UJI PENGHAMBATAN AKTIVITAS

(1)

1 Universitas Indonesia

UJI PENGHAMBATAN AKTIVITAS



-GLUKOSIDASE EKSTRAK

DAN FRAKSI DAUN

Antidesma neurocarpum

Miq.

SERTA

IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWA KIMIA DARI FRAKSI

TERAKTIF

Rieka Widihasputri, Berna Elya dan Azizahwati Fakultas Farmasi Universitas Indonesia

Program Sarjana Farmasi ABSTRAK

Diabetes melitus adalah penyakit berupa gangguan metabolisme yang ditandai dengan hiperglikemia dan abnormalitas metabolisme karbohidrat, lemak, dan protein. Diabetes melitus dapat diobati dengan inhibitor -glukosidase. Penelitian terdahulu dilaporkan bahwa ekstrak metanol daun Antidesma neurocarpum Miq. memiliki memiliki aktivitas penghambatan yang kuat terhadap -glukosidase (IC50=2,18 µg/mL). Uji penghambatan aktivitas -glukosidase dilakukan untuk mengetahui ekstrak dan fraksi teraktif serta mengetahui golongan senyawa kimia dari ekstrak dan fraksi teraktif tersebut. Ekstraksi dilakukan dengan maserasi bertingkat (n-heksan, etil asetat dan metanol). Uji penghambatan aktivitas -glukosidase dilakukan dengan microplate reader (=405 nm). Sebagai standar, digunakan akarbosa (IC50=38,37 μg/mL). Ekstrak metanol memiliki aktivitas penghambatan

-glukosidase paling kuat dengan persen inhibisi paling tinggi (89,53%). Ekstrak metanol tersebut diidentifikasi golongan senyawa kimianya dan difraksinasi dengan kromatografi kolom dipercepat. Fraksinasi menghasilkan 15 fraksi gabungan. Fraksi gabungan yang lebih dari 200 mg diuji aktivitas penghambatannya terhadap -glukosidase. Fraksi gabungan ke-8 adalah fraksi gabungan teraktif (IC50=40,77 µg/mL) dengan mekanisme penghambatan secara kompetitif terhadap -glukosidase. Golongan senyawa kimia yang terdapat pada ekstrak metanol dan fraksi gabungan daun Antidesma neurocarpum Miq. adalah flavonoid, tanin, glikosida, fenol dan alkaloid.

Kata Kunci : -glukosidase; akarbosa; Antidesma neurocarpum Miq.; diabetes melitus.

ABSTRACT

Diabetes mellitus is a disease that symphyton of metabolism disfunction showed by hyperglikemia and abnormallity of carbohydrates, fats, and proteins metabolism. It’s known can be cured with -glycosidase inhibitor. Previous experiment reported that methanol extract from leaves of Antidesma neurocarpum Miq. has a strong inhibitory activity of  -glukosidase (IC50=2,18 µg/mL). This experiment is done to know about the most active extract and fraction of inhibitory activity of -glycosidase and also the chemical compounds from those most active extract and fraction. Extraction is done by using multilevel maceration (n-hexane, ethyl acetate and methanol). Inhibitory activity of -glycosidase tested with microplate reader (=405 nm). As standard, used akarbosa (IC50=38.37 μg/mL). Methanol extract has the strongest inhibitory activity of -glycosidase with the highest inhibitor percentage (89,53%). It’s identified the chemical compounds and fracinationed by flash column chromatography. Fractination produced 15 combined fractions. Combined fractions which more than 200 mg tested to know their inhibitory activity of -glukosidase. Result showed that the most active fraction is the 8th (IC50=40,77 µg/mL) with a competitive inhibitor mechanism to -glycosidase. Chemical compounds that is found in the methanol

(2)

extract and 8th fraction of Antidesma neurocarpum Miq. leaves are flavonoids, tannins, glycosides, fenol and alkaloids.

Key Words : -glukosidase; akarbose; Antidesma neurocarpum Miq.; diabetes melitus.

PENDAHULUAN

Diabetes melitus (DM) adalah gangguan metabolisme yang ditandai dengan hiperglikemia dan abnormalitas metabolisme karbohidrat, lemak, dan protein. Hal ini disebabkan akibat berkurangnya sekresi insulin, menurunnya sensitivitas insulin, atau keduanya (DiPiro, et al., 2005). Prevelensi penyakit diabetes ini diperkirakan akan meningkat terus dari tahun 2000 yang hanya 2,8 menjadi 4,4 % di tahun 2030 mendatang (Wild, et all., 2004). Besarnya insidensi, prevelensi dan komplikasi DM menggambarkan betapa pentingnya pencegahan dan penatalaksanaan dini penyakit tersebut.

Inhibitor α-glukosidase diketahui merupakan salah satu agen terapi untuk pengobatan gangguan metabolisme karbohidrat, khususnya diabetes (Gao, et al., 2010). Salah satu obat yang termasuk golongan inhibitor α-glukosidase adalah akarbose yang telah disetujui untuk penggunaan klinis dalam pengobatan diabetes tipe 2 (Dong dan Ni, 2008), namun akarbose diketahui dapat menimbulkan efek samping seperti distensi perut, perut kembung, dan diare. Berbagai penelitian dilakukan untuk mencari inhibitor α-glukosidase lain yang lebih efektif dan aman. Penelitian-penelitian tersebut untuk mencari inhibitor α-glukosidase yang berasal dari bahan alami (Dong dan Ni, 2008). Hal ini didasarkan atas pertimbangan bahwa penggunaan obat tradisional memiliki efek samping lebih sedikit dari obat sintesis (Sari, 2006) dan didorong dengan pengetahuan bahwa zat alami dalam beberapa tanaman memiliki efek penghambatan α-glukosidase yang cukup baik. Selain itu, penggunaan bahan alami sebagai pengobatan banyak diminati masyarakat.

