KARAKTERISASI BIOKIMIA DAN UJI AKTIVITAS PROTEASE Bacillus thuringiensis DARI TANAH NAUNGAN DI LINGKUNGAN UNIVERSITAS LAMPUNG

ABSTRAK

KARAKTERISASI BIOKIMIA DAN UJI AKTIVITAS PROTEASE Bacillus thuringiensis DARI TANAH NAUNGAN DI LINGKUNGAN

UNIVERSITAS LAMPUNG

Oleh

SITI NUR EKA RACHMAWATI

Bacillus thuringiensis (Bt) merupakan bakteri yang digunakan sebagai bioinsektisida. Perbedaan karakter Bt dipengaruhi oleh faktor biotik dan abiotik. Faktor biotik meliputi gen, sifat fisiologis, biokimia, serta enzimatis. Faktor abiotik diantaranya suhu, pH, dan komposisi substrat di lingkungan. Tanah naungan merupakan faktor abiotik bagi Bt. Tanah naungan yang berbeda berpengaruh terhadap keanekaragaman Bt. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui karakter biokimia isolat Bt dari tanah naungan di lingkungan Universitas Lampung meliputi aktivitas protease dan kemampuan penggunaan karbohidrat. Penelitian ini dilakukan dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL) 3 ulangan. Pada uji aktivitas proteolitik, data yang diperoleh dianalisis ragam ( 5%) dan diuji lanjut dengan uji Beda Nyata Jujur ( 5%). Uji kemampuan Bt dalam menggunakan karbohidrat disajikan secara deskriptif. Hasil uji proteolitik, isolat Bt PBR1 memiliki aktivitas protease tertinggi sebesar 0,0045 U/ml, isolat Bt PBG1 sebesar 0,0014 U/ml, sedangkan aktivitas protease terendah terdapat pada isolat Bt PML sebesar 0,0006 U/ml. Ketiga isolat Bt tergolong bakteri dengan aktivitas protease sedang. Hasil uji isolat Bt dalam menggunakan karbohidrat, isolat Bt PBR1, PML, dan PBG1 bersifat heterofermentatif pada media laktosa. Isolat Bt PBR1, PML, dan PBG1 bersifat homofermentatif pada media sukrosa, glukosa dan galaktosa. Pada media fruktosa, isolat Bt PBR1 bersifat homofermentatif, sedangkan isolat Bt PML dan PBG1 tidak dapat memfermentasi fruktosa. Isolat Bt PML dan PBR1 dapat menghidrolisis CMC, sedangkan PBG1 tidak dapat menghidrolisis CMC.

DAFTAR ISI

D. Toksisitas Bacillus thuringiensis (Bt) Pada Larva Insekta ... 8

E. Metabolisme Bacillus thuringiensis (Bt) ... 10

III. METODE PENELITIAN ... 15

1. Identifikasi Bacillus thuringiensis (Bt) Berdasarkan Uji Toksisitas Pada Ulat ... 17

2. Uji Proteolitik Secara Kualitatif dan Kuantitatif ... 17

2.1.Aktivitas Enzim Protease Secara Kualitatif ... 17

2.2.Aktivitas Enzim Protease Secara Kuantitatif ... 18

2.2.1. Pembuatan Starter Isolat Bacillus thuringiensis ... 18

2.2.2. Produksi Enzim Protease ... 18

2.2.3. Penentuan Aktivitas Enzim Protease ... 19

3. Uji Kemampuan Isolat Bacillus thuringiensis (Bt ) Dalam Menggunakan Karbohidrat ... 21

F. Diagram Alir ... 22

IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN ... 23

A. Identifikasi Isolat Bacillus thuringiensis (Bt) Berdasarkan Uji Toksisitas Pada Ulat ... 23

B. Uji Aktivitas Enzim Protease Secara Kualitatif ... 24

C. Uji Aktivitas Enzim Protease Secara Kuantitatif ... 25

V. SIMPULAN DAN SARAN... 31

A. Simpulan ... 31

B. Saran ... 32

DAFTAR PUSTAKA ... 33

LAMPIRAN ... 36

A. Uji Proteolitik Secara Kualitatif ... 37

B. Uji Proteolitik Secara Kuantitatif ... 37

C. Pembuatan Pereaksi Aktivitas Enzim Metode Bergmeyer dan Grassl (1983) ... 38

D. Gambar Uji Aktivitas Proteolitik ... 40

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Bacillus thuringiensis (Bt) merupakan bakteri gram-positif, berbentuk batang, dan tersebar secara luas di alam, diantaranya di dalam tanah. Bakteri ini termasuk patogen fakultatif terhadap serangga. Jika nutrien pada habitatnya sangat kaya, maka bakteri ini hanya tumbuh pada fase vegetatif, namun bila suplai makanannya menurun maka akan membentuk spora dorman yang mengandung satu atau lebih jenis kristal protein. Bakteri ini tersebar hampir pada semua penjuru dunia. Strain Bt ditemukan di Propinsi Thuringen, oleh karena itu bakteri ini disebut Bacillus thuringiensis, yaitu nama yang

