ISOLASI PLASMID MENGGUNAKAN METODE SOL
PARNI ASTUTI P051160281
PROGRAM MULTIDISPLIN BIOTEKNOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Setiap organisme memiliki DNA yang terletak dalam inti sel atau nukleus yang disebut sebagai DNA kromosomal, begitu pula bakteri. Selain DNA kromosomal, bakteri juga memiliki DNA ekstrakromosomal. Plasmid merupakan DNA ekstrakromosomal yang berbeda karakternya dengan DNA kromosomal. Bentuk plasmid adalah sirkuler double helix dengan ukuran dan berat sekitar 1-300 kb (Snustad dan Simmons, 2003). Pada bakteri jumlah plasmid yang dimiliki bervariasi bahkan sampai ribuan ataupun tidak memiliki plasmid. Plasmid bisa saja tidak terdapat pada bakteri yang biasa saja karena plasmid tidak mempengaruhi ketahanan hidup bakteri tersebut. Plasmid hanya memberikan sifat istimewa yang dimiliki oleh bakteri tersebut misalnya resistensi terhadap antibiotik. Beberapa karakteristik dari plasmid yang patut diketahui antara lain: dapat bereplikasi secara terpisah dari DNA kromosomal, dapat ditransfer ke bakteri lain, dan memiliki ORI (Origin of replication) (Hayati dan Fajri, 2010).
Isolasi merupakan proses yang sangat penting dalam genetika molekuler dan merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam rekayasa genetika. Dalam genetika molekuler, isolasi umumnya dilakukan pada plasmid. Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid banyak sekali digunakan dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya (Suharsono, 2006).
Keberhasilan tahapan isolasi bergantung pada sumber dan konsentrasi bahan, stabilitas, dan kadar kemurnian produk akhir. Isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu tahap kultivasi dan pemanenan atau harvesting, tahap lisis dan tahap pemurnian DNA plasmid. Kultivasi yaitu proses reproduksi bakteri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. Perusakan (lisis) dinding sel bakteri dapat dilakukan dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku leleh maupun dengan cara kimiawi menggunakan larutan lisis. Plasmid yang diperoleh dimurnikan dari berbagai kontaminan dengan penambahan fenol (Brown, 2003).
dahulu. Ada berbagai macam kegunaan dari plasmid, dalam rekayasa genetika, plasmid digunakan sebagai vektor untuk kloning DNA. Alasan utama pengunaan plasmid ini adalah karena plasmid memiliki peta restriksi, adanya marker sehingga dapat diketahui apakah gen insert masuk atau tidak, memiliki copy number yang besar, dan mudah dimodifikasi sesuai dengan tujuan tertentu (Lodish et. al. 2004).
Tujuan
Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga semua organel sel dapat keluar dan didapatkan DNA ekstrakromosomal (plasmid). Secara umum, isolasi plasmid bertujuan mengekstrak plasmid dan memisahkannya dari berbagai komponen selular bakteri lainnya, seperti protein, lemak, RNA, dan DNA kromosomal.
METODE
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam isolasi metode sol adalah sentrifuge, vortex, tube, mikro tube, pipet tip, mikropipet, microwave, piranti elektroforesis, vacuum dryer, stirrer, dan freezer. Bahan yang digunakan adalah kultur Escherichia coli 1,5 mL,100 µL sol I (SDS dan NaOH), 200 µL sol II, 150 µL sol III, 1 x volume supernatan larutan PCI (asam organik Phenol Chloroform Isoamilalkohol), EtOH 100%, EtOH 70%, 20 µL – 50 µL ddH2O, dan enzim RNAse. Pada elektroforesis gel digunakan
agarose (komposisi 0,4 gr agarose dan TAE 40 mL), loading dye, ethidium bromide, dan marker lamda 1 µL dan 3 µL.
Metode Pelaksanaan Isolasi Plasmid
37ºC selama 10 menit dan disimpan dalam freezer overnight serta dilakukan uji kualitas DNA.