Antidesma adalah salah satu bagian dari marga tumbuhan dalam suku Euphorbiaceae yang banyak dimanfaatkan sebagai obat tradisional (Buske, et al, 2009). Salah satu tanaman dari suku Euphorbiaceae ini adalah Antidesma neurocarpum Miq. yang diketahui mengandung glikosida, tanin, antrakuinon dan flavanoid (Elya, et al., 2012). Data dari penelitian sebelumnya yang menguji ekstrak metanol daun Antidesma neurocarpum Miq., didapatkan nilai IC50 2,18 µg/mL (Elya, et al.,2012), namun belum diketahui fraksi yang memiliki aktivitas penghambatan terhadap α-glukosidase paling kuat.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui ekstrak dan fraksi yang memiliki aktivitas penghambatan α-glukosidase tertinggi dari daun Antidesma neurocarpum Miq. dan

(3)

mengetahui golongan senyawa kimia dari fraksi teraktif tersebut yang selanjutnya dapat dimanfaatkan untuk pengobatan penyakit diabetes melitus.

Penelitian ini bermanfaat untuk memberikan informasi ilmiah pada masyarakat. Selain itu, dengan dilakukannya penelitian ini, dapat diketahui ekstrak dan fraksi teraktif dari daun Antidesma neurocarpum Miq. dalam menghambat aktivitas α-glukosidase yang nantinya diharapkan dapat dikembangkan sebagai obat antidiabetes baru.

TINJAUAN PUSTAKA Enzim

Enzim merupakan biomolekul berupa protein yang berfungsi sebagai katalis dalam metabolisme tubuh. Katalis adalah substansi yang hanya mempercepat laju reaksi kimia dalam tubuh, tetapi tidak ikut bereaksi atau mengalami perubahan selama reaksi tersebut (McPherson & Pincus, 2011). Enzim mengkatalisis konversi satu atau lebih senyawa (substrat) menjadi satu atau lebih senyawa lain (produk) dengan meningkatkan laju reaksinya 106 kali lebih cepat dibandingkan jika tanpa katalis (Murray,et al.,2009).

Molekul enzim memiliki kantung khusus yang disebut active site. Active site ini mengandung rantai samping asam amino yang membentuk permukaan tiga dimensi. Active site ini akan mengikat substrat kemudian membentuk kompleks enzim-substrat (ES). ES diubah menjadi enzim-produk (EP) yang kemudian akan berdisosiasi menjadi enzim bebas dan produk. (Harvey dan Ferrier, 2010)

Inhibitor enzim adalah suatu zat yang dapat menurunkan kecepatan reaksi katalisis dari suatu enzim. Berdasarkan mekanisme inhibisi enzim, inhibitor enzim diklasifikasikan menjadi dua, yaitu irreversible dan reversible. Inhibisi irreversible terjadi ketika terbentuknya ikatan kovalen dengan gugus fungsi spesifik enzim sehingga menyebabkan enzim menjadi inaktif. Inhibitor reversible dapat berikatan dengan inhibitor secara bolak-balik. Ada dua tipe inhibitor reversible yaitu kompetitif dan nonkompetitif (Seager dan Slabaugh, 2008).

Uji Penghambatan Aktivitas α-Glukosidasea

α-Glukosidase adalah suatu enzim yang mengkatalisis pemecahan kompleks karbohidrat menjadi gula sederhana di bagian tepi permukaan sel usus halus (Chisholm-Burns, et al., 2008). α-Glukosidase dapat menghidrolisis ikatan glukopiranosida membentuk α-D-glukosa sehingga kadar glukosa meningkat (Dewi, et al., 2007).

(4)

α-Glukosidase yang diisolasi dari Saccharomyces cerevisiae yang direaksikan dengan substrat p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida (pNGP) akan menghasilkan p-nitofenol yang berwarna kuning (Wilson dan Walker, 2010). Reaksi enzimatis α-glukosidase dan p-nitrofenil-α-D-glukopiranosa dapat dilihat pada Gambar 2.6. Apabila ekstrak tanaman memiliki kemampuan menghambat aktivitas α-glukosidase maka p-nitrofenol yang dihasilkan akan berkurang (Dewi, et al., 2007).

[Sumber : Guo, et al., 2010]

Gambar 1. Reaksi enzimatis α-glukosidase dan p-nitrofenil-α-D-glukopiranosa

Antidesma neurocarpum Miq.

Antidesma neurocarpum Miq. berasal dari suku Euphorbiaceae. Tanaman ini termasuk golongan dikotil. (Indonesian Institute of Sciences National Biological, 1985; Jones, S.B dan Luchsinger, A.E, 1987).

. Fraksinasi

Fraksinasi adalah proses penarikan atau pemisahan senyawa pada ekstrak dengan menggunakan dua macam pelarut yang tidak bercampur. Proses pemisahan komponen yang diinginkan dengan komponen lain ini didasarkan pada prinsip kepolaran senyawa dan pelarut. Metode yang dapat digunakan untuk memisahkan komponen-komponen senyawa umumnya berupa metode kromatografi, yakni kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis.

