UJI BIOAKTIFITAS EKSTRAK LIPID DALAM Zymomonas mobilis DENGAN METODE BSLT (Brine Shrimp Lethality Test)

(1)

UJI BIOAKTIFITAS EKSTRAK LIPID DALAM

Zymomonas mobilis

DENGAN METODE BSLT

(Brine Shrimp Lethality Test)

Oleh ELOK WIDAYANTI 1406 201 808

PROGRAM MAGISTER KIMIA FMIPA ITS Surabaya

(2)

Zymomonas mobilis

Kelebihan

Zymmomonas mobilis mampu bertahan hidup pada lingkungan dengan kadar alkohol yang tinggi (Herman, dkk; 1991) Divisio : Bacteria

Sub Divisio : Proteobacteria

Kelas : Alpha Proteobacteria Famili : Sphingomonadaceal

Genus : Zymomonas

Spesies : Zymomonas mobilis

(3)

(4)

Zymomonas

Zymomonas mobilis

mobilis

o Sahm,1991_{Total hopanoid pada Zymomonas mobilis ATCC 29191} adalah 30 mg/g berat sel kering

o Flesch dan Rohmer 1989_{Hopanoid dalam Z.mobilis yang terdeteksi :} diplopten (0,2 mg/g berat sel kering), diplopterol (0,8 mg/g),

bakteriohopanotetrol (1 mg/g), bakteriohopanotetrol eter (1,7 mg/g)

o Nagumo, 1991_{Bacteriohopane-32-ol mempunyai efek citotoxic} dengan mencegah dua lines sel leukemia

o Chen, 1994 _{Bakteriohopan-32,33,34,35-tetrol (Tetrol),}

bakteriohopan-32-ol , diplopten, diplopterol dan bakteriohopan-32-ol terasetilasi yang diisolasi dari bakteri Acetobacter aceti mempunyai efek citotoksik terhadap sel leukemia L1210 dan P388.

(5)

Bioaktif dapat dapat diuji melalui aktifitas ekstrak

lipid

uji pendahuluan dengan BSLT (Brine

Shrimp Lethality Test) (Meyer dan

Ferrigini,1982)

Keunggulan BSLT : perkembangbiakannya cepat,

harganya murah, metode percobaannya mudah,

sampel yang diperlukan sedikit, tidak

memerlukan laboratorium yang khusus dan

hasilnya dapat dipercaya (Steven dan Russel,

1993).

(6)

Tujuan Penelitian

Untuk

UntukUntuk

Untuk memperolehmemperolehmemperoleh LC50 memperoleh LC50 LC50 LC50 ekstrakekstrakekstrakekstrak lipid lipid lipid lipid padapadapadapada Artemia

ArtemiaArtemia

Artemia salinasalinasalinasalina Senyawa

SenyawaSenyawa

Senyawa----senyawasenyawasenyawasenyawa yang yang yang terdapatyang terdapatterdapat dalamterdapat dalamdalamdalam ekstrak

ekstrakekstrak

ekstrak lipidlipidlipidlipid

RUMUSAN MASALAH

Bagaimana efek ekstrak lipid Zymomonas mobilis terhadap pertumbuhan Artemia salina (BSLT)?

(7)

Metodologi Penelitian

Pembuatan kurva pertumbuhan

Produksi Biomassa

Ekstraksi lipid total

Uji toksisitas dengan metode BSLT

Skrining Hopanoid P P R O S E D U R

(8)

Hasil dan Pembahasan

Ekstrak lipid yang diperoleh adalah sebesar 0,37 g atau

19,47% terhadap berat sel kering.

Menurut Ketchum (1988) kandungan lipid total dari

sebagian spesies-spesies bakteri berkisar 1%-10%.