Uji Kualitas DNA
Gel agarosa 1 % dibuat dengan cara melarutkan 0,4 gr serbuk agarosa dengan 40 mL bufer TAE 1x. Campuran dipanaskan dalam microwave agar larut sempurna. Campuran kemudian dikocok perlahan dan dituang ke dalam cetakan gel yang telah disiapkan sesuai dengan jumlah sampel. Gel dibiarkan memadat kurang lebih 30 menit. Gel yang sudah memadat diletakkan ke dalam chamber elektroforesis dan direndam dalam bufer TAE 1x hingga setinggi 1-2 mm di atas gel. Larutan stok sampel DNA yang sudah diencerkan diambil sebanyak 5 μL dan dicampurkan dengan 1 μL loading dye. Campuran sampel dan loading dye dimasukkan ke dalam sumur gel dan perangkat disambungkan pada power supply. Elektroforesis dilakukan selama 30 menit. Gel agarosa kemudian direndam dalam larutan ethidium bromida. Hasil elektroforesis divisualisasikan dengan gel documentation untuk difoto dan dibandingkan fragmen DNA yang terlihat.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi Plasmid Escherichia coli
Isolasi plasmid adalah salah satu aktivitas yang rutin dilakukan di laboratorium-laboratorium biologi molekular yang melakukan aktivitas pengklonan gen. Salah satu metode yang banyak digunakan dalam isolasi plasmid saat ini adalah metode alkaline lysis. Metode ini pertama kali dipublikasikan oleh Birnboim dan Dolly tahun 1979 (Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523) (Davis, 2010). Metode isolasi alkaline lysis bersandar pada sifat DNA plasmid yang berukuran kecil dan berbentuk sirkular. Metode alkaline lysis secara garis besar terbagi ke dalam enam tahap, yakni tahap kultivasi bakteri dan pemanenan sel, tahap resuspensi sel, tahap lisis sel dan denaturasi DNA, tahap netralisasi, tahap purifikasi, dan tahap pemekatan DNA.
Prosedur isolasi diawali dengan kultivasi bakteri yang mengandung plasmid yang akan diisolasi. Tahap kedua adalah resuspensi sel dalam larutan yang mengandung Tris-EDTA dan glukosa. Larutan ini umumnya dikenal sebagai larutan atau solution I. EDTA (ethilendiamin tetraasetat) dalam larutan I berfungsi mengkhelat (mengikat) kation-kation divalen seperti Mg2+ dan Ca2+. Kedua ion ini
berfungsi sebagai kofaktor yang esensial bagi aktivitas Dnase dalam mencacah molekul DNA. Selain itu, ion Mg dan Ca diketahui berperan penting dalam memelihara integritas dan kestabilan membran plasma bakteri sehingga kerja EDTA juga berfungsi membantu destabilisasi membran. Glukosa berfungsi menjaga tekanan osmotik sel agar tidak pecah. Keutuhan sel pada tahap ini penting untuk tetap terpelihara, Dnase yang ada di dalam sel tidak bertemu dengan DNA plasmid yang akan diisolasi. Menurut (Davis, 2012), Penelitian Qiagen menyimpulkan tanpa glukosa pun, metode alkalin lisis dapat bekerja dengan baik dalam mengisolasi plasmid.