diberikan pada famili bakteri yang memproduksi kristal protein yang bersifat insektisidal. Kristal ini mengandung protein yang disebut δ-endotoksin, yang bersifat lethal jika dimakan oleh serangga yang peka (Pigott, et al., 2008).

Bt merupakan salah satu alternatif pengendalian hama yang baik dan ramah lingkungan. Semula Bt dikenal sebagai agen biokontrol yang diketahui menyerang larva Lepidoptera, kemudian ditemukan bahwa bakteri ini juga menyerang Hymenoptera, Homoptera, Orthoptera, Coleoptera, dan Diptera (Glare & O’Callaghan, 1998). Sebanyak 90-95% bioinsektisida yang

Bt paling banyak digunakan untuk produksi bioinsektisida dan digunakan secara luas untuk mengendalikan larva hama serangga (Feitelson, et al., 1992).

Btmenghasilkan kristal protein yang disebut δ-endotoksin yang dikeluarkan pada saat bakteri lisis pada fase stationary. δ-endotoksin merupakan protein protoksin yang apabila dipecah oleh enzim proteolitik, maka akan menjadi toksik bagi serangga spesifik. Sifat δ-endotoksin dari Bt dipengaruhi oleh komposisi protoksin dan nilai nutritif media kultur yang bersangkutan (Mummigatti, 1990).

Menurut Swadener (1994), terdapat 34 subspesies Bt yang telah diisolasi berdasarkan gen Cry Bt pada kristal protein. Bt juga dapat dikelompokkan berdasarkan sifat metabolisme Bt yang meliputi uji serotipe, ukuran dan bentuk kristal protein, uji kimia, serta uji efikasi terhadap serangga.

Aktivitas metabolisme Bt yang meliputi proteolitik, fermentasi, dan hidrolitik dapat mendukung efektivitas Bt sebagai bioinsektisida sehingga serangga yang terinfeksi Bt lebih cepat mati. Handayani & Ekowati (2012),

menemukan 9 isolat Bacillus, namun belum diketahui kemampuan toksisitas terhadap serangga dan sifat biokimianya, terutama kemampuan proteolitik dan hidrolitik.

B. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakter biokimia isolat bakteri Bacillus thuringiensis dari tanah naungan di lingkungan Universitas Lampung yang meliputi aktivitas proteolitik dan kemampuan menggunakan karbohidrat yang meliputi kemampuan fermentasi dan hidrolitik.

C. Manfaat Penelitian

Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang : 1. Karakter biokimia isolat bakteri Bacillus thuringiensis dari tanah naungan

di lingkungan Universitas Lampung yang meliputi kemampuan proteolitik, fermentasi, dan hidrolitik.

2. Efektivitas Bacillus thuringiensis sebagai bioinsektisida yang dilihat dari aktivitas proteolitik, fermentasi, dan hidrolitik.

D. Kerangka Pemikiran

Bacillus thuringiensis (Bt) termasuk bakteri patogen fakultatif yang banyak ditemukan dalam tanah. Keberadaannya di dalam tanah mengindikasikan bahwa bakteri Bt juga berperan dalam proses dekomposisi. Bakteri Bt menghasilkan kristal protein yang bersifat lethal jika dimakan oleh serangga spesifik.

Bt dikelompokkan menjadi subspesies yang dibedakan berdasarkan gen Cry pada kristal protein dan sifat metabolisme, diantaranya sifat fisiologi dan biokimia. Karakter fisiologi Bt menujukkan adanya proses, fungsi, dan aktivitas Bt, sedangkan karakter biokimia Bt merupakan aktivitas

metabolisme yang meliputi kemampuan untuk mengubah senyawa kompleks menjadi senyawa sederhana seperti asam amino dan gula yang digunakan sebagai sumber energi untuk kelangsungan hidupnya.