Dengan demikian kandungan lipid pada bakteri

Zymomonas mobilis tergolong cukup besar, hal ini

kemungkinan disebabkan adanya lipid membran seperti

hopanoid, glikolipid, fosfolipid, dan asam lemak

(9)

3 2 3 4 7 8 7 6 31,25 4 3 3 5 6 7 7 5 62,5 5 5 5 4 5 5 5 6 125 8 10 10 5 2 0 0 5 250 10 10 10 10 0 0 0 0 500 Rata-rata mati Mati Rata-rata hidup Hidup Konsentrasi (ppm)

Jumlah rata-rata udang laut (Artemia salina L) yang mati

pada larutan uji ekstrak lipid

(10)

Perhitungan % mortalitas udang laut (Artemia salina L)

pada larutan uji ekstrak lipid

13,0 0,1304 20 3 1,4949 31,25 35 0,35 13 7 1,7959 62,5 63,2 0,6316 7 12 2,0969 125 90,9 0,9090 2 20 2,3979 250 100 1 0 30 2,6990 500 Mortalitas (%) Ratio Mati total Hidup Akumulasi (C) Mati Akumulasi (A) Log Konsentrasi Konsentrasi (ppm)

(11)

Ratio Mati Total =

D

B

A

−

A= jumlah Artemia salina yang mati pada larutan uji B= jumlah Artemia salina yang mati pada kontrol D= jumlah Artemia salina total (A+C)

(12)

log konsentrasi vs %m ortalitas y = 76.346x - 99.672 0 20 40 60 80 100 120 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 log konsentrasai % m o rt a li ta s

Grafik hubungan antara konsentrasi ekstrak lipid dengan % mortalitas larva udang (Artemia salina L)

(13)

Regresi linier

y = 76,346x – 99,672

50 = 76,346x – 99,672

x = 1,96

x = log c

c = 91,2 ppm

LC

₅₀

= 91,2 ppm

(14)

Ekstrak lipid memiliki nilai LC

₅₀

sebesar 91,2 ppm.

Suatu senyawa dikatakan aktif jika memiliki harga LC

₅₀

≤

250 ppm dan dikatakan tidak aktif jika memiliki harga

LC

₅₀

> 250 ppm (Meyer dan Ferrigini ,1982).

Nilai LC

₅₀

untuk ekstrak lipid adalah 91,2 ppm, hal ini

menunjukkan bahwa senyawa tersebut bersifat aktif dan

memiliki sifat bioaktifitas tinggi, yang artinya pada

konsentrasi yang kecil sudah bersifat toksik dan

mematikan terhadap larva udang.

(15)

(16)

Kromatogram SM puncak ke 28

Waktu retensi (t

_R

) 27,317 menit

(17)

Spektra Massa puncak ke 28 dengan waktu retensi 27,317 menit merupakan spektra dari asam palmitat mempunyai peak dasar m/z 43 yang merupakan ciri dari fragmen asetil. Fragmen yang lain merupakan rantai alkil, yaitu m/z 115, 171, 185. Fragmen dengan m/z 256 merupakan Mr dari asam lemak ini. Struktur asam palmitat ditunjukkan pada gambar berikut :

O

(18)

Kromatogram SM puncak ke 30

Waktu retensi (t

_R

) 27,763 menit

(19)

Fragmen-fragmen ion yang muncul pada gambar di atas adalah m/z 83, 97, 55 dan 69 dimana fragmen ion ini khas dari alkilsikloheksana. dimana teridentifikasi m/z 196 sebagai massa molekul relatifnya. Berdasarkan identifikasi tersebut, maka senyawa pada puncak ke 30 adalah alkil sikloheksana dengan rumus molekul C₁₄H₂₈. Struktur senyawanya dapat dilihat pada gambar berikut :

(20)

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 0.0 25.0 50.0 75.0 100.0 % 43 57 69 55 ₈₃ 97 111 84 125 210 139 ₁₅₄ ₁₈₂ 109 129 167 195

Gambar 4.9 Kromatogram SM puncak ke 35

Kromatogram SM puncak ke 35

Waktu retensi (t

_R

) 28,944 menit

(21)

Beberapa fragmen ion yang muncul pada gambar di atas adalah m/z 83, 97, 55 dan 69 dimana fragmen ion ini khas dari alkilsikloheksana. Kemudian teridentifikasi m/z 210 sebagai massa molekul relatifnya. Berdasarkan identifikasi tersebut, maka senyawa pada puncak ke 35 adalah alkil sikloheksana dengan rumus molekul C₁₅H₃₀. Struktur senyawanya dapat dilihat pada gambar berikut :