Kromatografi Lapis Tipis

KLT adalah metode pemisahan fisikokimia yang didasarkan atas penyerapan, partisi atau gabungannya (Harmita, 2006) dan merupakan metode pemisahan fisikokimia yang didasarkan pada adsorpsi, partisi, atau kombinasi keduanya, tergantung dari jenis zat penyangga, cara pembuatan, dan jenis pelarut yang digunakan (Depkes RI, 1995a). KLT adalah bagian dari kromatografi cair. Dimana fase gerak pada metode ini berupa cairan dan fase diamnya dilekatkan pada lapisan tipis dengan permukaan yang rata atau berupa padatan

(5)

absorben. Derajat retensi dinyatakan dengan Rf yang digunakan untuk menyatakan posisi dari zat setelah pengembangan, dapat dihitung dengan (Alexander & Griffiths, 1993) :

(1)

Harga Rf dipengaruhi oleh jenis penyerap, ketebalan, metode arah pengembangan, kadar dan jumlah cuplikan, dan jarak yang ditempuh bercak.

Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi cair yang baik digunakan untuk pemisahan campuran dalam skala besar (lebih dari 1 gram). Kromatografi kolom terbagi dua jenis yaitu kromatografi kolom lambat dan kromatografi kolom dipercepat (kilat). Pada kromarografi kolom dipercepat, pelarut pengembang didorong dengan cepat (dengan tekanan gas) melalui kolom yang berisi penjerap basah. Pada kromatografi kolom fase diam yang digunakan dapat berupa silika gel, selulosa atau poliamida. Sedangkan fase geraknya dapat dimulai dengan pelarut non polar kemudian ditingkatkan kepolarannya secara bertahap, baik dengan pelarut tunggal ataupun kombinasi dua pelarut yang berbeda kepolarannya dengan perbandingan tertentu sesuai tingkat kepolaran yang dibutuhkan.

Penapisan Fitokimia

Penapisan fitokimia adalah pemeriksaan kandungan kimia secara kualitatif untuk mengetahui golongan senyawa yang terkandung dalam suatu tumbuhan. Pemeriksaan diarahkan pada senyawa metabolit sekunder yang memiliki khasiat bagi kesehatan seperti, alkaloid, flavonoid, terpen, tanin, saponin, glikosida, kuinon dan antrakuinon (Harborne, 1987).

METODE PENELITIAN Lokasi dan Waktu Penelitian

Laboratorium Penelitian Fitokimia dan Laboratorium Kimia Farmasi Analisis Kuantitatif Fakultas Farmasi Universitas Indonesia, Depok, mulai Februari sampai Mei 2012.

Alat

Timbangan analitik (AND GR-202®), rotary vacuum evaporator (Hanshin®, Ika®, Buchii®),penangas air (Imperial IV ®), freezer dengan temperatur -20ºC (Modena®), lemari

(6)

pendingin dengan temperatur 2-6ºC, termometer, vortex mixer, pH meter (Eutech Instruments®), mikropipet (Thermo®), inkubator suhu 37ºC (Biotek ELX 808), microplate reader (Biotek ELX 808), pipet volume, vacuum pump, bejana KLT, pipa kapiler , kolom kromatografi, vial dan botol penampung berbagai ukuran, dan alat-alat gelas.

Bahan Bahan Uji

Ekstrak methanol, ekstrak etil asetat dan ekstrak n-heksan dari daun Antidesma neurocarpum Miq yang telah didapatkan dari Laboratorium Penelitian Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Indonesia yang diekstraksi secara maserasi bertingkat.

Bahan Kimia

α-Glukosidase yang berasal dari Saccharomyces cerevisiae (Sigma-Aldrich®), p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida (Sigma-Aldrich®), bovine serum albumin (Merck, Jerman), akarbose (Dexa Medica, Indonesia), kalium dihidrogen fosfat (Merck, Jerman), dimetil sulfoksida (DMSO) (Merck, Jerman), etil asetat teknis (Brataco), n-heksana teknis (Brataco), metanol teknis (Brataco), etanol 96% teknis (Brataco), aqua demineralisata (Brataco), silika gel 60 F254 (Merck, Jerman), kalium iodida, bismuth nitrat, kalium hidroksida, natrium hidroksida, natrium karbonat (Merck, Jerman), asam klorida (Merck, Jerman), asam nitrat (Merck, Jerman), gelatin, besi (III) klorida, asam sulfat, Pb (II) asetat, sodium sulfat anhidrat (Merck, Jerman), akuades, air bebas CO2, natrium karbonat (Merk, Jerman), lempeng KLT dan silika gel.

Bahan Pembanding

Akarbosa (Dexa®), ekstrak metanol kina, ekstrak metanol daun teh, ekstrak metanol Theae Folium, ekstrak metanol kuarsetin, ekstrak metanol orthosiphon, ekstrak metanol Digitalis Folium, ekstrak metanol Liquiritae Radix.