Aktivitas metabolisme Bt dapat dilihat dari karakter biokimia yang dipengaruhi oleh faktor biotikdan lingkungan. Lingkungan yang mempengaruhi karakter Bt meliputi perbedaan komposisi tanah, suhu, kelembaban, dan pH tanah. Komposisi tanah tersusun dari komponen anorganik dan komponen organik. Jenis pohon yang menaungi tanah menentukan komposisi tanah yang digunakan sebagai substrat untuk

Beringin memiliki tutupan lebar, rindang, lembab, dan banyak seresah daun. Tanah yang dinaungi oleh pohon Bungur memiliki tutupan lebih kecil dari pohon Beringin dengan seresah daun lebih sedikit dan intensitas cahaya lebih banyak, sedangkan tanah yang dinaungi oleh pohon Melinjo memiliki tekstur tanah lebih kering dengan tutupan lebih kecil daripada tutupan pohon

Beringin dan Bungur. Perbedaan komposisi tanah, suhu, kelembaban, dan pH tanah dapat mempengaruhi aktivitas metabolisme Bt.

E. Hipotesis

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Tinjauan Umum Bakteri Bacillus thuringiensis (Bt)

Bacillus thuringiensis (Bt) merupakan bakteri gram-positif, berbentuk batang, dan tersebar secara luas di berbagai negara. Bakteri ini termasuk patogen fakultatif dan dapat hidup di daun tanaman konifer maupun dalam tanah. Apabila kondisi lingkungan tidak menguntungkan maka bakteri ini akan membentuk fase sporulasi. Saat sporulasi terjadi, tubuhnya akan terdiri dari protein Cry yang termasuk ke dalam protein kristal yang disebut δ

-endotoksin. Apabila serangga memakan toksin tersebut maka serangga tersebut dapat mati. Oleh karena itu, protein atau toksin Cry dapat dimanfaatkan sebagai pestisida alami (Bravo, et al., 1998).

Berbagai macam spesies Bt telah diisolasi dari serangga golongan

B. Klasifikasi Bakteri Bacillus thuringiensis (Bt)

Gambar 1. Bacillus thuringiensis

Kerajaan : Prokariota Filum : Bakteria Kelas : Bacilli Bangsa : Bacillales Keluarga : Bacillaceae Marga : Bacillus Jenis : Bacillus thuringiensis

(Holt, et al., 1994).

C. Ciri-Ciri Bacillus thuringiensis (Bt)

Bacillus thuringiensis (Bt) merupakan bakteri gram-positif yang mempunyai sel vegetatif berbentuk batang dengan ukuran panjang 3-5 m dan lebar 1,0-1,2 m serta memiliki flagella. Spora Bt berbentuk oval, letaknya

subterminal, berwarna hijau kebiruan, dan berukuran 1,0-1,3 m

(Bravo, et al., 1998). Spora mengandung asam dipikolinik dan terbentuk dengan cepat pada suhu 35°-37°C. Suhu optimum untuk pertumbuhan Bt berkisar antara 10°-50°C (Hatmanti, 2000).

mengandung toksin ( - endotoksin) yang terbentuk di dalam sel 2-3 jam setelah akhir fase eksponesial dan baru keluar dari sel pada waktu sel mengalami autolisis setelah sporulasi sempurna (Pigott, et al., 2008).

Toksisitas Bt terhadap serangga dipengaruhi oleh strain bakteri dan spesies serangga yang terinfeksi. Faktor yang mempengaruhi toksisitas Bt adalah struktur kristalnya, yang pada salah satu strain mempunyai ikatan yang lebih mudah dipecah oleh enzim yang dihasilkan serangga dan ukuran molekul protein yang menyusun kristal, serta susunan molekul asam amino dan kandungan karbohidrat dalam kristal. Selama pertumbuhan vegetatif terjadi, berbagai galur Bt menghasilkan bermacam-macam antibiotik, enzim,

metabolit, dan toksin, yang dapat merugikan organisme lain. Pengembangan bioinsektisida Bt didasarkan pada kemampuan Bt dalam menghasilkan kristal protein yang toksik terhadap serangga sasaran. Oleh karena itu, Bt tidak toksik terhadap tumbuhan, manusia ataupun organisme yang bukan sasarannya (Brotonegoro, et al., 1997).

