulit disaring karena terlalu kental, larutan dipanaskan sampai viskositas turun dan mudah disaring. Cawan dicuci dengan air panas, dan dikeringkan pada oven 1050C 1 jam, didinginkan dan ditimbang (B). Bahan tidak larut air dihitung dalam berat kering dan dinyatakan dalam persen.
Bahan tidak larut air = (B – A)/berat sampel x 100 %.
3.5.3 Kadar abu total (FAO, 2006)
Ditimbang sejumlah sampel (tergantung jenisnya dan diperkirakan diperoleh abu sekitar 20 mg) dalam cawan porselen berpenutup yang diketahui beratnya. Cawan berisi
sampel kemudian diabukan dalam furnace pada suhu 5500C sampai diperoleh abu bebas
karbon. Apabila tidak diperoleh abu yang bebas karbon, basahkan abu dengan air panas, ratakan dengan pengaduk gelas keringkan pada oven dan diabukan kembali. Jika abu bebas karbon belum diperoleh, dinginkan cawan, tambahkan 15 ml ethanol, pecahkan abu dengan pengaduk gelas dan bakar ethanol, dan lanjutkan dengan pengabuan. Cawan didinginkan dalam desikator dan ditimbang segera setelah mencapai suhu ruang. Kadar abu diukur sebagai:
Kadar abu (%) = berat abu / berat sampel x 100%
3.5.4 Logam/mineral Pb, As, Ca (AOAC, 2000, FAO, 2006, SNI 01-2357-1991
dimodifikasi)
Sampel ditimbang dengan tepat 2.5 g dan dimasukkan dalam labu kjeldahl 150 ml, ditambahkan 5 ml larutan asam nitrat dan segera dipanaskan sampai reaksi berlanjut. Didinginkan dan ditambahkan secara bertahap 4 ml larutan asam sulfat dan dipanaskan sampai larutan secara signifikan menjadi gelap. Ditambahkan lagi sedikit asam nitrat pekat perlahan dan dipanaskan lagi sampai menghitam. Larutan tidak boleh dipanaskan terlalu kuat untuk menghindari pengarangan berlebihan atau kehilangan arsen. Pemanasan dilanjutkan sampai larutan berwarna kekuningan dan tidak kehitaman lagi.
Jika larutan masih berwarna, ditambahkan 0.5 ml asam perklorat dan sedikit asam nitrat pekat dan dipanaskan selama 15 menit, ditambahkan lagi 0.5 ml asam perklorat dan dipanaskan lagi beberapa menit. Setelah dingin dilarutkan dengan 10 ml akuadesh, dan larutan harus tidak berwarna. Kemudian larutan didihkan sampai terbentuk uap putih dan didinginkan. Setelah dingin ditambahkan 10 ml 5 N HCl dan dipanaskan lagi beberapa menit (10 menit). Setelah dingin larutan dipindahkan ke labu ukur 50 ml sampai tidak ada bagian yang tertinggal dalam labu kjeldahl, dan volume ditepatkan 50 ml dengan menambahkan akuadesh.
Pembacaan dilakukan dengan AAS merk Aanalyst 800 dilengkapi dengan autosampler. Atomisasi dilakukan dengan otomizer tipe graphite furnace (elektro
thermal atomizer). Larutan standar yang digunakan larutan Pb dengan konsentrasi 0, 10,
20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 μg/L.
