Efek Sitoprotektif Daun Bangun-bangun (Coleus amboinicus Lour) terhadap Sel Vero yang Diinduksi dengan Hidrogen Peroksida (H2O2)

(1)

TESIS

EFEK SITOPROTEKTIF DAUN BANGUN-BANGUN (

Coleus

amboinicus

_{Lour) TERHADAP SEL VERO YANG DIINDUKSI}

DENGAN HIDROGEN PEROKSIDA (H

2

O

2

)

OLEH:

RENY HARYANI

NIM 147014021

PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

(2)

EFEK SITOPROTEKTIF DAUN BANGUN-BANGUN (

Coleus

amboinicus

_{Lour) TERHADAP SEL VERO YANG DIINDUKSI}

DENGAN HIDROGEN PEROKSIDA (H2O2)

TESIS

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh

gelar Magister Farmasi pada Fakultas Farmasi

Universitas Sumatera Utara

OLEH:

RENY HARYANI

NIM 147014021

PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

(3)

iii

LEMBAR PERSETUJUANTESIS

EFEK SITOPROTEKTIF DAUN BANGUN-BANGUN (

Coleus

amboinicus

_{Lour) TERHADAP SEL VERO YANG DIINDUKSI}

DENGAN HIDROGEN PEROKSIDA (H2O2)

OLEH:

RENY HARYANI

NIM 147014021

Medan, Februari 2017 Menyetujui:

KomisiPembimbing, KomisiPenguji,

Prof. Dr. Urip Harahap, Apt. Prof. Dr. Rosidah, M.Si.,Apt. NIP 195301011983031004 NIP 195103261978022001

Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt. Dr. Poppy Anjelisa Z. Hsb., M.Si., Apt. NIP 195707231986012001 NIP 197506102005012003

Prof. Dr. Urip Harahap, Apt. NIP 195301011983031004

Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt. NIP 195707231986012001

Mengetahui: Disahkan Oleh:

Sekretaris Program Studi, Dekan,

(4)

LEMBAR PENGESAHAN TESIS

Nama Mahasiswa : Reny Haryani

Nomor Induk Mahasiswa : 147014021

Program Studi : Magister Farmasi

Judul Tesis : Efek Sitoprotektif Daun Bangun-bangun (Coleus

amboinicus _{Lour) terhadap Sel Vero yang}

Diinduksi dengan Hidrogen Peroksida (H2O2)

Telah diuji dan dinyatakan LULUS di depan TIM Penguji pada hari Selasa tanggal Tujuh bulan Februari tahun dua ribu tujuh belas.

Mengesahkan: Tim Penguji Tesis

Ketua Tim Penguji Tesis : Prof. Dr. Rosidah, M.Si.,Apt.

Anggota Tim Penguji Tesis : Dr. Poppy Anjelisa Z. Hsb., M.Si., Apt.

(5)

v

SURAT PERNYATAAN

Saya yang bertanda tangan dibawah ini:

Nama Mahasiswa : Reny Haryani Nomor Induk Mahasiswa : 147014021 Program Studi : Magister Farmasi

Judul Tesis : Efek Sitoprotektif Daun Bangun-bangun (Coleus amboinicus Lour) terhadap Sel Vero yang Diinduksi dengan Hidrogen Peroksida (H2O2)

Dengan ini menyatakan bahwa tesis yang saya buat adalah asli karya saya sendiri,

bukan plagiat dan apabila dikemudian hari diketahui tesis saya tersebut plagiat karena kesalahan saya sendiri maka saya bersedia diberi sanksi apapun oleh

Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi USU. Saya tidak akan menuntut pihak manapun atas perbuatan saya tersebut.

Demikianlah surat pernyataan ini saya perbuat dengan sebenarnya dan

dalam keadaan sehat

Medan, Februari 2017

Yang membuat pernyataan,

Reny Haryani

NIM 147014021

(6)

KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa yang telah melimpahkan

rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penuliisan tesis dengan judul “Efek Sitoprotektif Daun Bangun-bangun (Coleus amboinicus Lour) terhadap Sel Vero yang Diinduksi dengan Hidrogen Peroksida

(H2O2) yang merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister

Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.

Selama menyelesaikan penelitian dan tesis ini penulis telah banyak mendapatkan bantuan dan dorongan dari berbagai pihak, baik moril maupun materil. Untuk itu penulis ingin menghaturkan penghargaan dan terima kasih yang

tiada terhingga kepada:

1. Bapak Prof. Dr. Runtung Sitepu, S.H., M.Hum., selaku Rektor Universitas

Sumatera Utara, Medan, yang telah memberikan kesempatan dan fasilitas kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan Program Studi Magister Farmasi pada Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan.

2. Ibu Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan, yang telah menyediakan fasilitas dan kesempatan bagi

penulis menjadi mahasiswa dan menyelesaikan Program Studi Magister Farmasi pada Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan.