Menurut Swadener (1994), terdapat 34 subspesies Bt yang disebut serotype atau varietas Bt telah diisolasi. Sifat δ-endotoksin dari Bt tersebut

D. Toksisitas Bacillus thuringiensis (Bt) Pada Larva Insekta

Bacillus thuringiensis (Bt) merupakan bakteri yang paling banyak digunakan untuk produksi bioinsektisida dan paling penting secara ekonomi, sehingga bioinsektisida komersial Bt digunakan secara luas untuk mengendalikan larva hama serangga (Feitelson, et al., 1992). Bt yang dikomersialkan dalam bentuk spora membentuk inklusi bodi. Inklusi bodi ini mengandung kristal protein yang dikeluarkan pada saat bakteri lisis pada masa fase stationary. Bt memiliki kristal protein yang mengandung gen tosik yang disebut dengan gen Cry. Kristal protein yang bersifat insektisida ini sebenarnya hanya protoksin yang jika larut dalam usus serangga akan berubah menjadi polipeptida yang lebih pendek sehingga bersifat toksik. Toksin yang telah aktif berinteraksi dengan sel-sel epitelium di usus tengah serangga sehingga menyebabkan terbentuknya pori-pori di sel membran saluran pencernaan serangga (Bahagiawati, 2002).

Proses toksisitas kristal protein (δ-endotoksin) sebagai bioinsektisida dimulai ketika serangga memakan kristal protein tersebut, maka kristal tersebut akan larut di dalam usus tengah serangga. Dengan bantuan enzim protease pada pencernaan serangga, maka kristal protein tersebut akan terpecah struktur kristalnya. Toksin aktif yang dihasilkan akan berinteraksi dengan reseptor pada sel-sel epitelium usus tengah larva serangga, sehingga akan membentuk pori-pori kecil berukuran 0,5 – 1,0 nm. Hal ini akan mengganggu

E. Metabolisme Bacillus thuringiensis (Bt)

Bacillus thuringiensis (Bt) sebagai makhluk hidup melakukan serangkaian reaksi metabolisme di dalam selnya. Metabolisme terdiri dari proses sintesis (anabolisme) antara lain sintesis enzim dan proses penguraian (katabolisme) diantaranya fermentasi, proteolitik, lipolitik, yang dikatalis oleh enzim (Darkuni, 2001).

Gambar 2. Metabolisme Bacillus thuringiensis (Bt)

Bt yang berasaldari habitat yang berbeda memiliki perbedaan sifat metabolisme yang dilihat dari karakter biokimianya. Hasil penelitian Jamilah (2011), menyatakan bahwa isolat Bacillus sp yang digunakan untuk degradasi sisa pakan pada budidaya udang termasuk ke dalam bakteri

Menurut penelitian Baehaki, et al. (2011), isolat Bt yang diisolasi dari tanah rawa Indralaya, Sumatera Selatan memiliki indeks proteolitik >1 dengan aktivitas protease sebesar 0,385 U/ml. Berbeda dengan hasil penelitian Susanti (2003), yang menyatakan bahwa isolat Bacillus spp dari pencernaan ayam broiler memiliki aktivitas protease sebesar 0,010 U/ml.

Enzim protease ekstraseluler adalah enzim yang digunakan untuk memecah protein yang diproduksi di dalam sel kemudian dilepaskan keluar dari sel. Aktivitas proteolitik merupakan tingkat keaktifan enzim untuk menghidrolisis protein. Semua bakteri mempunyai enzim protease di dalam sel, tetapi tidak semua mempunyai enzim protease ekstraseluler. Melalui suatu sistem enzim yang kompleks, Bt memecah protein menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana (Rao, et al., 1998).

Di alam, Bt tidak hanya bersifat aerob, tetapi jugabersifat anaerob fakultatif, artinya Bt dapat tetap hidup pada lingkungan dengan sedikit atau tanpa oksigen. Untuk mendapatkan energi pada kondisi lingkungan yang miskin oksigen, Bt akan melakukan proses fermentasi. Fermentasi merupakan proses produksi energi dalam sel dalam keadaan anaerobik (tanpa oksigen).

Karbohidrat merupakan bahan yang umum dalam fermentasi. Umumnya, proses fermentasi menghasilkan asam dan gas atau hanya asam saja (Adawyah, 2007).

Gambar 3. Proses fermentasi

tidak menghasilkan CO2. Jalur metabolisme yang digunakan pada bakteri homofermentatif adalah lintasan Embden-Meyerhof-Parnas (Fardiaz, 1989). Bakteri heterofermentatif melakukan fermentasi campuran yaitu selain menghasilkan asam laktat, juga menghasilkan etanol, asam asetat dan CO2 (Desmazeaud, 1996).

Keberadaan Bt dalam tanah mengindikasikan bahwa Bt juga berperan dalam proses dekompisisi. Salah satunya melalui proses hidrolisis selulosa yang berasal dari unsur organik seperti seresah daun di tanah. Selulosa merupakan polisakarida yang terdiri dari beberapa molekul glukosa. Selulosa akan diuraikan oleh enzim selulase menjadi selobiosa dan glukosa sehingga dapat diserap oleh Bt sebagai sumber karbon dan sumber energi (Ni’mah, 2012).