Prosedur Pelaksanaan

Uji pendahuluan berupa penentuan aktivitas α-glukosidase dan optimasi konsentrasi substrat dilakukan sebelum dilakukan uji penghambatan aktivitas α-glukosidase. Akarbosa sebagai standard dilakukan uji penghambatan aktivitas α-glukosidase nya terlebih dahulu lalu selanjutnya pada ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksan. Ekstrak dengan persen inhibisi tertinggi, dilakukan identifikasi golongan senyawa kimianya dan dilakukan fraksinasi dengan

(7)

metode kromatografi kolom dipercepat. Metode KLT digunakan pada proses pengelompokkan fraksi hasil kromatografi kolom dipercepat tersebut hingga didapatkan beberapa fraksi gabungan. Uji penghambatan aktivitas α-glukosidase kembali dilakukan pada fraksi-fraksi gabungan tersebut. Fraksi gabungan teraktif kemudian diuji kinetika penghambatan α-glukosidasenya dan diidentifikasi golongan senyawa kimianya.

Penyiapan Larutan Pereaksi Uji Penghambatan Aktivitas α-Glukosidase Larutan Dapar Fosfat pH 6,8

Kalium dihidrogenfosfat 0,2 M dibuat dengan melarutkan 6,805 g kalium dihidrogenfosfat dalam aqua demineralisata bebas karbondioksida dan diencerkan hingga 250,0 mL. Natrium hidroksida 0,2 M dibuat dengan melarutkan 1,6 g NaOH dalam air demineralisata bebas karbondioksida hingga 200,0 mL. Dapar fosfat pH 6,8 dibuat dengan mencampurkan 125,0 mL kalium dihidrogenfosfat 0,2 M dengan 56,0 mL natrium hidroksida 0,2 M dan diencerkan dengan air demineralisata bebas karbondioksida hingga 500,0 mL.

Larutan α-Glukosidase

Larutan α-glukosidase (stok) dibuat dengan cara melarutkan 5,0 mg α-glukosidase dalam 50 mL larutan Bovine Serum Albumin (BSA) dalam kondisi suhu rendah (2-8ºC). Kemudian larutan α-glukosidase (stok) diencerkan dengan dapar fosfat pH 6,8 hingga diperoleh aktivitas sebesar 1,5 Unit/mL.

Larutan substrat p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida (PNPG)

Larutan substrat 20 mM dibuat dengan cara melarutkan 60,25 mg PNPG dalam 10,0 mL aqua demineralisata bebas karbondioksida. Larutan substrat dapat diencerkan dengan aqua demineralisata bebas karbondioksida hingga diperoleh konsentrasi larutan substrat 20; 10; 5; 2,5; 1,25 dan 0,625 mM sehingga dalam pengujian diperoleh konsentrasi akhir masing-masing 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625 dan 0,0312 mM. Larutan substrat untuk pengujian harus segar dan harus segera digunakan setelah dibuat.

Larutan Natrium Karbonat 200 mM

Serbuk natrium karbonat sejumlah 10,6 gditimbang kemudiandilarutkan dengan 500 mL akua demineralisata bebas karbondioksida sehingga mencapai konsentrasi 200 mM. pH natrium karbonat yang digunakan adalah 8,7.

(8)

8 Universitas Indonesia Fraksinasi Ekstrak Metanol dengan Kromatografi Kolom Dipercepat

Sebelum dilakukan fraksinasi dengan kromatografi kolom, terlebih dahulu ditentukan perbandingan pelarut yang memberikan pemisahan paling baik pada bercak dengan kromatografi lapis tipis (KLT). Ekstrak metanol ditimbang sebanyak 10,0 mg kemudian dilarutkan dengan 1 mL metanol. Larutan ekstrak ditotolkan pada lempeng KLT dan dielusi dalam bejana yang telah dijenuhkan selama 30 menit. Setelah dielusi, lempeng dikeluarkan, dikeringkan, dan diamati bercaknya dengan menggunakan lampu UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm. Kemudian disemprot dengan pereaksi semprot universal, asam sulfat 10% dalam metanol. Perbandingan pelarut yang memberikan pemisahan yang baik pada lempeng KLT digunakan sebagai fase gerak untuk fraksinasi dengan kromatografi kolom.

Ekstrak kering metanol daun Antidesma neurocarpum Miq. ditimbang dengan seksama kurang lebih 40,0 g lalu dilarutkan dengan sedikit metanol kemudian ditambahkan ± 18 g silika hingga sekiranya homogen. Sampel tersebut dimasukkan ke dalam kolom dan pada bagian atas sampel diletakkan kembali kertas saring. Fase gerak yang digunakan adalah gradien pelarut n-heksan dan etil asetat kemudian dilanjutkan gradien etil asetat dan metanol yang ditingkatkan kepolarannya. Masing-masing hasil fraksi ditotolkan pada lempeng KLT dan dielusi dalam bejana yang berisi campuran eluen dan telah dijenuhkan selama 30 menit. Setelah dielusi, lempeng KLT dikeringkan dan diamati dengan menggunakan lampu UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm. Fraksi-fraksi yang memiliki pola kromatografi sama digabungkan.

Kromatografi Lapis Tipis

Hasil dari kromatografi kolom dipercepat dikelompokkan menggunakan metode kromatografi lapis tipis. Cara pengelompokkannya adalah dengan melihat spot-spot atau pola kromatografinya. Hasil dari kromatografi lapis tipis ini kemudian dilihat pula dengan sinar UV dengan  256 dan 365 nm. Pola kromatografi yang sama kemudian disatukan menjadi satu fraksi gabungan. Hasil penggabungan adalah sebanyak lima belas fraksi gabungan.