3. Ibu Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt., selaku Sekertaris Program Studi Magister

Farmasi pada Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan, yang telah memberikan arahan dan bantuan bagi penulis untuk menyelesaikan

(7)

vii

4. Bapak Prof. Dr. Urip Harahap, Apt., dan Ibu Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt., sebagai Komisi Pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan,

arahan, masukan, saran, dan dorongan dengan penuh kesabaran tulus dan ikhlas bagi penulis dalam menjalani pendidikan, penelitian dan penyelesaian tesis ini.

5. Ibu Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt., dan Ibu Dr. Poppy Anjelisa Z. Hsb, S.Si, M.Si., Apt sebagai Komisi Penguji yang telah banyak memberikan saran dan

masukan bagi penulis dalam penyelesaian tesis ini, sehingga tesis ini semakin baik.

6. Ayahanda H. Hafifuddin, Ibunda Hj. Yusni Ely, S.Ag dan Adinda Rizki

Yuwidarma sebagai keluarga penulis yang banyak memberikan bantuan baik dalam bentuk moril dan materil bagi penulis selama menjalani pendidikan,

penelitian dan penyelesaian tesis ini.

7. Teman-teman seperjuangan di angkatan 2009 Irma Fitri Hasibuan, S.Farm., Apt., Yusda Meindra, S.Farm., Apt., Emmy Hartaty, S.Farm., Apt., Jesaya

Afrianta, S.Farm., Apt., Elisya Fitri Siregar, S.Farm., serta teman-teman seperjuangan mahasiswa Magister Farmasi Diah Ramadhani, M.Si., Apt.,

Safriana, M.Si., Apt., Rialita Lifiani, M.Si., Apt., Yanna Rotua Sihombing, M.Si., Apt., Saru Noliqo Rangkuti, M.Si., Apt., Koko Prananda Tarigan, M.Si., Apt., Eva Diansari Marbun, M.Si., Apt., Dara Fahria Nopa, M.Si., Apt.,Asyrun

Alkhairi Lubis, M.Si., Apt., Denny Satria, M.Si., Apt., Nevi Hayati Utami, S.Farm., dan Hendra Gunawan, S.Farm., serta semua pihak yang tidak dapat

(8)

membantu dalam penelitian tesis ini. Kiranya Tuhan Yang Maha Esa memberikan balasan yang berlipat ganda atas kebaikan dan bantuan yang telah

diberikan kepada penulis.

Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari kesempurnaan sehingga penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun dan semua

pihak. Akhir kata semoga tulisan ini dapat menjadi sumbangan yang berarti bagi ilmu pengetahuan khususnya bagi bidang farmasi.

Medan, Februari 2017 Penulis,

(9)

ix

EFEK SITOPROTEKTIF DAUN BANGUN-BANGUN (

Coleus

amboinicus

_{Lour) TERHADAP SEL VERO YANG DIINDUKSI}

DENGAN HIDROGEN PEROKSIDA (H2O2)

ABSTRAK

Penyakit degeneratif telah menjadi segmentasi permasalahan tersendiri seiring dengan semakin tingginya angka prevalensi di masyarakat. Penyebab penyakit degeneratif salah satunya adalah timbulnya radikal hidroksil dalam dalam tubuh. Stres oksidatif timbul karena terjadi ketidakseimbangan antara produksi radikal bebas atau Reactive oxygen species (ROS) dengan antioksidan, karena kadar radikal bebas lebih tinggi dibandingkan antioksidan. Senyawa yang dapat melindungi sel dari stress oksidatif adalah senyawa yang memiliki aktivitas sitoprotektif. Tujuan penelitian ini adalah untuk menguji efek sitoprotektif tanaman daun Bangun-bangun (Coleus amboinicus Lour) pada sel Vero diinduksi dengan hidrogen peroksida (H2O2).

Daun bangun- bangun yang digunakan diperoleh dari Desa Kubuan, Tanjung Pura, Langkat, Sumatera Utara. Daun Bangun-bangun kemudian diekstrak dengan maserasi bertingkat menggunakan pelarut n-heksana, etilasetat, dan etanol. Pengujian sitoprotektif secara in vitro dengan metode MTT terhadap ekstrak n-heksan daun bangun (ENDBB), ekstrak etil asetat daun bangun-bangun (EEADBB), dan ekstrak etanol daun bangun-bangun-bangun-bangun EEDBB dilakukan pada sel Vero dengan konsentrasi 12,5-200 µg/mL yang diinduksi H2O2 0,8 mM.