F. Tanah Naungan dan Bakteri Tanah

Tanah tersusun dari komponen anorganik yaitu mineral, air, dan udara, serta komponen organik diantaranya seresah daun. Jumlah komponen-komponen tersebut berbeda-beda pada setiap jenis dan lapisan tanah (Kurniawan, 2010). Tanah naungan merupakan tanah yang berada dibawah kanopi tumbuhan baik yang berukuran besar maupun yang berukuran kecil. Adanya kanopi

III. METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April sampai dengan Mei 2013 di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.

B. Alat dan Bahan 1. Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah laminar air flow cabinet, autoclave, tabung reaksi dan sumbat, cawan petri, neraca analitik,

inkubator, water bath, kompor listrik, vortex mixer, pipet tetes, centrifuge, mikropipet, mikrotips, jarum ose, mikroskop, alumunium foil,

erlenmeyer, batang pengaduk, botol aquadest, tabung Durham, spektrofotometer, kuvet, shaker incubator, bunsen, dan gelas ukur.

2. Bahan

folin Ciocalteau, NaOH, HCl, congo red, alkohol 70% (v/v), aquades, garam fisiologis, ulat jeruk (Papilio memnon), isolat koleksi Bt dari tanah naungan pohon Akasia, Bungur, Beringin, Kerai Payung, Melinjo, dan Mahoni.

C. Metode Penelitian

Uji biokimia isolat Bacillus thuringiensis yang meliputi aktivitas proteolitik dan kemampuan menggunakan karbohidrat dilakukan dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) 3 ulangan dan diuji lanjut dengan BNJ (Beda Nyata Jujur) α = 5%. Uji proteolitik dilakukan secara kualitatif dengan melihat adanya zona bening di sekitar koloni dan kuantitatif dengan

menggunakan metode Bergmeyer dan Grassl (1983) yang diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 578 nm. Uji kemampuan menggunakan karbohidrat meliputi fermentasi laktosa, sukrosa, glukosa, fruktosa, galaktosa dilakukan mengamati adanya gelembung dalam tabung Durham dan terbentuknya asam yang ditandai dengan perubahan warna media menjadi kuning, dan uji hidrolisis CMC (Carboxy Methyl Cellulose) dilakukan dengan melihat adanya zona bening di sekitar koloni.

D. Analisis Data

E. Prosedur Kerja

1. Identifikasi Bacillus thuringiensis (Bt) Berdasarkan Uji Toksisitas Pada Ulat

Gen Cry bakteri Bt dapat bersifat toksik pada Lepidoptera, Hymenoptera, Homoptera, Orthoptera, Coleoptera, dan Diptera (Glare, et al., 1998). Pada uji toksisitas ini digunakan 9 isolat koleksi Bt dari laboratorium Mikrobiologi Universitas Lampung dan larva Papilio memnon. Larva Papilio memnon tersebut dimasukkan ke dalam wadah dan diberi pakan berupa daun yang sudah diolesi isolat koleksi Bt, kemudian wadah ditutup dan diberi lubang udara secukupnya. Uji toksisitas ini dilakukan selama 72 jam. Ulat yang terinfeksi Bt mengalami kematian dikarenakan δ -endotoksin Bt menyerang sistem pencernaan serangga (ulat) dan mengganggu keseimbangan osmotik selnya.

2. Uji Proteolitik Secara Kualitatif dan Kuantitatif 2.1. Aktivitas Enzim Protease Secara Kualitatif

Uji proteolitik secara kualitatif isolat Bt dilakukan dengan

dan luas koloni bakteri. Perhitungan indeks proteolitik adalah perbandingan luas areal bening dengan luas koloni bakteri (Baehaki, et al., 2011).

2.2. Aktivitas Enzim Protease Secara Kuantitatif

2.2.1. Pembuatan Starter Isolat Bacillus thuringiensis

Isolat Bt yang sudah diremajakan pada media Nutrient Agar miring diambil 3 ose dan diinokulasikan ke dalam erlenmeyer 250 ml yang berisi 50 ml media Nutrient Broth + Skim Milk 2% (w/v), kemudian diinkubasi selama 24 jam di atas shaker incubator dengan kecepatan 120 rpm.