Uji Pendahuluan Aktivitas -Glukosidase

Uji pendahuluan harus dilakukan terlebih dahulu sebelum melakukan uji penghambatan aktivitas enzim α-glukosidase. Variabel yang dioptimasi adalah konsentrasi substrat. Prosedur optimasi konsentrasi substrat dapat dilihat pada Tabel 1.

(9)

9 Universitas Indonesia Tabel 1. Prosedur Optimasi Konsentrasi Substrat

Sampel (S) Kontrol (K)

Reagen Volume (µL) Reagen Volume (µL) Dapar fosfat (pH 6,8) 66 Dapar fosfat (pH 6,8) 66 PNPG (konsentrasi 5/ 4/ 3/ 2/ 1

mM) 17

PNPG (konsentrasi 5/4/ 3/ 2/

1 mM) 17

Inkubasi 37ºC, 5 menit

Enzim (0,15 U/mL) 17 Natrium karbonat 267 mM 100

Inkubasi 37ºC, 15 menit

Natrium karbonat 267 Mm 100 Enzim (0,15 U/mL) 17

Ukur absorbansi p-nitrofenol yang terbentuk pada 405 nm

Perhitungan Aktivitas Enzim

Unit/ml enzim : ( 2 )

Unit/mg enzim = Unit/mL enzim x (1/c) ( 3 ) Keterangan :

V = Volume total (mL) Ve = Volume enzim (mL) df = faktor pengenceran t = Waktu inkubasi (menit)

18.1 = Ekstinsi milimolar p-Nitrophenol pada 400 nm C = Banyaknya α-glukosidase dalam larutan (mg/mL)

Definisi Unit: (Sigma, 1996)

Satu unit akan melepaskan 1,0 μmol D-glukosa dari p-nitrofenil-α-D-glukosida per menit pada pH 6,8 dan suhu 37oC.

Penentuan Penghambatan Aktivitas α-Glukosidase

Pengujian blanko dilakukan dengan cara sebanyak 30 μL larutan dimetil sulfoksida 2% dalam dapar fosfat pH 6,8 ditambah dengan 36 μL dapar fosfat pH 6,8 dan 17 μL p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida (PNPG) 5 mM, diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37ºC. Kemudian ditambahkan 17 μL larutan enzim 0,15 U/mL, dan diinkubasi kembali selama 15 menit pada suhu 37ºC. Setelah masa inkubasi selesai, ditambahkan 100 μL natrium karbonat 267 mM. Larutan diukur absorbansinya dengan microplate reader pada 405 nm. Pengujian dilakukan sebanyak dua kali (duplo).

Pengujian kontrol blanko dilakukan dengan cara sebanyak 30 μL larutan dimetil sulfoksida 2% dalam dapar fosfat pH 6,8 ditambah dengan 36 μL dapar fosfat pH 6,8 dan 17 μL p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida (PNPG) 5 mM, diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37ºC. Setelah itu, ditambahkan 100 μL 267 mM natrium karbonat dan diinkubasi kembali selama 15 menit pada suhu 37ºC. Setelah masa inkubasi selesai, ditambahkan 17 μL larutan

(10)

enzim 0,15 U/mL. Larutan diukur absorbansinya dengan microplate reader pada 405 nm. Pengujian dilakukan sebanyak dua kali (duplo).

Pengujian standar dilkukan dengan cara sebanyak 30 μL larutan standar (akarbose) ditambah dengan 36 μL dapar fosfat pH 6,8 dan 17 μL p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida (PNPG) 5 mM, diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37ºC. Kemudian ditambahkan 100 μL 267 mM natrium karbonat dan diinkubasi kembali selama 15 menit pada suhu 37ºC. Setelah masa inkubasi selesai, ditambahkan 17 μL larutan enzim. Larutan diukur absorbansinya dengan microplate reader pada 405 nm. Pengujian dilakukan sebanyak dua kali (duplo). Prosedur yang sama dilakukan untuk kontrol, hanya perbedaanya setelah diinkubasi pada suhu 37oC selama 15 menit, ditambahkan 100 μL natrium karbonat200 mM. Larutan diukur absorbansinya dengan microplate reader pada λ 405 nm. Cara pengujian terhadap penghambatan aktivitas -glukosidase dapat dilihat pada Tabel 2.

Persen inhibisi α-glukosidase dapat dihitung dengan rumus (Gholamhoseinian, et al.,

2008): (4)

IC50 dapat dihitung dengan menggunakan persamaan regresi linear, konsentrasi sampel sebagai sumbu x dan % inhibisi sebagai sumbu y. Dari persamaan: y = a + bx dapat dihitung nilai IC50 dengan menggunakan rumus :

(5) Tabel 2. Prosedur uji penghambatan aktivitas α-glukosidase dengan volume total

masing-masing 200 µL

Keterangan : B1= Blanko,

B0= Kontrol Blanko,

S1= Sampel dan Standar (akarbose), S0= Kontrol Sampel dan Kontrol Standar (akarbose)

Reagen Volume (µL)

B1 B0 S1 S0

Sampel / standar - - 30 30

DMSO 2% dalam dapar fosfat (pH 6,8) 30 30 - -

Dapar fosfat pH 6,8 36 36 36 36

PNPG (5 mM) 17 17 17 17

Inkubasi pada 37ºC, 5 menit

Enzim (0,15 U/mL) 17 - 17 -

Inkubasi pada 37ºC, 15 menit

Natrium karbonat 267 mM 100 - 100 -

(11)

11 Universitas Indonesia Penentuan Kinetika Inhibisi Enzim

Penentuan kinetika penghambatan enzim dilakukan pada fraksi yang memiliki aktivitas inhibisi terkuat (IC50 terkecil), yaitu metanol. Prosedur penentuan kinetika penghambatan enzim dapat dilihat pada Tabel 3.