Data hasil pengujian dianalisis secara statistik menggunakan ANOVA, dilanjutkan dengan uji Post Hoc Duncan dengan program SPSS versi 17. Ekstrak yang paling aktif dilanjutkan dengan uji apoptosis dengan metode flow sitometri serta ekspresi ROS dengan metode imunositokimia terhadap sel Vero yang diinduksi dengan 0,8 mM H2O2.

Hasil analisis viabilitas sel menunjukkan bahwa nilai viabilitas meningkat dibandingkan dengan nilai viabilitas sel Vero yang diberi H2O2. EEADBB dan

EEDBB pada uji MTT menunjukkan persen viabilitas masing-masing sebesar 74,42±0,28% dan 76,08±0,91 % dengan konsentrasi 50 µg/mL untuk EEADBB dan 100 µg/mL EEDBB. ENDBB tidak menunjukkan hasil yang baik dibandingkan dengan EEADBB dan EEDBB. EEADBB dan EEDBB menurunkan apoptosis pada sel Vero, yang terlihat pada uji apoptosis dengan flow sitometri. Peningkatan jumlah sel hidup terjadi setelah perlakuan dengan EEADBB dan EEDBB sebesar 32,14% dan 49,59% dibandingkan dengan H2O2 sebesar

10,32%. EEADBB dan EEDBB juga mereduksi ROS pada sel Vero yang diinduksi dengan H2O2, yang ditunjukkan pada uji imunositokimia, yaitu

berkurangnya warna coklat pada sel perlakuan dengan EEADBB dan EEDBB dibandingkan dengan sel yang diberi H2O2. Berdasarkan uraian diatas dapat

disimpulkan bahwa EEADBB dan EEDBB mampu sebagai sitoprotektif terhadap sel Vero yang diinduksi 0,8 mM H2O2.

(10)

CYTOPROTECTIVE EFFECTS OF BANGUN-BANGUN

(

Coleus amboinicus

_{Lour) LEAF ON THE VERO CELL}

INDUCED WITH HYDROGEN PEROXIDES (H

2

O

2

)

ABSTRACT

Degenerative disease has become its own problems segmentation along with the high prevalence in the community. One cause of the degenerative disease is the emergence of hydroxyl radicals in the body. Oxidative stress arises due to an imbalance between the production of free radicals or reactive oxygen species (ROS) and antioxidants, because the levels of free radicals is higher than antioxidant. Substances that protect cells from oxidative stress is a compound having cytoprotective activity. The aim of this study was to test the cytoprotective effects of plant leaves Bangun-bangun (Coleus amboinicus Lour) In Vero cells induced by hydrogen peroxide (H2O2).

Leaves of Bangun-bangun used were obtained from Kubuan Village, Tanjung Pura, Langkat, North Sumatra. Bangun-bangun leaf then extracted with terraced maceration using n-hexane, ethyl acetate, and ethanol. Cytoprotective Testing in vitro by MTT method to extract n-hexane leaf shapes (ENDBB), ethyl acetate extract of leaf shapes (EEADBB), and ethanol extract of leaves wake EEDBB performed on Vero cells at concentrations 12,5-200 µg/mL induced H+O2 0.8 mM. The test data were statistically analyzed using ANOVA, followed

by Duncan Post Hoc test with SPSS version 17. The extract was the most active followed by a test of apoptosis by flow cytometry of the method as well as the expression of ROS by the method of immunocytochemistry against Vero cells were induced with 0.8 mM H2O2.

The results of cell viability analysis shows that the viability increased compared to the value of Vero cell viability by H2O2. EEADBB and EEDBB the

MTT test shows the percent viability respectively by 74.42 ± 0.28% and 76.08 ± 0.91% with a concentration of 50 ug / mL for EEADBB and 100 ug / mL EEDBB. ENDBB not show good results compared with EEADBB and EEDBB. EEADBB and EEDBB decrease apoptosis in Vero cells, seen in tests of apoptosis by flow cytometry. Increasing the number of living cells occurs after treatment with EEADBB and EEDBB amounted to 32.14% and 49.59% compared with 10.32% for H2O2. EEADBB and EEDBB also reduces ROS in Vero cells induced by

H2O2, shown in immunocytochemistry test, namely the reduction of brown color

in cells treated with EEADBB and EEDBB compared to cells by H2O2. Based on

the description above can be concluded that EEADBB and EEDBB capable as cytoprotective against Vero cells induced by 0.8 mM H2O2.