Dari pembacaan standar dibuat grafik hubungan antara absorbansi dan konsentrasi Pb dalam larutan. Hasil pembancaan absorbansi sampel setelah dikurangi pembacaan blangko dimasukkan dalam persamaan hubungan antara absorbansi dan konsentrasi Pb dalam larutan dan diperoleh nilai konsentrasi Pb dalam larutan sampel (A μg/L). Kadar Pb dalam sampel dihitung sbb:
Kadar Pb (mg/Kg) = A x (50/1000) / berat sampel x 1000
Untuk analisa Ca, konsentrasi standar yang digunakan yaitu dengan konsentrasi 0; 0.5; 1; 1.5; 2; 3 dan 4 mg/L. Pembacaan dilakukan dengan AAS merk Solaar AA
Series, dengan atomisasi tipe nyala dengan bantuan gas NO2. Sebelum pembacaan
konsentrasi Ca standar dibuat. Nilai pembacaan absorbansi sampel setelah dikurangi blangko dimasukkan dalam persamaan hubungan antara absorbansi standar dan konsentrasi Ca standar dan diperoleh nilai konsentrasi Ca dalam larutan sampel ( A mg/L). Kadar Ca dalam sampel dihitung sbb:
Kadar Ca (%) = A x 50/1000 x fp x (1/1000) /bberat sampel x 100 % Analisa Arsen menggunakan standar dengan variasi konsentrasi 1, 3, 5, 7, dan 10 μg/L. Hubungan antara absorbansi standar dan konsentrasi As standar dibuat. Nilai pembacaan absorbansi sampel setelah dikurangi blangko dimasukkan dalam persamaan hubungan antara absorbansi standar dan konsentrasi As standar dan diperoleh nilai konsentrasi As dalam larutan sampel ( A μg/L). Kadar As dalam sampel dihitung sbb:
Kadar As (mg/Kg) = A x (50/ 1000) / berat sampel
3.5.5 Rendemen (Rasyid, 2003a,b)
Rendemen alginat yang dihasilkan dihitung sebagai berat alginat yang diperoleh dari hasil ekstraksi dibandingkan dengan berat bahan rumput laut dikalikan 100 %.
3.5.6 Perkiraan rasio M/G (Sakugawa et al. 2004)
Pengamatan dilakukan untuk mengetahui perkiraan rasio mannuronat/ guluronat dalam alginat. Sebelum pembentukan pelet KBr, sampel alginat disiapkan terlebih dahulu untuk mengkonversi garam alginat dalam bentuk kalsium alginat. Sebanyak 50 mg sampel alginat dilarutkan dalam air bebas ion untuk medapatkan 2.5% larutan
sampel. Sampel alginat kemudian diteteskan dalam larutan 0.5 M CaCl2 dan dibiarkan
semalam. Garam alginat yang mengendap dipisahkan dengan centrifugasi dan dikeringkan dengan freeze drier. Preparasi pelet dilakukan dengan menimbang 2 mg sampel dan menambahkan 200 mg KBr dan dicampur sampai homogen dengan mortar. Pelet dibentuk dalam pencetak pelet pada kondisi vakum dan bertekanan. Spektra sampel alginat diamati dengan FTIR pada panjang gelombang 4000 – 400 nm. Rasio M/G dilakukan dengan membandingkan rasio absorbansi pada panjang gelombang 1030/1080 nm. Data dimasukkan dalam persamaan hubungan rasio absorbansi dengan kandungan mannuronat yang dibuat Sakugawa et al. 2004. Rasio M/G dihitung sebagai M/(100-M).
3.5.7 Viskositas apparent
Pengamatan dilakukan pada konsentrasi solid 1 – 5 % untuk mengetahui hubungan antara konsentrasi dengan viskositas larutan. Sampel ditimbang 1 – 5 g berat
kering, dan ditambahkan air bebas ion sampai terbentuk larutan 100 ml. Viskositas
dibaca dengan RVA pada suhu 200C dengan putaran 130 rpm. Pembacaan dilakukan
selama 2 menit dan nilai yang diamati merupakan rata-rata viskositas tertinggi dari pengamatan pada selang 0.5 – 1 menit, 1 – 1.5 menit dan 1.5 – 2 menit. Viskositas dinyatakan dalam centipois (mPa.s).
3.5.8 Visual
Bentuk dan penampakan gel yang terbentuk diamati secara visual seperti bentuk permukaan, kekompakan, keseragaman gel dan karakteristik gel lainnya dan difoto.
3.5.9 Keteguhan gel
Tinggi gel awal diukur (y mm) dan setelah dilepaskan dari cetakan dan dibiarkan selama 5 menit diukur (y’mm). Keteguhan gel dinyatakan sebagai
y’/y x 100%.