Tabel 3. Prosedur penentuan kinetika penghambatan enzim dengan volume total masing- masing 200 µL

Reagen Volume (µL)

Tanpa Inhibitor Dengan Inhibitor

Ekstrak/Standar - 30

DMSO 6% dalam dapar fosfat (pH 6,8) 30 -

Dapar fosfat (pH 6,8) 36 36

PNPG (5; 4; 3; 2; dan 1 mM) 17 17

Inkubasi pada 37ºC selama 5 menit

Enzim (0,15 U/mL) 17 17

Inkubasi pada 37ºC selama 15 menit

Natrium karbonat 267 mM 100 100

Ukur absorbansi p-nitrofenol yang terbentuk pada 405 nm

Identifikasi Golongan Senyawa Kimia

Ekstrak teraktif dan fraksi teraktif dari hasil fraksinasi menggunakan kromatografi kolom dipercepat dilakukan identifikasi komponen-komponen yang terkandung didalamnya. Identifikasi dilakukan dengan dua metode yaitu dengan reaksi warna dan KLT.

Metode KLT dilakukan dengan menyiapkan larutan uji terlebih dahulu yaitu dengan melarutkan 10 mg ekstrak metanol dengan 5 ml metanol dan 10 mg fraksi gabungan ke-8 dengan 5 ml metanol. Selanjutnya, larutan tersebut digunakan untuk identifikasi golongan senyawa kimia lebih lanjut.

HASIL DAN PEMBAHASAN Penyiapan Bahan Uji

Simplisia daun Antidesma neurocarpum Miq. dipilih karena merupakan salah satu simplisia yang memiliki aktivitas tinggi dalam menghambat aktivitas α-glukosidase dengan IC50 sebesar 2,18 µg/mL (Elya, et al., 2012). Cara ekstraksi yang digunakan adalah dengan maserasi bertingkat dengan pelarut n-heksan, etil asetat dan metanol.

(12)

12 Universitas Indonesia Uji Pendahuluan Aktivitas α-Glukosidase

Optimasi Aktivitas -glukosidase dengan Variasi Konsentrasi PNPG

α-Glukosidase yang digunakan berasal dari Saccharomyces cereviceae recombinant. Grafik optimasi substrat dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2. Grafik Optimasi Aktivitas Enzim dengan Variasi Konsentrasi Substrat Pada hasil uji pendahuluan , dipilih konsentrasi substrat optimum sebesar 5 mM. Pada konsentrasi 5 mM, substrat relatif stabil pada setiap kali pengujian penentuan optimasi substrat. Peningkatan substrat menjadi 6 mM menghasilkan serapan yang melonjak tinggi, dikarenakan substrat menggeser produk inhibitor yang menduduki sisi aktif enzim sehingga dihasilkan kembali produk yang lebih banyak.

Uji Penghambatan Aktivitas α-Glukosidase

Uji penghambatan aktivitas α-glukosidase dilakukan dengan menggunakan microplate reader. Microplate reader dipilih karena pengukuran enzimatis dapat berlangsung dengan cepat, dapat mengukur lebih dari satu sampel dalam waktu yang bersamaan serta jumlah sampel dan pereaksi yang digunakan jumlahnya lebih sedikit (dalam µL).

Aktivitas enzim dilakukan dengan membandingkan nilai absorbansi sampel dengan blanko. Aktivitas -glukosidase yang digunakan dalam uji pendahuluan ini adalah 0,15 U/mL. Proses inkubasi yang terdiri dari dua tahap yaitu tahap pertama dimana waktu inkubasi adalah 5 menit bertujuan untuk memberikan waktu bagi larutan uji untuk mencapai suhu 37ºC, sedangkan tahap kedua yaitu inkubasi selama 30 menit adalah untuk reaksi enzimatis.

Uji Penghambatan Aktivitas -glukosidase pada Akarbose

(13)

merupakan obat yang telah umum digunakan dalam pengobatan klinis. Hasil uji penghambatan aktivitas -glukosidase terhadap akarbose dengan metode microplate readers, didapatkan IC50 akarbose (dalam well) sebesar 38,37 μg/mL.

Uji Penghambatan Aktivitas -glukosidase pada Tiga Ekstrak

Hasil pengujian didapatkan bahwa ekstrak metanol merupakan ekstrak yang paling aktif dengan persen inhibisi paling tinggi. Grafik hasil uji penghambatan aktivitas  -glukosidase pada tiga ekstrak dari daun Antidesma neurocarpum Miq. ini dapat dilihat pada Gambar 3.

Gambar 3. Diagram Batang Uji Penghambatan Aktivitas -gukosidase Ekstrak

Pada ekstrak n-heksan, hasil minus pada persen inhibisinya dapat terjadi karena larutan uji pada ekstrak n-heksan tidak larut sempurna meskipun telah ditambahkan DMSO hingga lebih dari 50%. Penambahan DMSO sebagai kosolven diharapkan mampu meningkatkan kelarutan. Pada awal penambahan DMSO, ekstrak n-heksan terlihat larut, namun ketika ditambahkan larutan dapar fosfat, larutan ekstrak n-heksan ini terlihat ada endapan dan ekstrak kental yang masih menggumpal. Ekstak n-heksan yang tidak dapat larut sempurna ini tidak dapat diuji penghambatan aktivitas -glukosidasenya.