(11)

(12)

2.3 Radikal Bebas ... 11

2.3.1 Reactive Oxygen Species (ROS) ... 12

2.3.2 Hidrogen peroksida (H2O2) ... 15

2.4 Antioksidan ... 17

2.5 Peran Antioksidan dalam Menangkal Radikal Bebas ... 19

2.6 Sel Vero ... 22

2.7 Tanaman yang Bersifat Sitoprotektif ... 23

2.7.1 Bangun-bangun ... 26

2.8 Metode Ekstraksi ... 28

2.9 Metode Pengujian Aktivitas Sitoprotektif ... 29

2.9.1 Metode MTT ... 30

2.9.2 Flow sitometri ... 30

2.9.3 Imunositokimia ... 31

BAB III METODE PENELITIAN ... 33

3.1 Alat dan Bahan ... 33

3.1.1 Alat ... 33

3.1.2 Bahan ... 33

3.2 Pengumpulan dan Pengolahan Sampel ... 34

3.2.1 Pengambilan sampel ... 34

3.2.2 Identifikasi tanaman daun Bangun-bangun ... 34

3.2.3 Pembuatan simplisia ... 34

3.3 Pemeriksaan Pemeriksaan Karakteristik Simplisia ... 35

3.3.1 Pemeriksaan makroskopik ... 35

(13)

xiii

3.3.3 Penetapan kadar air ... 35

3.3.4 Penetapan kadar sari larut dalam air ... 36

3.3.5 Penetapan kadar sari larut dalam etanol ... 37

3.3.6 Penetapan kadar abu total ... 37

3.3.7 Penetapan kadar abu tidak larut dalam asam ... 37

3.4 Pembuatan Ekstrak ... 37

3.5 Pembuatan Pereaksi ... 38

3.6 Skrining Fitokimia Simplisia dan Ekstrak ... 39

3.6.1 Pemeriksaan alkaloid ... 39

3.6.2 Pemeriksaan flavonoid ... 40

3.6.3 Pemeriksaan glikosida ... 40

3.6.4 Pemeriksaan saponin ... 41

3.6.5 Pemeriksaan tanin ... 41

3.6.6 Pemeriksaan triterpenoid/steroid ... 41

3.7 Sterilisasi Alat dan Bahan ... 41

(14)

3.12 Pengujian Apoptosis dengan Flow Sitometri ... 46

3.13 Analisis Ekspresi ROS dengan Imunositokimia ... 47

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 49

4.1 Identifikasi Tumbuhan ... 49

4.2 Karakteristik Simplisia ... 49

4.2.1 Pemeriksaan makroskopik ... 49

4.2.2 Pemeriksaan mikroskopik ... 49

4.2.3 Karakterisasi Simplisia ... 50

4.3 Skrining Fitokimia Simplisia dan Ekstrak Daun Bangun-Bangun ... 51

4.4 Aktifitas Sitoprotektif ... 53

4.4.1 Analisis viabilitas sel dengan metode MTT ... 53

4.4.2 Pengujian apoptosis dengan flow sitometri ... 56

4.4.3 Analisis ekspresi ROS dengan imunositokimia ... 63

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 67

5.1 Kesimpulan ... 67

5.2 Saran ... 68

DAFTAR PUSTAKA ... 69

(15)

xv

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

2.1 Metabolit oksigen radikal dan nonradikal ... 12

2.2 Tanaman yang bersifat sitoprotektif... 23

4.1 Hasil karakteristik simplisia daun Bangun-bangun ... 50

4.2 Hasil skrining fitokimia simplisia dan ekstrak ... 51

(16)

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1.1 Diagram kerangka pikir penelitian ... 6

2.1 Kerusakan Akibat Reaktif Oksigen Spesies ... 13

2.2 Produksi ROS selama respirasi sel normal ... 16

2.3 Efek sinergisCAT,GSHPx,danSOD dalamscavenging dari O2•- ... 19

2.4 Skema representasi interaksi flavonoid dengan jalur sinyal sel .... 21

2.5 Reduksi MTT menjadi Formazan ... 30

3.1 Hemositometer... 44

4.1 Hasil analisis viabilitas sel pada masing-masing perlakuan ... 54

4.2 a. Apoptosis sel vero kontrol ... 57

b. Apoptosis sel vero +H2O2 ... 58

c. Apoptosis EEADBB ... 58

d. Apoptosis EEDBB ... 59

4.3 Imunositokimia ekstrak daun Bangun-bangun ... 64

(17)

xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1 Surat Hasil Identifikasi Daun Bangun-bangun ... 79

2 Surat Rekomendasi Persetujuan Etik Penelitian Kesehatan ... 80

3 Gambar Makroskopik Daun Bangun-bangun ... 81

4 Gambar Mikroskopik Serbuk Simplisia Daun Bangun-bangun .. 82

5 Bagan Pembuatan Ekstrak Daun Bangun-bangun ... 83

6 Bagan Alur Penelitian ... 84

7 Perhitungan Karakterisasi Simplisia Daun Bangun-bangun ... 85

8 Perhitungan Konsentrasi Larutan Uji ... 89

9 Perhitungan Pengenceran H2O2... 90

10 Hasil Analisis SPSS Viabilitas Sel ... 91

11 Laminar Air Flow Class II, ELISA Reader ... 95