2.2.2. Produksi Enzim Protease

2.2.3. Penentuan Aktivitas Enzim Protease

Aktivitas protease diukur dengan metode Bergmeyer dan Grassl (1983), dengan menggunakan substrat Kasein

Hammerstein 2% (w/v). Prosedur pengujian aktivitas protease adalah mereaksikan 0,2 ml enzim dengan 1 ml substrat Kasein Hammerstein dan 1 ml bufer borat. Campuran reaksi

diinkubasi pada suhu 37 0C selama 10 menit, lalu ditambahkan 0,1 M TCA (Trichloroacetic Acid). Larutan diinkubasi

kembali pada suhu 37 0C selama 10 menit, dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm 10 menit. Dari

Tabel 1. Metode Pengujian Aktivitas Enzim Protease Substrat Kasein (20 mmol, pH 8) Enzim dalam CaCl2 (2mM)

Sentrifugasi 4000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 0C Filtrat

Baca absorbansinya pada panjang gelombang 578 nm

Aktivitas ptotease dihitung dalam satuan PU (Protease Unit) per ml ekstrak enzim (Djajasukma, 1993).

PU =

X

Keterangan :

PU : Unit Aktivitas Protease (Unit/ml) Asb : Nilai Absorbansi Sampel

3. Uji Kemampuan Isolat Bacillus thuringiensis (Bt ) Dalam Menggunakan Karbohidrat

Uji kemampuan isolat Bt dalam menggunakan karbohidrat meliputi uji fermentasi dan uji hidrolisis CMC (Carboxy Methyl Cellulose). Uji fermentasi dilakukan dengan menambahkan 1 ml suspensi ke dalam 9 ml media Lactose Broth, Sucrose Broth,Glucose Broth, Fructose Broth, dan Galactose Broth + indikator Phenol Red dalam tabung reaksi berisi tabung Durham. Uji degradasi CMC dilakukan dengan point plate pada media NB + 1% (w/v) CMC. Pengulangan dilakukan sebanyak 3 kali. Kemudian isolat Bt tersebut diinkubasi selama 24 jam. Aktivitas

F. Diagram Alir

Identifikasi Bacillus thuringiensis Berdasarkan Uji Toksisitas Pada Ulat

Uji Proteolitik

Uji Aktivitas Protease (Metode Bergmeyer dan Grassl)

Uji Fermentasi Gula &

Hidrolisis CMC

Produksi Enzim Protease

Penentuan Aktivitas Enzim Protease Dengan spektrofotometer pada

= 578 nm

Analisis Data

Analisis Aktivitas Isolat Bt

V. SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa :

1. Isolat Bt PBR1 memiliki aktivitas protease paling tinggi yaitu sebesar 0,0045 U/ml, isolat Bt PBG1 sebesar 0,0014 U/ml, sedangkan aktivitas protease terendah terdapat pada isolat Bt PML yaitu sebesar 0,0006 U/ml. Ketiga isolat Bt tergolong sebagai bakteri dengan aktivitas protease sedang.

2. Terdapat perbedaan karakteristik biokimia isolat Bt PBR1, PML, dan PBG1 dalam menggunakan karbohidrat. Pada media laktosa, isolat Bt PBR1, PML, dan PBG1 bersifat heterofermentatif, pada media sukrosa, glukosa dan galaktosa, isolat Bt PBR1, PML, dan PBG1 bersifat

homofermentatif, dan pada media fruktosa, isolat Bt PBR1 bersifat homofermentatif, sedangkan isolat Bt PML dan PBG1 tidak dapat memfermentasi fruktosa.

B. Saran

1. Berdasarkan hasil uji proteolitik, fermentasi, dan hidrolitik, isolat bakteri Bt PBG1, PML, dan PBR1 dari tanah naungan di lingkungan Universitas Lampung dapat dikembangkan sebagai kandidat bioinsektisida,

khususnya pada larva Papilio memnon.

2. Perlu dilakukan uji efektivitas senyawa toksin isolat bakteri Bt PBG1, PML, dan PBR1 terhadap larva serangga lain.

DAFTAR PUSTAKA

Adawyah, R. 2007. Pengolahan dan Pengawetan Ikan. Bumi Aksara. Jakarta. Baehaki, A., Rinti, dan A. Budiman. 2011. Isolasi Dan Karakterisasi Protease Dari

Bakteri Tanah Rawa Indralaya, Sumatera Selatan. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan, Vol. XXII (1) : 10-16.

Bahagiawati. 2002. Penggunaan Bacillus thuringiensis Sebagai Bioinsektisida. BuletinAgroBio, 5 (1) : 21-28.

Barchia, F. Aini, dan Prawito. 2007. Bahan Organik dan Respirasi di Bawah Beberapa Tegakkan pada Das Musi Bagian Hulu. Jurnal Akta Agrosia Edisi Khusus No. 2 : 172-175.