deterjen anionik, yang ketika dilarutkan dalam air akan berdisosiasi menjadi ion Na dan dan dodesil sulfat. Dodesil sulfat adalah molekul deterjen berantai hidrofobik panjang dengan gugus sulfat bermuatan negatif pada salah satu ujungnya. Dodesil sulfat akan berikatan dengan bagian interior lipid bilayer pada membran sehingga mengakibatkan lisis sel. Komponen selular bakteri termasuk DNA dan RNA akan keluar dan larut dalam. Ion deterjen dodesil sulfat juga mendenaturasi protein yang ada dalam lisat, dengan jalan memutuskan ikatan-katan non kovalen (terutama ikatan hidrogen) pada protein, sehingga kembali ke struktur primernya, sebagai rantai linier polipeptida. Hal ini membuat protein-protein enzim kehilangan aktivitas enzimatiknya , termasuk enzim Dnase yang dikhawatirkan merusak DNA plasmid. Pada tahap ini larutan akan berisi asam nukleat (DNA dan RNA) dan debris sel yang terdapat dalam kompleks dodesil sulfat-lipid-protein. Sementara itu, NaOH yang bersifat basa membuat seluruh molekul DNA berutas ganda baik DNA kromosomal maupun plasmid mengalami denaturasi menjadi utas-utas tunggal. Itulah mengapa metode ini disebut sebagai metode lisis basa (alkaline lysis). Pada tahapan ini, DNA kromosomal terpisah sempurna menjadi utas-utas tunggal terpisah; sedangkan utas tunggal plasmid yang berbentuk lingkaran tetap terhubung, seperti dua cincin yang saling bertautan. Karakter ukuran dan struktur kedua jenis DNA inilah yang menjadi dasar pemisahan DNA plasmid dari DNA kromosomal.
Tahap keempat adalah adalah penambahan sol III (netralisasi). Sol III adalah sodium asetat pH ~5,5. Ion K+ bebas yang berasal dari potasium asetat pada larutan
III akan menetralkan muatan negatif dari kompleks kompleks dodesil sulfat-lipid-protein terdenaturasi, membentuk potasium dodesil sulfat (KDS) yang tidak larut dan terpresipitasi bersama lipid membran dan protein yang terdenaturasi. Laju presipitasi KDS dapat ditingkatkan dengan inkubasi pada suhu es (4oC).
Sol III adalah sodium asetat yang diatur pHnya ke 5,5 menggunakan asam asetat. Asam asetat berfungsi menetralkan suasana basa yang diciptakan oleh ion hidroksida dari NaOH yang diberikan pada tahap lisis sebelumnya. Ketika pH larutan kembali netral, ikatan-ikatan hidrogen antar basa utas tunggal DNA terbentuk kembali, sehingga molekul tersebut dapat berenaturasi menjadi DNA berutas ganda. Proses renaturasi inilah yang menjadi tahap seleksi bagi plasmid. Utas-utas tunggal sirkular DNA plasmid yang yang berukuran kecil dan tetap saling bertautan dapat berenaturasi sempurna membentuk utas ganda yang tetap berada dalam larutan; sedangkan DNA kromosomal yang berukuran jauh lebih besar dari plasmid tidak dapat berenaturasi sempurna, membentuk struktur kusut tak beraturan yang terperangkap dan ikut terpresipitasi bersama kompleks KDS-lipid-protein. Oleh karena itu, pencampuran pada tahap lisis sel harus dilakukan dengan perlahan. Pengocokan yang kuat (misalnya vortex) akan mengakibatkan molekul DNA kromosom akan terpotong menjadi fragmen-fragmen yang kecil yang dapat ikut berenaturasi seperti halnya DNA plasmid, dan mengkontaminasi DNA plasmid.
protein yang tersisa. Dengan penambahan PCI maka terbenntuk 3 fase yaitu yang pertama fase aquos adalah fase air yang paling atas, pada fase ini masih ada plasmid tetapi sudah terpurifikasi. Fase putih yang berada di tengah yaitu berisi protein yang terdenaturasi, kemudian fase PCI yang berada paling bawah.