Fraksinasi Ekstrak Metanol

Fraksinasi dilakukan hanya pada ekstrak metanol (persen inhibisi tertinggi). Metode kromatogfrafi kolom dipercepat dipilih karena metode ini dinilai lebih efisien dan hemat pelarut. Hasil fraksinasi didapatkan sebanyak 142 fraksi.

(14)

14 Universitas Indonesia Pengelompokkan Fraksi dengan Metode KLT

Sebanyak 142 fraksi hasil kromatografi kolom dipercepat dibiarkan menguap. Fraksi yang telah kering selanjutnya dilakukan pengelompokkan dengan metode KLT. Pada proses ini, masing-masing fraksi yang dilihat pola kromatogramnya terlebih dahulu dilarutkan dengan sedikit metanol dan ditotolkan pada plat KLT. Fase gerak yang digunakan adalah n-heksan, etil asetat dan metanol dengan berbagai perbandingan konsentrasi. Setelah dilakukan penggabungan fraksi, ternyata diperoleh 15 fraksi gabungan akhir.

Uji Penghambatan Aktivitas α-Glukosidase Pada Fraksi Gabungan

Sebanyak 15 fraksi gabungan ditimbang dan kemudian dipilih yang bobot fraksi keringnya lebih dari 200 mg (8 fraksi gabungan). Uji penghambatan aktivitas -glukosidase kemudian dilakukan pada kedelapan fraksi gabungan tersebut dengan cara yang sama pada tiga ekstrak (metanol, etil asetat, dan n-heksan).

Berdasarkan hasil uji pada delapan fraksi gabungan yang diuji, fraksi gabungan ke-8 adalah fraksi gabungan teraktif dengan IC50 sebesar 40,77. Pada beberapa fraksi gabungan yang diuji penghambatan aktivitas -glukosidasenya, didapatkan persen inhibisi yang lebih dari 100%. Persen inhibisi yang terlalu tinggi ini disebabkan karena larutan uji yang digunakan terlalu pekat. Konsentrasi yang digunakan sebaiknya diturunkan sehingga persen inhibisi yang didapat tidak melebihi 100%.

Penentuan Kinetika Penghambatan Aktivitas α-Glukosidase dari Fraksi Teraktif

Kinetika enzim dilakukan untuk mengetahui jenis inhibisi sampel terhadap enzim. Untuk menganalisis kinetika enzim, dapat digunakan plot Lineweaver-Burk, dimana sumbu x adalah satu per konsentrasi substrat (1/S) sedangkan sumbu y adalah satu per kecepatan reaksi enzim (1/V). Kinetika enzim dapat diketahui dengan melihat aktivitasnya terhadap kenaikan konsentrasi substrat, dimana konsentrasi yang digunakan adalah 0,085; 0,17; 0,255; 0,34; dan 0,425 mM.

Penghambat yang dipilih adalah fraksi gabungan ke-8 karena merupakan fraksi yang paling aktif dibandingkan fraksi uji yang lain. Konsentrasi fraksi gabungan ke-8 yang digunakan adalah 410,4 ppm.

(15)

15 Universitas Indonesia Gambar 4. Hasil Plot Kurva Lineweaver – Burk pada Fraksi gabungan ke-8

Hasil uji kinetika penghambatan enzim menunjukkan bahwa fraksi gabungan ke-8 dari Antidesma neurocarpum Miq. memiliki tipe penghambatan kompetitif. Hasil perhitungan tetapan Michaelis-Menten Fraksi Gabungan ke-8 dengan Konsentrasi 410,4 µg/mL yang digunakan sebagai data grafik gambar 4 dapat dilihat pada Tabel 4.

Tabel 4. Hasil Perhitungan Tetapan Michaelis-Menten Fraksi Gabungan ke-8

A B Vmax Km

Tanpa inhibitor 1,108 0,184 0,90 0,17 Inhibitor 74,7

µg/mL

0,0411 0,1093 24,33 2,66

Identifikasi Golongan Kimia

Hasil identifikasi kandungan kimia ekstrak metanol dan fraksi gabungan ke-8 daun Antidesma neurocarpum Miq. mengandung alkaloid, tanin, fenol, flavanoid, dan glikosida. Tabel hasil identifikasi golongan kimia pada ekstrak metanol dan fraksi ke-8 dari daun Antidesma neurocarpum Miq. dapat dilihat pada Tabel 4.2.

Tabel 5. Hasil Identifikasi Golongan Kimia dari Ekstrak metanol dan Fraksi Gabungan ke-8 daun

Antidesma neurocarpum Miq.

G o l o n g a n S e n y a w a K i m i a E k s t r a k m e t a n o l d a n F r a k s i g a b u n g a n k e - 8 A l k a l o i d + T a n i n + F e n o l + F l a v a n o i d + G l i k o s i d a + S t e r o l / T e r p e n -

(16)

16 Universitas Indonesia KESIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian, diperoleh hasil sebagai berikut :

a. Uji penghambatan aktivitas α-glukosidase dari ketiga ekstrak (metanol, etil asetat dan n-heksan) diperoleh hasil bahwa ekstrak metanol merupakan ekstrak yang paling aktif dengan persen inhibisi paling tinggi (89,53%), dibandingkan dengan fraksi etil asetat dan n-heksan.

b. Uji penghambatan aktivitas -glukosidase terhadap lima belas fraksi gabungan hasil fraksinasi kromatografi kolom dipercepat diperoleh hasil bahwa fraksi gabungan ke-8 adalah fraksi yang paling aktif dengan IC50 sebesar 40,77.

c. Hasil identifikasi ekstrak teraktif (metanol) yang didapat dengan metode maserasi bertingkat dan fraksi gabungan teraktif (fraksi ke-8) hasil fraksinasi dengan metode kromatografi kolom dipercepat menunjukkan adanya golongan senyawa flavonoid, tanin, glikosida, fenol dan alkaloid.