Belitz, H.D. and Grosch W. 2009. Food Chemistry. Springer Verlag. Germany. Bergmeyer, H. U. and M. Grassl. 1983. Methods of Enzymatic Analysis Vol 2.

Verlag Chemie. Weinheim.

Bravo, A. S., S. Sarabia, L. Lopez, H. Ontiveros, C. Abarca, A. Otrhz, L. Lina, F. J. Villalobos, G. Pena, M. E. Nunez-Valdes, M. Soberon and R. Quintero. 1998. Characterization Of Cry Genes In Mexican Bacillus thuringiensis Strain Collection.Appl.Environ. Microbiol. 64 : 4965-4972.

Brotonegoro, S., Sutrisno, B. Soegiarto, B. Listanto, Dan B. Santoso. 1997. Perbaikan Sifat Beberapa Isolat Bacillus thuringiensis Untuk Mendukung Pemanfaatannya Sebagai Insektisida Mikroba. Laporan Hasil Penelitian APBN. Balai Penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan Bogor.

Brown, A. E. 2007. Laboratory Manual In General Microbiologi. Mc Graw Hill. New York.

Budiyanto. 2010. Faktor Lingkungan Yang Mempengaruhi Mikroba. http://zaifbio.wordpress.com/2010/11/08/faktor-lingkungan-yang-mempengaruhi-mikroba/. Diakses tanggal 27 Agustus 2013.

Djajasukma. 1993. Isolasi Enzim Protease Dari Mucor javanicus.Pros. Seminar Hasil Litbang SDH.

Fardiaz, S. 1989. Mikrobiologi Pangan. Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi. Fateta IPB. Bogor.

Feitelson, J.S., J. Payne, and L. Kim. 1992. Bacillus thuringiensis: Insects and Beyond. Biotechnology. 10 : 271 – 275.

Gill, S.S., Cowles A.E., and Pietrantonio P.V. 1992. The Mode Of Action Of Bacillus thuringiensis Endotoxins. Annu Rev Entomol 37: 615-636.

Glare, R.T. and O’Callaghan M. 1998. Environmental and health impacts of Bacillus thuringiensis israelensis. Report for the Ministry of Health. Biocontrol & Biodiversity, Grasslands Division, AgResearch,Lincoln. Handayani, K. dan C. N. Ekowati. 2012. Isolasi Bakteri Bacillus thuringiensis

Dari Beberapa Tanah Naungan di Universitas Lampung. Laporan Hasil Penelitian. Universitas Lampung.

Hasyanah. 2011. Fruktosa, Glukosa, Galaktosa. http://id.scribd.com/doc/ 76147142/FRUKTOSA-Glukosa-Galaktosa. Diakses 10 Juni 2013. Hatmanti, A. 2000. Pengenalan Bacillus spp. Oseana, Volume XXV, Nomor 1,

2000. 31-41. ISSN 0216- 1877.

Holt, J. G., N. R. Krieg, P. H. A. Sneath, J. T. Staley, and S. T. Williams. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Becteriology 9th Edition. Williams & Walkins. USA.

Jamilah, I. T. 2011. Penapisan Bacillus Dan Karakterisasi Protease Dan Amilase Ekstraseluler Yang Dihasilkan Untuk Degradasi Sisa Pakan Pada Budi Daya Udang. Disertasi. Institut Pertanian Bogor.

Kurniawan, I. 2010. Komposisi Tanah. Artikel Kimia.

http://www.scribd.com/doc/84943058/Komposisi-Tanah. Diakses tanggal 10 November 2013.

Mummigatti SG, Raghunathan. 1990. Influence of Media Composition on the Production of Delta- Endotoxin by Bacillus thuringiensis. J. Invertebr. Pathol. 55 : 147 – 151.

Panjaitan. 2012. Fermentasi Karbohidrat.

http://bethpanjaitan.blogspot.com/2012/11/fermentasi-karbohidrat.html. Diakses tanggal 27 Agustus 2013.

Perez, G. M. 2010. Positive Effects Of Native Shrubs On Three Specially

Protected Cacti Species In Durango, México. Journal Plant Species Biology (2012) 27, 53–58.

Pigott, C.R., King M.S., and Ellar D.J. 2008. Investigating The Properties Of Bacillus thuringiensis Cry Proteins With Novel Loop Replacements Created Using Combinatorial Molecular Biology. Appl Environ Microbiol 74: 3497-3511.

Putri. 2012. Skrining Dan Uji Aktivitas Enzim Protease Bakteri Dari Limbah Rumah Pemotongan Hewan. Skripsi. Universitas Airlangga.