(22)

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 0.0 25.0 50.0 75.0 100.0 % 43 83 55 69 97 111 84 125 44 ₁₁₆ 139 ₁₅₃ ₁₆₈ ₁₈₂ _{196 207} ₂₂₄

Kromatogram SM puncak ke 42

(23)

Beberapa fragmen ion yang muncul pada gambar di atas adalah m/z 83, 97, 55 dan 69 dimana fragmen ion ini khas dari alkilsikloheksana. Kemudian teridentifikasi m/z 224 sebagai massa molekul relatifnya. Berdasarkan identifikasi tersebut, maka senyawa pada puncak ke 42 adalah alkil sikloheksana dengan rumus molekul C₁₆H₃₂. Struktur senyawanya dapat dilihat pada gambar berikut :

(24)

Pernyataan ini didukung oleh penelitian yang telah

dilakukan oleh Ratna Djamil dkk menyebutkan pada ekstrak metanol mempunyai nilai LC50 178,2 ppm. Dari ektrak

metanol telah diisolasi tiga senyawa yaitu kolesta-2,4-dien-3ol asetat (24-dehidrokolesterol asetat) atau desmosterol asetat, asam tetradekanoat (asam miristat) dan asam

heksadekanoat (asam palmitat).

Struktur

teridentifikasi

Asam Palmitat

Alkil sikloheksan

(25)

KESIMPULAN

Ekstrak

lipid pada

Zymomonas

mobilis

memiliki nilai LC

₅₀

sebesar 91,2 ppm dimana

menunjukkan

bahwa

senyawa

yang

terkandung didalamnya bersifat aktif pada uji

BSLT

Senyawa yang terdeteksi pada ekstrak lipid

adalah asam palmitat dan alkil sikloheksan

(26)

(27)

Produksi Biomassa

1 jarum ose Zymomonas mobilis dari biakan miring

- diinokulasikan pada 10 mL media cair steril

- diinkubasi 20 jam dengan dishaker kecepatan 120 rpm - ditambah media cair sampai volume 100 mL

- diinkubasi 20 jam dengan dishaker kecepatan 120 rpm - disentrifuse pada 3000 rpm selam 30 menit

Sel basah

- diliofilisasi Sel kering

(28)

Ekstraksi Lipid Total

0,2 gr sel kering

- diekstrak 2 kali dengan 50 mL kloroform/metanol (2:1 v/v)

- disaring filtrat

- dievaporasi

(29)

Ekstrak Lipid

- diambil 1 mg

Larutan uji 1000 ppm

- ditambah etanol 100 µL

- ditambah aquades sampai volume 1000 µL

- divariasi konsentrasi 500; 250; 125; 62,5; 31,25 ppm

(30)

1 mg telur Artemia salina

- dibiarkan 48 jam

Telur menetas

- dimasukkan dalam 16 wadah masing-masing 10 ekor

Angka kematian artemia salina - ditambahkan larutan uji - diamati selama 24 jam

(31)

Skrining Hopanoid

Lipid total

- distirer selama 1 jam, ditambah air 10 mL - diekstrak dengan n-heksan 3 kali

Fasa organik (mengandung hopanoid) - ditambah Na₂SO₄ anhidrat dekantir Fasa air - dibuang - didekantasi residu - dievaporasi

Aldehid hopanoid n-heksan

(32)

Aldehid hopanoid

- distirer selama 1 jam, ditambah 15 mL 0,1 M KH₂PO₄

- diekstrak dengan n-heksan 3 kali Fasa organik

(mengandung alkohol hopanoid)

- ditambah Na₂SO₄ anhidrat dekantir Fasa air - didekantasi residu - dievaporasi

Alkohol hopanoid n-heksan

(33)

Alkohol hopanoid

- pemisahan dengan kromatografi kolom 20 mL kedua alkohol hopanoid

- diasetilasi

hopanoid tersetilasi - dianalisa KGMS Kromatogram