Jumlah fenol-kloroform yang ditambahkan umumnya satu kali volume larutan yang akan dipurifikasi. Umumnya fenol-kloroform disiapkan dalam bentuk campuran fenol-kloroform-isoamil alkohol dengan perbandingan volume 25:24:1. Campuran fenol-kloroform adalah campuran yang homogen. Fenol-kloroform dan air tidak dapat bersatu sehingga akan terbentuk dua fase yakni fase air (fase aqueous) dan fase fenol-kloroform. Fenol-kloroform lebih ‘berat’ daripada air sehingga fasenya berada di bawah fase air. Kedua fase kemudian dicampur dengan cara vorteks. Pencampuran akan membuat fenol merangsek ke dalam lapisan air dan membentuk emulsi droplet. Protein akan terdenaturasi dan terperangkap dalam fase fenol-kloroform, sedangkan DNA tetap berada di air. Kedua fase kemudian dapat dipisahkan dengan baik dengan sentrifugasi. Fase atas yang berisi DNA akan dapat dengan mudah diambil dengan pemipetan, dan fase fenol-kloroform dapat dibuang.
Tahap keenam adalah pemekatan DNA yang bertujuan untuk memisahkan DNA dari larutan sehingga diperoleh konsentrasi yang lebih tinggi umumnya menggunakan presipitasi etanol. Fase aquos diambil kemudian dilakukan presipitasi alkohol dengan menambahkan etanol absolut untuk memisahkan DNA dari larutan sehingga di dapat DNA dalam bentuk solid (pelet). Pelet tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan etanol 70% dan disentrifugasi. Kemudian pelet dikeringkan dan setelah itu dilarutkan kembali ke dalam air (ddH2O) dan
ditambahkan RNAse untuk menghilangkan sisa-sisa RNA dan mendapatkan DNA yang murni dan disimpan dalam freezer overnight.
Elektroforesis Gel
marker λ 1 ng, marker λ 3 ng, sampel kelompok 1 sampai 8).
Gambar diatas menunjukkan hasil running dari plasmid-plasmid yang telah di isolasi. Terlihat pada gambar di atas plasmid yang berhasil migrasi hanya pada sumur ke 3, 4, 7, dan 10. Hal ini membuktikan jika plasmid berhasil di isolasi dikarenakan terdapat pergerakan pita. Namun demikian terdapat smear pada pita tersebut yang menunjukkan bahwa DNA yang diperoleh belum murni atau masih terdapat zat-zat lain yang ikut tercampur. Smear terbentuk akibat degradasi DNA menjadi potongan-potongan pendek. Hal ini dapat terjadi karena perlakuan DNA selama isolasi. Smear juga dapat disebabkan oleh volume DNA yang terlalu banyak saat elektroforesis atau penggunaan tegangan yang terlalu besar (Ausubel, 1990). Fragmen DNA yang tipis pada gel agarosa dapat disebabkan oleh beberapa hal seperti rendahnya konsentrasi DNA.
KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA
Ausubel FM. 1990. Current Protocols in Molecular Biology. Kanada (CA): John Willey & Sons.
Brown TA. 2003. Pengantar Kloning Gen. Muhammad SA, penerjemah. Terjemahan dari: Gene Cloning an Introduction.Yogyakarta (ID): Yayasan Essentia Medika.
Davis, M. 2010. [Internet]. Isolasi DNA plasmid metode alkaline lysis prinsip dasar dan tips _ muchdar davis's blog.htm. [Diunduh tanggal 10 November 2016]. Hayati dan Fajri. 2010. [Internet].
http://ekor07.student.ipb.ac.id/2010/06/20/isolasi-plasmid-elekroforesis-kuantifikasi-dna/. [Diunduh 9 November 2016].
Lodish H, Arnold B, Lawrence Z, Paul M, David B, James D. 2000. Molecular Cell Biology. New York: Wh. Freeman Company.
Snustad DP & MJ Simmons. 2003. Principles of Genetic. Hoboken (US): Wiley & Sons Inc.
Stansfield WD, Colome JS, Cano RJ. 2003. Theory and Problems of Molecular and Cell Biology. New York: McGraw-Hill Companies.
Suharsono WU. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Bogor (ID): Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi IPB.