SARAN

Untuk mendukung data penelitian ini, hendaknya dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai pemurnian dan karakterisasi senyawa isolat dari daun Antidesma neurocarpum Miq. Selain itu perlu dilakukan penelitian secara in vivo menggunakan hewan coba untuk mendukung perkembangan obat alam terhadap penyakit diabetes melitus.

KEPUSTAKAAN

Chisholm-Burns, M. A., Wells, B. G., Schwinghammer, T. L., Malone, P. M., Kolesar, J. M., Rotschafer, J. C., et al. (2008). Pharmacotherapy Principles and Practice. New York: McGraw-Hill .

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (1979). Farmakope Indonesia edisi III. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (1995a). Farmakope Indonesia edisi IV. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (1995b). Materia Medika Indonesia Jilid VI. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (2000). Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia.

Dewi, R. (2013). Faktor Risiko Perilaku yang Berhubungan dengan Kadar Gula Darah pada Penderita Diabetes Melitus Tipe 2 di RSUD Kabupaten Karanganyar . Jurnal Kesehatan Masyarakat 2013, Volume 2, Nomor 1.

Dewi, R., Iskandar, Y., Hanafi, M., Kardono, L., Angelina, M., Dewijanti, I., et al. (2007). Inhibitory Effect of Koji Aspergillus terreus on alfa-Glucosidase Activity and

(17)

Postprandial Hyperglycemia. Pakistan Journal of Biological Science, 10, 18 , 3131-3135.

DiPiro, et al., (2005). Pharmacotherapy: A Pathophysiologic Approach (8th ed.). New York: McGraw-Hill.

Dong, L., dan Ni, J. m. (2008). Preliminary study of an α-glucosidase inhibitor from the roots and stems of Polygonatum sibiricum Red. Asian Journal of Traditional Medicines, 3 ( 5 ) , 179-185.

Elya, et al., (2012). Screening of α-glucosidase inhibitory activity from some plants of apocynaceae, clusiaceae, euphorbiaceae,and rubiaceae. Journal of Biomedicine and Biotechnology .

Gao, et. al. (2004). Hepatoprotective activity of Terminalia catappa L. leaves and its two triterpenoids. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 1449-1455.

Gao,et al., (2010). Constituents from the testas of Castanea mollissima Blume with a-glucosidase inhibitory activity. Journal of Asian Natural Products Research , 144-14 Guo, L.-P., Jiang, T.-F., Lv, Z.-H., dan Wang, Y.-H. (2010). Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis, 53 , 1250–1253.

Harborne, JB. (1987). Metode fitokimia: penuntun cara modern menganalisis tumbuhan (Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro, Penerjemah). Bandung: Institut Teknologi Bandung.

Harmita. (2006). Buku Ajar Analisis Fisikokimia. Depok : Departemen Farmasi FMIPA UI, 205-211.

Harvey, R. A., dan Ferrier, D. R. (2010). Lippincott’s Illustrated Reviews : Biochemistry (5th ed.). Philadelpia: Lippincott Williams & Wilkins.

Liu ZM, Chen Y, Suzanne C Ho, Ho YP, Woo J. Effect of soy protein and isoflavones on glycemic control and insulin sensitivity: a 6-mo double-blind, Randomized Placebbo Controlled Trial in Postmenopausal Chinese Women with Prediabetes orn Untreated Early Diabeteds. Am J Clin Nutr 2010;91:1394-40

LIPI. (2009).Pengobatan Alternatif dengan Tanaman Obat. UPT-Balai Informasi Teknologi LIPI. HYPERLINK "http://www.bit.lipi.go.id/pangan kesehatan/documents/artikel_hipertensi/tanaman_obat.pdf" http://www.bit.lipi.go.id/pangan-kesehatan/documents/artikel_hipertensi/tanaman_obat.pdf , 21 Januari 2012, pk. 17.00.

McPherson, R., dan Pincus, M. (2011). Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods (22nd ed.). Philadelphia: Elsevier.

Murray, et al., (2009). Harper's Illustrated Biochemistry (28th ed.). New York: McGraw-Hill.

Sari, L.O.R.K. (2006). Pemanfaatan obat tradisonal dengan pertimbangan manfaat dan keamanannya, majalah ilmu kefarmasian, 3(1), 1-7.

Seager, L.S., Slaubaugh, M.R. (2008). Organic and biochemistry for today. Thomson Learning: USA.

Sinaga, E. Dan Wirawanni, Y. (2012). Pengaruh Pemberian Susu Kedelai terhadap Kadar Glukosa Darah Puasa pada Wanita Prediabetes. Journal of Nutrition College, Volume I, Nomor I, Tahun 2012, Halaman 563-579.

Wilson, K., dan Walker, J. (2010). Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology (7th ed.). New York: Cambridge University Press.