Rao, M.M, A.M. Tanksale, M.S. Gatge, and V.V. Desphande. 1998. Molecular and Biotechnological Aspects Of Microbial Proteases. Microbiol. And Mol. Biol. Rev. 62(3):597-635.

Said I.M. dan Ningrum E.M. 2009. Karakterisasi dan purifikasi protease bakteri Bacillus sp. dan jamur Aspergillus sp. serta aplikasinya sebagai soaking agent pada proses penyamakan kulit kambing [abstrak]. Hibah Penelitian Kerjasama (Hibah Pekerti) : LP2M, UNHAS. Makasar.

Susanti, A. 2003. Aktivitas Proteolitik pH Rendah Isolat Bakteri Dari Pencernaan Ayam Broiler. Skripsi. Universitas Lampung.

Swadener, C. 1994. Bacillus thuringiensis. Journal of Pesticides Reform vol. 14. No.3 : 13 – 20. Northwest Coalition for Alternative to Pesticides. Canada.

Tampubulon, D. Y., Y. Pangestiningsih, F. Zahara, dan F. Manik. 2013. Uji Patogenisitas Bacillus thuringiensis Dan Metarhizium anisopliae Terhadap Mortalitas Spodoptera litura fabr (Lepidoptera : Noctuidae) di

Laboratorium. Jurnal Online Agroekoteknologi Vol 1, No. 3.

 Uji Indeks Proteolitik Berdasarkan uji lanjut BNJ (α = 5 %)

B. Uji Proteolitik Secara Kuantitatif

 Analisis Ragam Uji Aktivitas Protease

Perlakuan PBG1

1 0,0018 0,0013 0,0049 0,00000324 0,00000169 0,00002401 2 0,002 0,0004 0,0049 0,000004 0,00000016 0,00002401 3 0,0004 0,0001 0,0038 0,00000016 0,00000001 0,00001444 RATA2 0,0014 0,0006 0,00453 0,00000247 0,00000062 0,00002082

Perlakuan PBG1 (X1) PML (X2) PBR1 (X3)

C. Pembuatan Pereaksi Aktivitas Enzim Metode Bergmeyer dan Grassl (1983)

Bahan-bahan untuk pereaksi yang digunakan harus bebas dari enzim protease dan inhibitornya.

1. Natrium hidroksida (1mol/L)

Campurkan 50mL larutan A dengan 4,9 mL larutan B dan encerkan sampai 200 mL

3. Asam klorida

Encerkan 9,8 mL HCl pekat (minimal 32%) menjadi 72 mL 4. Larutan buffer-kasein (2% w/v)

Suspensikan 1 g kasein dengan kira-kira 5 mL H2O di dalam gelas piala 100 mL. Tambahkan NaOH (1) dan 30 mL aquades serta aduk

menggunakan pengaduk magnet sampai semua kasein larut. Tambahkan 5 mL buffer borat (2) dan tepatkan pHnya menjadi 8 dengan

menambahkan HCl (3). Sambil menambahkan HCl larutan harus selalu diaduk agar tidak terjadi endapan kasein. Tepatkan volumenya menjadi 50 mL.

5. Asam klorida (0.05 mol/L)

Larutkan 1 mL HCl (3) dengan 19 mL H2O 6. Larutan tirosin standar (5 mmol/L)

Larutkan 45,3 mg tirosin di dalam 50 mL H2O 7. Kalsium klorida (12 mmol/L)

Larutkan 66,5964 mg CaCl2 di dalam 50 mL H2O 8. Asam trikloroasetat (0,1 mol/L)

Larutkan 16,3 g TCA di dalam 1000 mL H2O 9. Kalsium klorida (2 mmol/L)

Larutkan 42,397 g Na2CO3 di dalam 1 L aquades 11.Folin Ciocalteau

Larutkan 30 mL folin komersil dengan 60 mL H2O 12.Larutan enzim

Tambahkan 0,2 mL larutan (7) terhadap 1 mL enzim yang akan dianalisis. Stabilitas pereaksi

a. Larutan buffer-kasein harus disiapkan tiap hari

b. Buffer dan tirosin standar harus disimpan pada suhu 4oC dan stabil selama dua minggu

c. Pereaksi-pereaksi lain dapat disimpan pada suhu kamar dan stabil untuk waktu yang lebih lama.

D. Gambar Hasil Uji Aktivitas Proteolitik

Gambar 2. Hasil uji proteolitik Isolat Bt PBR1 pada media Skim Milk Agar

Gambar 4. Hasil uji fermentasi fruktosa (- = tidak terjadi fermentasi ; +A = terjadi fermentasi menghasilkan asam)