3.5.10 Karakteristik Tekstur
Pengamatan karakteristik gel dilakukan dengan tes penetrasi menggunakan Stable Micro System TAXT2 teksture analyzer dengan probe silinder berdiameter 10 mm pada kecepatan 0.5 mm/s sampai kedalaman penetrasi 25 mm (Marrs & Titoria, 2004). Persiapan sampel dilakukan dengan melarutkan alginat pada konsentrasi 1%
dalam akuades bebas ion dengan stirer selama 30 menit, menambahkan CaCO3 sambil
tetap distirer, dan penambahan GDL sampai semua larut. Larutan kemudian dimasukan dalam cetakan berukuran diameter 3.5 cm tinggi 5 cm dan dibiarkan selama 1 jam pada suhu ruang sampai terbentuk gel. Selanjutnya gel dilepaskan dari cetakan dan dianalisa. Parameter yang diamati meliputi karakteristik pecah, kekuatan gel, modulus rigidity, dan elastisitas. Karakteristik pecah diamati dari kurva yang terbentuk pada saat gel pecah apakah bentuknya halus atau bergelombang/ bertahap. Kekuatan gel diamati sebagai puncak gaya (g) pada saat gel pecah dibagi luas kontak area. Modulus rigidity didekati dari kemiringan kurva yang diperoleh dengan bantuan software Texture
Exponent 32. Semakin besar kemiringan kurva artinya modulus rigidity semakin besar.
Elastisitas didekati dari pengukuran jarak yang dicapai probe (mm) pada saat gel tersebut pecah.
3.5.11 Sineresis
Dilakukan preparasi pembuatan gel pada wadah yang telah diketahui beratnya. Gel disimpan dalam refrigerator suhu 40C selama 24 jam dan air yang terlepas dari gel
dihilangkan dengan kertas penyerap air. Gel kemudian ditimbang dan sineresis dinyatakan sebagai selisih berat / berat awal x 100% (Draget et al. 2001).
3.5.12 Stabilitas viskositas terhadap panas dan recovery viskositas
Sampel 0.25 - 1 g ditambahkan air bebas ion sampai 25 g (konsentrasi 1-4%), dimasukkan kaleng sampel RVA, dikocok bersama pengaduknya selama 15 menit sampai larut. Pengukuran viskositas dengan RVA dilakukan dengan profile yang dimodifikasi dengan pengaturan suhu sebagai berikut: 0-7 menit suhu dinaikkan dari 200 C ke 900 C, ditahan selama 1 menit. Suhu diturunkan bertahap menjadi 200C selama
7 menit. Untuk mendapatkan hasil yang akurat maka perhitungan berat sampel dinyatakan dalam berat kering, dan berat air yang ditambahkan ditimbang sampai berat akhir 25 g.
Profile viskositas yang diperoleh dipakai sebagai dasar penentuan stabilitas viskositas terhadap panas dan recovery viskositas. Stabilitas viskositas terhada panas dinyatakan dalam persen dan dihitung sebagai:
(viskositas awal – viskositas terendah) x 100 %. Stabilitas viskositas (%) =
viskositas awal
Recovery viskositas dinyatakan dalam persen dan dihitung sebagai :
Viskositas akhir x 100 %
Recovery viskositas (%) =
viskositas awal
3.6 Rancangan Penelitian
Penelitian dilakukan dengan rancangan acak lengkap faktorial dengan 3 kali ulangan. Model linear aditif dari rancangan penelitian menurut Mattjik & Sumertajaya (2006) adalah sbb:
Yijk = μ + αi + βj + (αβ)ij + εijk dimana,
Yijk = nilai pengamatanpada faktor A taraf ke-i faktor B taraf ke-j dan ulangan ke
k
(μ, αi, βj) = komponen aditif dari rataan pengaruh utama faktor A dan pengaruh utama
faktor B
(αβ)ij = komponen interaksi dari faktor A dan faktor B
εijk = pengaruh acak yang menyebar normal (0, σ2)
Pengamatan visual disajikan dalam bentuk foto dari gel yang dihasilkan. Karakteristik gel yang tebentuk disajikan secara diskriptif berupa grafik hubungan
antara gaya yang diberikan dan perubahan pada sampel (force-distance) yang dihasilkan dari pembacaan dengan alat Stable Micro System TA-XT2 Texture-Analyzer. Parameter lain seperti kekuatan gel, elastisitas, modulus rigidity, viskositas, stabilitas viskositas oleh panas, recovery viskositas serta sineresis dianalisa dengan anova (analysis of
variance). Apabila terdapat beda nyata antar perlakuan, analisa dilanjutkan dengan uji
LSD (least significantly different) untuk penelitian tahap 1 dan DMRT (Duncan
